光側に来る: In Vivo糖尿病ヘアレス マウス モデルにおける慢性創傷における緑膿菌バイオ フィルム感染症の監視

要約

ここで我々 はリアルタイム、非侵襲的発光緑膿菌のバイオ フィルム創傷感染の監視のヘアレス マウスを用いた新規糖尿病マウスモデルをについて説明します。このメソッドは、他の菌種と複数種バイオ フィルムを含む、遺伝子組換え微生物の感染症を評価および antibiofilm 戦略の有効性をテストして合わせることができます。

要約

慢性の傷、特に糖尿病患者での構造化されたバイオ フィルムとしての細菌の存在は、創傷治癒や解像度を防ぐためと考えられます。慢性マウスモデルの傷は、微生物とホストの間の根本的な相互作用を理解するために使用されています。これまで開発したモデルは、髪の動物の使用は、細菌による傷組織のターミナル ・ コレクションに依存します。これらのモデルに重要な洞察を得た、この実験動物の大きい数が必要です、サンプリングは時間がかかります。慢性創傷におけるバイオ フィルムの進行を評価するいくつかの最適な革新を組み込んだ新規マウスモデルを開発した:) それは毛の取り外しのための必要性を排除、ヘアレス マウスを利用してb) 永続化の即時評価とホストにこれらのコミュニティの効果を可能にする傷に前もって形成されたバイオ フィルムを適用されます。c) 遺伝子組み換え生物発光菌緑膿菌、感染症の研究ごとに必要な動物の数を減らすをリアルタイムで監視できるように、光を定量化することでバイオ フィルムの進行を監視します。このモデルで単一の全深さの傷は STZ 誘発糖尿病マウスの裏面に生産、膿発光ひずみ Xen 41 のバイオ フィルムを接種しました。傷からの光出力生体内イメージング システムに、生体内でその場で急速なバイオ フィルムの可視化と傷内バイオ フィルム細菌の局在に毎日記録されます。この手法は柔軟な遺伝子組み換え種、複数種バイオ フィルムなど、他の微生物を調査する使用することができ、抗菌閉塞性ドレッシングを含む抗バイオ フィルム戦略をテストで特別な価値があります。

概要

バイオ フィルムの慢性の傷¹の解像度が低い要因として強調表示されている高分子物質のマトリックスに埋め込まれた微生物の複雑なコミュニティであります。これらの高度に組織化された、永続的な微生物集団の研究は、四肢周辺変質的な知覚メカニズムに血行不良が検出されない病変²につながる糖尿病の患者のため特に重要です。アメリカ合衆国では、糖尿病患者の 15% は自分たちの生活の中に、少なくとも 1 つの潰瘍を開発すると推定されます。これは無量の感情的、社会的負担を述べない治療^3,4で約 280 億ドルの経済的な支出に変換します。傷のベッドで癒しのイベントでこれらのバイオ フィルムに与える影響を永続化する微生物ができる要因を理解することは、影響を受ける患者のためのより良いケアを駆動し、新しい処置のアプローチの開発を推進することが不可欠です。したがって、再現で変換可能な体内細菌のホストの相互作用の探索にモデルの確立が重要です。

慢性の傷でバイオ フィルムの影響を研究する、マウスモデルを正常に開発されています。ただし、これらのモデルは、しばしば、髪の種を利用し、犠牲にされた動物が、時間がかかり、高価なから摘出組織の細菌細胞のプレート カウントによってバイオ フィルム クリアランスを評価します。

感染症の評価における動物の終了点サンプリング バイオフォトニック代替最初、Contagらにより提案されました。(1995 年)^5,人は抗生物質の治療効果を測定する恒常発光サルモネラから発光をキャプチャする手法を開発しました。他の生物発光発光細菌の活用の研究が続いた。たとえば、Rochettaら。(2001 年)⁶検証を激化させた電荷結合素子を用いた発光を測定することにより大腸菌太もも感染症のマウスを研究する感染症モデルおよび後で、Kadurugamuwaら。(2003 年)⁷は黄色ブドウ球菌マウスにおけるカテーテル治癒モデルにおけるいくつかの抗生物質の有効性を調査するための設計されたひずみの性質を発光の光子を利用しました。

ここで特徴づけられるメソッドを提示ヘアレス マウスの糖尿病を誘発する、制作し膿の前もって形成された発光バイオ フィルムで傷を予防接種、バイオフォトニック感染のモニタリングを実施する簡単なプロトコル生体内でイメージ投射システムを使用しています。直通快速、その場で、慢性の傷でバイオ フィルムを評価する非侵襲的かつ定量的プロセスを提供していますさらに、詳細な分析により、癒しの顕微鏡イメージング傷、断続的な採血のためなどサイトカイン測定と組織学のためのターミナルの組織コレクション。

プロトコル

動物実験は機関動物ケアおよび使用委員会のミシガン州立大学によって承認されました

。

1. 閉塞性ドレッシングの準備やシリコーン スペーサー

1. 透明な閉塞性ドレッシングをカットして正方形約 1 cm × 1 cm ハサミで
。
2. カット 10 mm 丸 10 mm 生検パンチ センター 5 mm 生検を使用して 0.5 mm 厚のシリコン シート 10 mm の円の中にパンチとしっかりとフォームに穴を作成するを押して、" ドーナツ "-添え木として使用されるディスクのよう。

。

2. 実験動物

商業ブリーダーから

1. 使用 8 週間の古い (22-26 g) 男性 SKH 1 マウス。食料と水 21 ° C と無料で 12 時間の明暗周期の標準条件でマウスを維持します
。
2. 糖尿病を誘発する注入マウス intraperitonially 13 mg/ml ストレプトゾトシン (STZ) solutionand 25% ブドウ糖 (250 μ l/マウス/) 5 日間連続で。
   1. 100 mm クエン酸、pH 4.5 5 μ L の STZ の希釈の 65 μ g で STZ ソリューションを作成します
   。
   2. は、マウスの体重の 1 kg あたり 65 mg STZ の最終的な質量に各マウスの噴射量を調整します。同じ日に 100 mM クエン酸溶液 pH 4.5 でマウスを挿入します
   。
3. 血糖モニタリング、glucometer と最後の STZ 投与後 14 日間で高血糖を確認します。多尿があります糖尿病マウスそして彼らの寝具は湿気を除去するためにはより頻繁に変更する必要があります、その重みを週に 3 回を監視します
。

3。バイオ フィルム

1. バイオ フィルム準備
   1. 成長のコロニー バイオ フィルム ⁸ 傷を接種します。37 ° C で培養した手術開始前に 2 日間発光の一晩文化 膿 Xen トリプシン大豆スープ (TSB) 41 200 rpm で揺れと紫外線への露出によって 0.2 μ m 孔サイズのポリカーボネート製メンブラン フィルターを殺菌しなさい側あたり 15 分のための生物学的安全フードの光
   。
   2. 1 日手術前に遠心 2 分 20,000 × g で一晩かけて培養し、Dulbelcco 1 mL で 3 回洗う ' 上下ピペッティングによる s リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS).
   3. DPBS 600 0.05 の吸光度に懸濁液を希釈 nm
   。
   4. トリプシン大豆寒天 (TSA) に各膜希薄文化のピペット 10 μ L。乾燥することができます後、72 時間ごと 24 時間新鮮な TSA プレートに転送するバイオ フィルムの成長を 35 ° C で膜を孵化させなさい
2. 標準曲線
   1. 発光と細菌数を関連付ける標準曲線を作る実験の開始前にします
   。
   2. 3.1 で述べたように、バイオ フィルムを準備します
   。
   3. は、視覚的に均一溶液が作成されるまで DPBS とボルテックス バイオ フィルムを混合することにより、1/2 から 1/24 に至るまでバイオ フィルムのシリアル希薄を作る。黒の 96 ウェル プレートと 生体内 イメージング システム イメージで希薄水溶液のピペット 200µL.
   4. TSA のプレートにプレートの希釈液を広げ、35 ° C 24 時間インキュベート
   5. プレートのコロニー形成単位 (CFU) をカウントし、生物発光と細菌数を関連付ける標準曲線を作成します
   。

4。手術の傷

1. 1 L/分の流量で 95% oxygen/5% CO ₂ (性ケトアシドーシスによる死亡を防ぐため) にイソフルランを使用して全身麻酔を誘導し、1-3% イソフルランを使用して麻酔を維持します。手術中に熱マット上の動物を維持します
。
2. マウスの深いペダル反射足をピンセットでつまんで抑制されやすい位置にマウスを置きことを確認します
。
3. メロキシカム (0.2 mg/kg) を皮下注射 (30 μ l) 痛みの管理を介して管理します
。
4. 10% ポビドン ヨード 3 回で背中とイソプロパノール パッドの肌を拭く
。
5. マウスの 1 つの側面の傷の 1 つの円形のパターンの概要を説明する滅菌 4 mm 生検パンチを使用して '、肩のレベルで s 正中線。永久的なマーカーとパターンの概要を説明します
。
6. 鋸歯鉗子を使用して組織層 carnosus を含む皮下組織まで全層創傷を作成し、組織の円形の部分を切除するアウトラインとアイリスのはさみの真ん中に皮膚を持ち上げます.
7. は、医療防水皮膚接着剤接着剤をマウスの皮膚に適用し、穏やかな圧力を適用するシリコーン スプリントを配置します。透明な閉塞性ドレッシング材で傷をカバーしてください。手術後、個別にケージ動物
。

5。術後管理

1. メロキシカム (0.2 mg/kg) 一度毎日皮下注射を介して次の 2 日間の術後鎮痛管理します
。
2. モニター動物の痛み、体重減少の症状のために毎日。糖尿病動物体重の 15% 以上を紛失した場合インスリン注射が必要です
。

6。バイオ フィルムの接種材料の準備や感染症

1. 次の手順で説明するよう手術後 48 時間のマウスに接種します
。 滅菌のへらを使用して膜から
2. こすり 72 h バイオ フィルム微量遠心チューブに配置し、希釈 DPBS で 1:2。簡単に上下にピペッティングしてミックスします
。
3. 拡散板合計 CFU を計算する TSA のプレートに接種。カウントが正確であるためには、一連の超音波洗浄器で 40 kHz で 2 分間超音波処理ステップによってインターカ レートした 2 つ 1 分ボルテックス手順によってさらにバイオ フィルム菌を打破します
。
4. ドレッシングでカバー傷とシリコーン スプリントし、参照の定規を使用して接続されているカメラで顕微鏡と傷口の顕微鏡写真を取るを削除します
。
5. 200 μ L ピペット チップの先端をカットし、各傷にバイオ フィルム菌の 10 μ L をピペットします
。
6. 生体内 イメージング システムの自動設定を使用してイメージのマウス: 露光時間 5-300 s、中ビン、1 f/ストップと開いているフィルター ビューのフィールド C と (12.9 x 12.9 cm).
7. カバーは新鮮なドレッシング創傷します
。

7。傷の計測とイメージング

1. 動物毎日 ⁹ の臨床徴候を評価します
。
2. 食品を提供、水、ケージを必要に応じて変更します
。 毎日のドレッシングの
3. チェックの整合性。ドレッシングが存在する場合は、傷の閉塞のためのみ発光を測定できます。8 日でドレッシングが削除され、傷の閉鎖のできる測定を置き換えられません
。
4. その他の毎日の動物の重量を量ます
。
5. 、すべての日の隔離室で個別にマウスを配置HEPA フィルターと、生体内で イメージ投射システム毎日または発光値がバック グラウンド レベルを下回るまで、その他の毎日を使用してイメージを装備
。
6. 8 日後全身麻酔を誘導し、傷が治癒するまで毎日参照の定規を使用して接続されているカメラで顕微鏡と傷口の顕微鏡写真を撮ます
。

8。組織学的解析

1. 安楽死、安楽死の CO ₂ の 2 l/分の流量でマウスのバック グラウンド レベルを下回ると発光、傷が完全に治癒後の部屋。2 番目のメソッドとして安楽死の頚部転位によって死を確認します
。
2. アイリスはさみを使用しての周りや創傷部 (直径約 1 cm) 下の広い、完全切除を作成し、組織学的解析のための 4% パラホルムアルデヒドで組織を維持します
。
3. 他の分析: サイトカインの検出
   1. レトロ軌道毛細管ガラス管を用いた麻酔下の動物から血を収集し、EDTA 処理管にそれを転送します
   。
   2. 4 ° C で 20 分間 2,000 rpm で血液を遠心し、サイトカインの検出のため血漿を凍結します
   。

結果

この新しいモデルを開発する c57bl/6 j マウスを過去に使用した上毛 SKH 1 の活用において多くの利点が見られました。通常 STZ 注射を受ける動物糖尿病の発症と緩やかな減量を経験します。ただし、傷の癒しの実験以前による所内ダンらによって提示されたモデルを再現します。(2012 年)⁹ c57bl/6 j、急激な体重減少を使用していた (...

ディスカッション

ここで我々 は、翻訳、再現性のある、柔軟なモデルの作成に多くの利点を持つ糖尿病慢性創傷でバイオ フィルムの研究のための新しいマウスモデルをについて説明します。

最初の技術革新は、ヘアレス マウスの使用です。糖尿病の慢性創傷治癒の^10、11を勉強する他のマウスのモデルが開発されているが、すべてはワックス?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Opsite	Smith & Nephew	Model 66000041	Smith & Nephew Flexfix Opsite Transparent Adhesive Film Roll 4" x 11yards
SKH-1 mice Crl:SKH1-Hrhr	Charles River Breeding Laboratories	SKH1	Hairless mice, 8 weeks old
Streptozotocin (STZ)	Sigma Aldrich	S0130-1G	Streptozocin powder, 1g
AccuChek glucometer	Accu-Chek Roche	Art No. 05046025001	ACCU-CHEK CompactPlus Diabetes Monitoring Care Kit
Pseudomonas aeruginosa Xen 41	Perkin Elmer	119229	Bioluminescent Pseudomonas aeruginosa
Polycarbonate membrane filters	Sigma Aldrich	P9199	Millipore polycarbonate membrane filters with 0.2 μm pore size
Dulbelcco phosphate buffer saline (DPBS)	Sigma Aldrich	D8537	PBS
Tryptic soy agar	Sigma Aldrich	22091	Culture agar
Meloxicam	Henry Schein Animal Health	49755	Eloxiject (Meloxicam) 5mg/mL, solution for injection
10% povidone-iodine (Betadine)	Purdue Products LP	301879-OA	Swabstick, Betadine Solution. Antiseptic. Individ. Wrapped, 200/case
4% paraformaldehyde	Fisher Scientific	AAJ61899AK	Alfa Aesar Paraformaldehyde, 4% in PBS
Capillary glass tube	Fisher Scientific	22-362-566	Heparinized Micro-Hematocrit Capillary Tubes
Silicone to make splints	Invitrogen Life Technologies Corp	P-18178	Press-to-Seal Silicone Sheet, 13cm x 18cm, 0.5mm thick, set of 5 sheets
Tryptic soy broth	Sigma Aldrich	22092	Culture broth
IVIS Spectrum	Perkin Elmer	124262	In vivo imaging system
IVIS Spectrum Isolation chamber	Perkin Elmer	123997	XIC-3 animal isolation chamber
HEPA filter	Teleflex	28022	Gibeck ISO-Gard HEPA Light number 28022
Biopsy punches	VWR International Inc	21909-142	Disposable Biopsy Punch, 5mm, Sterile, pack of 50.
Biopsy punches	VWR International Inc	21909-140	Disposable Biopsy Punch, 4mm, Sterile, pack of 50.
Glucose	J.T.Baker	1916-01	Dextrose, Anhydrous, Powder
Citric acid	Sigma Aldrich	C2404-100G	Citric Acid
Mastisol	Eloquest Healthcare	HRI 0496-0523-48	Mastisol Medical Liquid Adhesive 2/3 mL vial, box of 48
Corning 96-well black plates	Fisher Scientific	07-200-567	96-well clear bottom black polysterene microplates
25 gauge 5/8 inch needle	BD	305122	Regular bevel needle
Bransonic M Ultrasonic Cleaning Bath	Branson Ultrasonics	N/A	Ultrasonic Cleaner