تأتي إلى "جانب الضوء": "في فيفو" الرصد الزائفة الزّنجاريّة بيوفيلم الالتهابات في "الجروح المزمنة" في "نموذج مورين أصلع السكري"

Summary

هنا يصف لنا نموذجا مورين السكري رواية استخدام الفئران أصلع للرصد في الوقت الحقيقي، وغير الغازية، من عدوى الجرح بيوفيلم من طرحه الزائفة الزّنجاريّة. هذا الأسلوب يمكن تكييفها لتقييم العدوى الأخرى أنواع البكتيريا والكائنات الدقيقة المحورة وراثيا، بما في ذلك الأغشية الحيوية المتعددة الأنواع، واختبار فعالية استراتيجيات أنتيبيوفيلم.

Abstract

ويعتقد وجود البكتيريا كمنظم الأغشية الحيوية في الجروح المزمنة، خصوصا في مرضى السكري، للحيلولة دون التئام الجروح والقرار. قد استخدمت نماذج الجروح المزمنة الماوس فهم التفاعلات الأساسية بين الكائنات الحية الدقيقة والبلد المضيف. النماذج التي وضعت حتى الآن تعتمد على استخدام الحيوانات الشعر وجمع المحطة الطرفية من أنسجة الجرح لتحديد البكتيريا قادرة على البقاء. في حين قد اكتسبت فكرة كبيرة مع هذه النماذج، يتطلب هذا الإجراء التجريبي عدد كبير من الحيوانات وأخذ العينات مضيعة للوقت. وقد وضعنا نموذجا رواية مورين الذي يشتمل على العديد من الابتكارات الأمثل لتقييم التقدم بيوفيلم في الجروح المزمنة:) فإنه يستخدم الفئران أصلع، مما يلغي الحاجة لإزالة الشعر؛ ب) ينطبق قبل تشكيل الأغشية الحيوية للجروح تسمح بتقييم فوري لاستمرار وتأثير هذه الجاليات على المضيف؛ ج) ترصد تطور بيوفيلم بالتحديد الكمي لإنتاج الضوء من سلالة طرحه المهندسة وراثيا من الزائفة الزّنجاريّة، يسمح للرصد في الوقت الحقيقي للعدوى وبالتالي تقليل عدد الحيوانات اللازمة للدراسة. في هذا النموذج، أنتجت في الجزء الخلفي الفئران أصلع السكري الناجم عن STZ جرح عمق كامل واحد وتلقيح مع الأغشية الحيوية لسلالة P. الزّنجاريّة طرحه 41 كسين. الضوء الناتج من الجروح تسجل يوميا في في فيفو نظام التصوير، بما يسمح للتصور بيوفيلم السريع في فيفو و في الموقع وتوطين البكتيريا بيوفيلم داخل الجروح. يعد هذا الأسلوب رواية مرنة كما يمكن استخدامها لدراسة الكائنات المجهرية الأخرى، بما في ذلك الأنواع المحورة وراثيا، والأنواع المتعددة من الأغشية الحيوية، وقد تكون ذات قيمة خاصة في اختبار استراتيجيات مكافحة بيوفيلم بما في ذلك مضادات الميكروبات الضمادات الانسداد.

Introduction

الأغشية الحيوية هي مجتمعات معقدة من الكائنات الحية الدقيقة جزءا لا يتجزأ من مصفوفة مواد البوليمرية التي تم إبرازها عاملاً مساهما للقرار الفقراء من الجروح المزمنة¹. دراسة هؤلاء السكان الميكروبية عالية التنظيم، واستمرار أهمية خاصة لمرضى السكري حيث يؤدي ضعف الدورة الدموية على أطرافه وتغيير الآليات الحسية الطرفية للآفات التي لم يتم كشفها². في الولايات المتحدة، ويقدر أن 15% مرضى السكري بوضع قرحة واحدة على الأقل أثناء حياتهم. وهذا يترجم إلى نفقات اقتصادية بحوالي 28 بیلیون دولار في المعاملة^3،4، ناهيك عن العبء العاطفي والاجتماعي إيمينسورابل. فهم العوامل التي تسمح للمجتمعات الميكروبية على المثابرة في قاع الجرح والأثر الذي تحدثه هذه الأغشية الحيوية في أحداث الشفاء لا بد من محرك تحسين الرعاية للمرضى المتضررين ودفع تطوير نهج معاملة جديدة. ولذلك، إنشاء نماذج قابل للنقل واستنساخه في فيفو لاستكشاف التفاعلات البكتيرية-المضيف أمر بالغ الأهمية.

-تم تطوير نماذج مورين بنجاح لدراسة تأثير الأغشية الحيوية في الجروح المزمنة. هذه النماذج، ومع ذلك، غالباً ما الاستفادة من أنواع الشعر وتقييم إزالة بيوفيلم بتهم لوحة للخلايا البكتيرية قابلة للاستمرار من الأنسجة قصت من الحيوانات التضحية، يجعلها تستغرق وقتاً طويلاً ومكلفة.

كان أول من اقترح بديلاً بيوفوتونيك لأخذ عينات من الحيوانات في تقييم الإصابة نقطة نهاية كونتاج وآخرون. (1995) ^{5 ،} الذين وضعت طريقة لالتقاط التﻷلؤ من طرحه مؤثرا typhimurium السالمونيلا لقياس مدى فعالية العلاج بالمضادات الحيوية. اتبعت الدراسات الأخرى الاستفادة من البكتيريا التي تنبعث منها الإضاءة الحيوية. على سبيل المثال، روشيتا وآخرون. (2001) ⁶ التحقق من صحة نموذج عدوى لدراسة الإشريكيّة القولونية الفخذ العدوى في الفئران عن طريق قياس التﻷلؤ باستخدام جهاز اقتران مكثفة وفي وقت لاحق، كادوروجامووا وآخرون. (2003) ⁷ استغل فوتون انبعاث خصائص عبئا هندسيا ل المكوّرات العنقودية الذهبية للتحقيق في مدى فعالية المضادات الحيوية عدة في نموذج جرح قسطرة في الفئران.

ويعرض الأسلوب يتميز هنا بروتوكولا مباشرة للحث على مرض السكري في الفئران أصلع وإنتاج وتطعيم الجروح مع الأغشية الحيوية طرحه قبل المشكلة من P. الزّنجاريّة، والقيام بعمليات رصد بيوفوتونيك العدوى باستخدام في فيفو نظام التصوير. ويوفر المباشر، السريع، في عين المكان، والعملية غير الغازية والكمي لتقييم الأغشية الحيوية في الجروح المزمنة وعلاوة على ذلك، يسمح للتحليل إضافية مثل التصوير المجهري لشفاء الجروح، جمع الدم المتقطع سيتوكين القياسات، وجمع الأنسجة الطرفية لعلم الأنسجة.

Protocol

التجارب على الحيوانات وقد أقر برعاية الحيوان المؤسسية واللجنة استخدام من جامعة ولاية ميشيغان.

1-إعداد الضمادات الانسداد والفواصل سيليكون

1. قطع الملابس الانسداد شفافة لجعل مربعات تقريبا 1 سم × 1 سم مع المقص.
2. قطع 10 مم دوائر على ورقة سميكة سيليكون 0.5 مم استخدام 10 ملم خزعة لكمه. مركز خزعة 5 مم لكمه في منتصف الدائرة 10 ملم واضغط بشدة لخلق ثقب للنموذج " دونات "-مثل القرص التي سيتم استخدامها كجبيرة.

2-"الحيوانات التجريبية"

1. استخدام القديم الأسبوع 8 (22-26 ز) ذكور الفئران سخ-1 من مربي تجاري. تبقى الفئران في الظروف القياسية 21 درجة مئوية ودورة ضوء الظلام ح 12 مع حرية الوصول إلى الغذاء والمياه-
2. للحث على مرض السكري، حقن الفئران إينترابيريتونيالي مع سولوتيوناند بالستريبتوزوتوسين (STZ) 13 ملغ/مل 25% جلوكوز (250 ميليلتر الواحد/الماوس) في 5 أيام متتالية.
   1. جعل الحل STZ بتمييع ميكروغرام 65 من STZ في 5 ميليلتر من 100 ملم حمض الستريك، الأس الهيدروجيني 4.5.
   2. ضبط حجم حقن لكل الماوس إلى كتلة نهائية من 65 ملغ STZ لكل 1 كغم من وزن الجسم الماوس. حقن الفئران التحكم مع 100 ملم حمض الستريك الحل الأس الهيدروجيني 4.5 في الأيام نفسها.
3. تأكيد ارتفاع السكر في الدم عن طريق الدم الجلوكوز الرصد مع السكر مدة 14 يوما بعد آخر حقن STZ. الفئران السكري قد يكون التبول وحتى تلك الأسرة قد تحتاج إلى تغيير أكثر تواترا لإزالة الرطوبة واوزانها وينبغي رصد 3 مرات في أسبوع.

3. الأغشية الحيوية

1. إعداد بيوفيلم
   1. تنمو مستعمرة الأغشية الحيوية ⁸ لتطعيم الجروح. يومين قبل بدء الجراحة بثقافة بين عشية وضحاها من طرحه المحتضنة كسين P. الزّنجاريّة 41 في مرق الصويا تريبتيك (TSB) عند 37 درجة مئوية وتهز 200 لفة في الدقيقة وتعقيم الفلاتر غشاء البولي مع حجم المسام ميكرومتر 0.2 بالتعرض للأشعة فوق البنفسجية الخفيفة في غطاء سلامة بيولوجية لمدة 15 دقيقة كل جانب.
   2. يوم واحد قبل الجراحة الطرد المركزي الثقافة بين عشية وضحاها في 20,000 س ز 2 دقيقة ويغسل 3 مرات مع 1 مل دولبيلككو ' s الفوسفات مخزنة المالحة (دببس) من بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
   3. تمييع تعليق في دببس إلى امتصاص 0.05 في 600 نانومتر.
   4. ماصة 10 ميليلتر ثقافة المخفف في كل غشاء يستريح على طبق أجار (TSA) تريبتيك فول الصويا. وبعد السماح لتجف، احتضان الأغشية في 35 درجة مئوية ح 72 نمو الأغشية الحيوية نقل إلى الطازجة حساب السياحة الفرعي لوحات كل حاء 24
2. المنحنى المعياري
   1. قبل البدء التجربة تجعل من منحنى المعياري لربط حساب الإضاءة الحيوية والبكتيرية.
   2. إعداد الأغشية الحيوية كما هو موضح في 3-1-
   3. جعل تخفيف المسلسل للأغشية الحيوية بدءاً من ½ إلى 1/24 بخلط بيوفيلم مع دببس وفورتيكسينج حتى تنتج حلاً بصريا متجانسة. ماصة 200µL الحلول المخففة في لوحة 96-بئر أسود والصورة مع في فيفو نظام التصوير-
   4. تنتشر تخفيف لوحة على لوحات حساب السياحة الفرعي واحتضان في 35 درجة مئوية ل 24 h.
   5. عد مستعمرة تشكيل وحدات (زيمبابوي) على لوحات وإنشاء منحنى قياسي لربط حساب الإضاءة الحيوية والبكتيرية.

4. جرح جراحة

1. حمل التخدير العام باستخدام إيسوفلوراني في 95% oxygen/5% CO ₂ (لمنع الموت من ketoacidosis) بمعدل تدفق من 1 لتر في الدقيقة والحفاظ على التخدير باستخدام إيسوفلوراني 1-3%. الحفاظ على الحيوانات على حصائر الحرارة أثناء الجراحة.
2. ضمان ردود الفعل العميقة دواسة الماوس تقمع معسر في القدم مع ملاقط ووضع الماوس في المكان المعرضة.
3. إدارة ميلوكسيكام (0.2 مغ/كغ) عن طريق الحقن الجلدية الفرعية (30 ميكروليتر) لإدارة الألم.
4. يمسح الجلد من الخلف مع 10% بوفيدون ثلاث مرات وجهاز pad الايزوبروبانول.
5. استخدام لكمه خزعة عقيمة 4 مم للمخطط التفصيلي نمط دائري واحد للجرح على جانب واحد من الماوس ' s خط الوسط على مستوى الكتفين. المخطط التفصيلي النمط مع علامة دائمة-
6. استخدام ملقط مسنن لرفع الجلد في وسط المقص المخطط التفصيلي وقزحية العين لإنشاء كامل-سمك جرح الذي يمتد عبر النسيج تحت الجلد بما في ذلك كارنوسوس بانيكولوس والمكوس قطعة دائرية من الأنسجة.
7. تطبيق غراء لاصق طبي جلد لماء على جلد الفئران ووضع جبيرة سيليكون تطبيق ضغط خفيف. تغطية الجرح مع خلع ملابس انسداد شفافة. بعد الجراحة، فردياً قفص الحيوانات-

5. إدارة ما بعد الجراحة

1. إدارة ميلوكسيكام (0.2 مغ/كغ) مرة واحدة يوميا عن طريق الحقن الجلدية الفرعية لتخفيف الألم بعد العمليات الجراحية للأيام القادمة 2-
2. مراقبة الحيوانات يوميا لمظاهر الألم وفقدان الوزن. السكري الحيوانات بحاجة إلى حقن الأنسولين عند فقد 15% أو أكثر من وزن الجسم.

6. إعداد بيوفيلم العدوى والإصابة

1. تلقيح الفئران 48 ساعة بعد الجراحة كما هو موضح في الخطوات التالية.
وضعه في أنبوب ميكروسينتريفوجي
2. ح 72 كشط الأغشية الحيوية من الأغشية استخدام ملعقة عقيمة، وتمييع 1:2 في دببس. مزيج من بيبيتينج بإيجاز صعودا وهبوطاً.
3. لوحة انتشار العدوى على لوحات حساب السياحة الفرعي لحساب مجموع زيمبابوي. للتأكد من أن التهم الموجهة إليه دقيقة، كسر العدوى بيوفيلم كذلك بسلسلة من خطوتين فورتيكسينج 1 دقيقة أولمبية صيفية بخطوة سونيكيشن 2 دقيقة في 40 كيلو هرتز في منظف الموجات فوق الصوتية-
4. إزالة تغطي تضميد الجرح وسيليكون جبر وتتخذ صورة مجهرية من الجرح مجهر مع الكاميرا المرفقة باستخدام مسطرة للرجوع إليها.
5. قص النصائح من 200 ميليلتر ماصة نصائح و "الماصة؛" 10 ميليلتر من العدوى بيوفيلم على كل الجرح.
6. صورة الماوس استخدام في فيفو التصوير النظام باستخدام الإعدادات التلقائية: التعرض مرة ثانية 5-300، مع binning المتوسطة، و 1/إيقاف وتصفية مفتوحة، ومجال الرؤية ج (12.9 سم x 12.9 سم).
7. تغطية الجرح بخلع الملابس الطازجة.

7. جرح قياس وتصوير

1. تقييم علامات سريرية للحيوانات اليومي ⁹.
2. توفير الغذاء والمياه وتغيير الأقفاص حسب الحاجة.
3. الاختيار سلامة الضمادات يوميا. عند خلع الملابس، يمكن أن يقاس إلا الإضاءة الحيوية بسبب انسداد الجرح. في يوم 8، تتم إزالة الضمادات ولا يحل محل القياس مما يسمح لإغلاق الجرح.
4. وزن الحيوانات كل يوم-
5. لجميع الأيام، مكان الفئران منفردة في تشكيل غرفة عزلة مزودة بفلتر HEPA والصورة باستخدام في فيفو نظام التصوير يوميا أو كل يوم حتى قيم استضاءة تقل مستوى الخلفية.
6. بعد يوم 8، الحث على التخدير العام واتخاذ ميكروجرافس للجرح مع مجهر مع الكاميرا المرفقة باستخدام مسطرة للرجوع إليها في كل يوم حتى تلتئم الجراح.

8. التحليل النسيجي

1. يوثانيزي الفئران مع تدفق 2 لتر في الدقيقة من CO ₂ في القتل رحيم الدائرة بعد التﻷلؤ يقع أسفل مستويات الخلفية وتلتئم الجراح تماما. تأكيد وفاة بخلع عنق الرحم كطريقة ثانية للقتل الرحيم.
2. استخدام مقص آيريس لختان الإناث على نطاق واسع، وكامل حول وتحت منطقة الجرح (حوالي 1 سم في القطر) إنشاء والحفاظ على الأنسجة في بارافورمالدهيد 4% للتحليل النسيجي.
3. أخرى تحليل: الكشف عن سيتوكين
   1. جمع الدم الرجعية-أوربيتالي من الحيوانات تحت التخدير استخدام أنبوب زجاج شعرية وتحويلها إلى أنابيب المعالجة يدتا.
   2. الطرد المركزي الدم 2,000 لفة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية وتجميد البلازما للكشف عن سيتوكين.

النتائج

في وضع هذا النموذج الجديد، لاحظنا العديد من المزايا في استخدام أصلع سخ-1 على الفئران C57BL/6J، التي كنا قد استخدمت في الماضي. الحيوانات التي تخضع للحقن STZ عادة تجربة فقدان الوزن تدريجيا مع بداية مرض السكر؛ ومع ذلك، في الجرح الشفاء التجارب سابقا أجرتها مختبراتنا استنساخ النمو?...

Discussion

هنا يصف لنا نموذج ماوس جديد لدراسة الأغشية الحيوية في الجروح المزمنة السكري يحتوي على العديد من المزايا لإنشاء نموذج استنساخه، والترجمة، ومرنة.

الابتكار الأول هو استخدام الفئران أصلع. -تم تطوير نماذج الماوس الأخرى لدراسة السكري الجرح المزمن شفاء^10،

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Opsite	Smith & Nephew	Model 66000041	Smith & Nephew Flexfix Opsite Transparent Adhesive Film Roll 4" x 11yards
SKH-1 mice Crl:SKH1-Hrhr	Charles River Breeding Laboratories	SKH1	Hairless mice, 8 weeks old
Streptozotocin (STZ)	Sigma Aldrich	S0130-1G	Streptozocin powder, 1g
AccuChek glucometer	Accu-Chek Roche	Art No. 05046025001	ACCU-CHEK CompactPlus Diabetes Monitoring Care Kit
Pseudomonas aeruginosa Xen 41	Perkin Elmer	119229	Bioluminescent Pseudomonas aeruginosa
Polycarbonate membrane filters	Sigma Aldrich	P9199	Millipore polycarbonate membrane filters with 0.2 μm pore size
Dulbelcco phosphate buffer saline (DPBS)	Sigma Aldrich	D8537	PBS
Tryptic soy agar	Sigma Aldrich	22091	Culture agar
Meloxicam	Henry Schein Animal Health	49755	Eloxiject (Meloxicam) 5mg/mL, solution for injection
10% povidone-iodine (Betadine)	Purdue Products LP	301879-OA	Swabstick, Betadine Solution. Antiseptic. Individ. Wrapped, 200/case
4% paraformaldehyde	Fisher Scientific	AAJ61899AK	Alfa Aesar Paraformaldehyde, 4% in PBS
Capillary glass tube	Fisher Scientific	22-362-566	Heparinized Micro-Hematocrit Capillary Tubes
Silicone to make splints	Invitrogen Life Technologies Corp	P-18178	Press-to-Seal Silicone Sheet, 13cm x 18cm, 0.5mm thick, set of 5 sheets
Tryptic soy broth	Sigma Aldrich	22092	Culture broth
IVIS Spectrum	Perkin Elmer	124262	In vivo imaging system
IVIS Spectrum Isolation chamber	Perkin Elmer	123997	XIC-3 animal isolation chamber
HEPA filter	Teleflex	28022	Gibeck ISO-Gard HEPA Light number 28022
Biopsy punches	VWR International Inc	21909-142	Disposable Biopsy Punch, 5mm, Sterile, pack of 50.
Biopsy punches	VWR International Inc	21909-140	Disposable Biopsy Punch, 4mm, Sterile, pack of 50.
Glucose	J.T.Baker	1916-01	Dextrose, Anhydrous, Powder
Citric acid	Sigma Aldrich	C2404-100G	Citric Acid
Mastisol	Eloquest Healthcare	HRI 0496-0523-48	Mastisol Medical Liquid Adhesive 2/3 mL vial, box of 48
Corning 96-well black plates	Fisher Scientific	07-200-567	96-well clear bottom black polysterene microplates
25 gauge 5/8 inch needle	BD	305122	Regular bevel needle
Bransonic M Ultrasonic Cleaning Bath	Branson Ultrasonics	N/A	Ultrasonic Cleaner