来到光明的一面: 体内糖尿病无毛小鼠慢性伤口生物膜感染的监测

摘要

在这里, 我们描述了一个新的糖尿病小鼠模型利用无毛 real-time, 无创, 监测生物膜伤口感染生物发光的铜绿假单胞菌。该方法可用于评价其他细菌种类和转基因微生物的感染, 包括多生物膜, 并对 antibiofilm 策略的有效性进行测试。

摘要

在慢性创伤中, 特别是在糖尿病患者中, 细菌的存在是一种结构化的生物膜, 被认为可以防止伤口的愈合和解决。慢性小鼠伤口模型已经被用来理解微生物和宿主之间的潜在相互作用。该模型的发展至今依赖于头发动物的使用和伤口组织的终端收集, 以确定可行的细菌。虽然这些模型已经获得了很大的洞察力, 但这个实验过程需要大量的动物, 取样是费时的。我们开发了一种新的小鼠模型, 它结合了几种最佳的创新方法来评估慢性伤口中生物膜的进展: a) 它利用无毛老鼠, 消除了脱毛的需要;b) 将预先生物膜应用于伤口, 以便立即评估这些社区对宿主的持久性和影响;c) 监测生物膜的进展, 通过量化由基因工程生物荧光菌株的铜绿假单胞菌的光生产, 使 real-time 监测的感染, 从而减少了每项研究所需的动物数量。在该模型中, 在脲佐菌素诱导的糖尿病无毛小鼠的背上产生单全创面, 并在其上接种了铜绿绿脓杆菌生物发光菌株41的生物膜。从伤口的光输出每天记录在一个体内成像系统, 允许在体内和原位快速生物膜可视化和局部化生物膜细菌在伤口。这种新的方法是灵活的, 因为它可以用来研究其他微生物, 包括基因工程物种和多生物膜, 并可能具有特殊价值的测试 anti-biofilm 战略, 包括抗菌闭塞敷料。

引言

生物膜是嵌在高分子物质基质中的复杂的微生物群落, 被强调为导致慢性伤口的不良解决的一个因素¹。对这些高度有组织的, 持久性微生物种群的研究对于糖尿病患者来说尤为重要, 因为在肢体上的循环不良和周围感觉机制的改变会导致未被察觉的病变²。在美国, 据估计, 15% 的糖尿病患者在生命过程中至少会产生一种溃疡。这转化为经济支出约280亿美元的治疗^3,4, 更不用说 immensurable 的情感和社会负担。了解允许微生物群落在创面中持续存在的因素, 以及这些生物膜在愈合过程中所产生的影响, 对于更好地照顾受影响的患者和推动新的治疗方法的发展是势在必行的。因此, 建立可重复和可翻译的在体内模型, 以探索细菌与宿主的相互作用是最重要的。

小鼠模型已经成功地研究了生物膜对慢性伤口的影响。然而, 这些模型经常利用头发的物种, 并通过平板计数来评估生物膜清除量, 为被牺牲的动物切除组织的活细菌细胞, 使它们耗费大量时间和成本。

Contag et al首次提出了一种 biophotonic 的动物在评估感染时的终点取样的替代方法。(1995)^5,谁开发了一种方法来捕获发光从组成生物发光的沙门氏菌沙门菌测量抗生素治疗的功效。其它利用生物发光细菌的研究也随之而来。例如, Rochetta et al。(2001)⁶通过使用增强的电荷耦合装置和后来的 Kadurugamuwa et al来验证感染模型, 以研究大肠杆菌小鼠的大腿感染。(2003)⁷利用了一株被工程化的金黄色葡萄球菌的光子发射特性, 研究了几种抗生素在小鼠导管伤口模型中的有效性。

该方法的特点是在无毛小鼠中诱导糖尿病的直接协议, 预先生物荧光生物膜产生和接种伤口, 并对感染的铜绿假单胞菌进行 biophotonic 监测。使用在体内成像系统。它提供了一个直接, 快速,原位, 非侵入性和定量的过程, 以评估慢性伤口的生物膜, 此外, 允许额外的分析, 如显微成像愈合伤口, 间歇血液收集细胞因子的测量, 和组织学的晚期组织收集。

研究方案

动物实验由密歇根州立大学动物保育和使用委员会批准.

1. 咬合敷料和硅胶垫片的制备

1. 剪切透明的咬合敷料, 使正方形约 1 cm x 1 厘米与剪刀.
2. 在0.5 毫米厚的硅胶片上用10毫米的活检拳切割10毫米圆圈. 和 #160; 中心5毫米活检冲床在 10 mm 圈的中间, 并按坚定地创建一个孔, 形成一个和 #34;d onut 和 #34;-像圆盘, 将被用作夹板. 和 #160;

2. 实验动物

1. 使用8周老 (22-26 克) 雄性 SKH-1 小鼠。保持21和 #176 的标准条件下的小鼠; C 和12小时暗循环, 免费获得食物和水.
2. 为了诱发糖尿病, 在5连续的天内, 用13毫克/毫升链脲佐菌素 (intraperitonially) solutionand 25% 葡萄糖 (250 和 #181; l/鼠标) 注射小鼠.
   1. 通过稀释65和 #181; 5 和 #181 中的脲佐菌素 g; 100 mM 柠檬酸, pH 4.5.
   2. 调整每只老鼠的注射量为每1公斤的老鼠体重65毫克的最终质量。100毫米柠檬酸溶液注射控制小鼠的 pH 值4.5 在同一天.
3. 在最后一次注射血糖后14天内通过血糖监测确认高血糖。糖尿病小鼠可能有尿, 所以他们的床上用品可能需要更频繁地改变, 以消除湿度和他们的体重应监测每周3次.

3。生物膜

1. 生物膜制备
   1. 生长菌落生物膜 ⁸ 以给伤口接种。手术前两天开始一夜的生物发光的文化 铜绿假单胞菌 Xen 41 在胰的大豆肉汤中孵育在37和 #176; C 和震动 200 rpm 和消毒的聚碳酸酯膜过滤器与0.2 和 #181; m 孔径通过暴露在紫外光在一个生物安全罩15分钟每边.
   2. 一天前的手术离心机过夜培养 2万 x g 2 分钟和洗涤3次与1毫升的 Dulbelcco 和 #39; 磷酸缓冲盐水 (DPBS) 由移上下.
   3. 稀释悬浮在 DPBS 到0.05 在 600 nm 的吸光度.
   4. 吸管10和 #181; 在胰大豆琼脂 (TSA) 板上的每个膜上的稀释培养基的 L。在允许干燥后, 在35和 #176 孵育膜; C 为72小时生长生物膜, 每24小时向新的 TSA 板转移.
   在实验开始之前,
2. 标准曲线
   1. 将发光和细菌计数关联起来的标准曲线.
   2. 准备3.1 中描述的生物膜.
   3. 使生物膜的系列稀释从 #189; 到1/24 通过混合生物膜与 DPBS 和涡流, 直到产生一个视觉均匀的解决方案。吸管200和 #181; 在一个黑色96井板和图像的稀释溶液的 L 的 在体内 成像系统.
   4. 将板稀释到 TSA 板上并在35和 #176 上孵育; C 为 24 h.
   5. 在板上计数菌落形成单元 (CFU), 并创建标准曲线以关联生物发光和细菌计数.

4。伤口手术

1. 在 95% oxygen/5%co 中使用异氟醚诱导全身麻醉 (以防止酮症酸中毒死亡), 流速为1升/分和 #160; 使用1-3% 异氟醚维持麻醉。在手术中保持动物的热垫.
2. 确保通过用镊子捏住脚并将鼠标置于俯卧位置来抑制鼠标的深层踏板反射.
3. 昔 (0.2 毫克/千克) 通过 sub-cutaneous 注射 (30 和 #956; l) 进行疼痛管理.
4. 用10% 聚维酮碘三次和一个异丙醇垫擦拭背部的皮肤.
5. 使用无菌 4 mm 活检穿孔, 为鼠标和 #39 的一侧的伤口勾勒一个圆形图案。用永久性标记勾勒图案.
6. 使用锯齿钳在轮廓和虹膜剪刀的中部提起皮肤, 以创建一个全的伤口, 延伸到皮下组织, 包括 panniculus carnosus 和切除圆形的组织.
7. 将医用防水皮肤粘合剂粘附在小鼠的皮肤上, 并将硅胶夹板施加轻度压力。用透明的咬合敷料盖住伤口。手术后, 将动物单独关在笼子里.

5。术后管理

1. 每日通过 sub-cutaneous 注射昔 (0.2 毫克/千克), 用于术后2天内疼痛缓解.
2. 每天监测动物的疼痛和体重减轻的表现。糖尿病动物需要胰岛素注射时, 他们已经失去了15% 或更多的体重.

6。生物膜接种的制备和感染

1. 在手术后接种48小时的小鼠, 如以下步骤所述.
2. 用无菌刮刀从膜上刮 72 h 生物膜, 将其放在离心管中, 并在 DPBS 中稀释1:2。混合通过短暂的移上下.
3. 将板接种到 TSA 板上, 以计算总 CFU。为了确保计数是准确的, 打破了生物膜接种进一步由一系列的两个1分钟的涡流步骤插2分钟超声步骤在40赫在一个超声波清洗器.
4. 删除敷料覆盖伤口和硅胶夹板, 并采取显微镜下的伤口与相机的摄像头使用的标尺, 以供参考.
5. 切割200和 #181 的提示; l 吸管提示和吸管10和 #181; 生物膜的 l 接种在每个伤口上.
6. 图像鼠标使用 在体内 成像系统使用自动设置: 曝光时间5-300 秒, 与中等分, 1 f/停止和开放过滤器, 和视野 C (12.9 cm x 12.9 cm).
7. 用新敷料覆盖伤口.

7。伤口测量和成像

1. 每日评估动物临床症状 ⁹ 。
2. 根据需要提供食物、水和更换笼子.
3. 每天检查敷料的完整性。当敷料是存在的, 只有生物发光可以测量, 由于闭塞的伤口。在8天, 敷料被删除, 并没有取代, 允许测量伤口闭合.
4. 每隔一天称一次动物.
5. 所有天数, 将小鼠单独放置在隔离室中使用 活体 成像系统每天或每隔一天都配备一个高效的过滤器和图像, 直到发光值降到背景水平以下.
6. 8 天后, 在伤口愈合前, 用一把尺子, 用一把相机, 用一把显微, 用显微镜将伤口全身麻醉.

8。组织学分析

1. 在安乐死室和 #160 中安乐2升/分钟的 CO ₂ 的小鼠; 发光后降到背景水平以下, 伤口完全愈合。确认宫颈脱位死亡是第二种安乐死方法.
2. 使用虹膜剪刀创建一个宽, 完整的切除周围和伤口面积 (约1厘米直径), 并保存在4% 甲醛组织病理分析.
3. 其他分析: 细胞因子检测
   1. 使用毛细管玻璃管从动物体内收集血液轨道, 并将其转移到 EDTA 处理过的管中。
   2. 离心机的血液在 2000 rpm 20 分钟, 在4和 #176; C 和冷冻血浆细胞因子检测.

结果

在这个新模型的开发中, 我们观察到了利用无毛 SKH-1 C57BL/6J 小鼠的许多优点, 这是我们过去使用过的。在糖尿病的发病过程中, 受注射脲佐菌素的动物通常会逐渐减轻体重;然而, 在先前由我们的实验室进行的伤口愈合实验中, 复制了邓恩. et al提出的模型。(2012)⁹使用 C57BL/6J, 观察到了剧烈的失重 (图 1)。与此相反, 当使用 SKH-1 小?...

讨论

在这里, 我们描述了一个新的老鼠模型的研究糖尿病慢性伤口的生物膜有很多优势, 创造一个可复制的, 可翻译的, 灵活的模型。

第一项创新是使用无毛小鼠。其他的小鼠模型已经开发, 以研究糖尿病慢性伤口愈合^10,11, 但所有这些都依赖于头发小鼠的使用, 需要脱毛的过程, 包括打蜡或头发修剪结合脱毛霜这一步不仅费时和凌乱, 但可?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Opsite	Smith & Nephew	Model 66000041	Smith & Nephew Flexfix Opsite Transparent Adhesive Film Roll 4" x 11yards
SKH-1 mice Crl:SKH1-Hrhr	Charles River Breeding Laboratories	SKH1	Hairless mice, 8 weeks old
Streptozotocin (STZ)	Sigma Aldrich	S0130-1G	Streptozocin powder, 1g
AccuChek glucometer	Accu-Chek Roche	Art No. 05046025001	ACCU-CHEK CompactPlus Diabetes Monitoring Care Kit
Pseudomonas aeruginosa Xen 41	Perkin Elmer	119229	Bioluminescent Pseudomonas aeruginosa
Polycarbonate membrane filters	Sigma Aldrich	P9199	Millipore polycarbonate membrane filters with 0.2 μm pore size
Dulbelcco phosphate buffer saline (DPBS)	Sigma Aldrich	D8537	PBS
Tryptic soy agar	Sigma Aldrich	22091	Culture agar
Meloxicam	Henry Schein Animal Health	49755	Eloxiject (Meloxicam) 5mg/mL, solution for injection
10% povidone-iodine (Betadine)	Purdue Products LP	301879-OA	Swabstick, Betadine Solution. Antiseptic. Individ. Wrapped, 200/case
4% paraformaldehyde	Fisher Scientific	AAJ61899AK	Alfa Aesar Paraformaldehyde, 4% in PBS
Capillary glass tube	Fisher Scientific	22-362-566	Heparinized Micro-Hematocrit Capillary Tubes
Silicone to make splints	Invitrogen Life Technologies Corp	P-18178	Press-to-Seal Silicone Sheet, 13cm x 18cm, 0.5mm thick, set of 5 sheets
Tryptic soy broth	Sigma Aldrich	22092	Culture broth
IVIS Spectrum	Perkin Elmer	124262	In vivo imaging system
IVIS Spectrum Isolation chamber	Perkin Elmer	123997	XIC-3 animal isolation chamber
HEPA filter	Teleflex	28022	Gibeck ISO-Gard HEPA Light number 28022
Biopsy punches	VWR International Inc	21909-142	Disposable Biopsy Punch, 5mm, Sterile, pack of 50.
Biopsy punches	VWR International Inc	21909-140	Disposable Biopsy Punch, 4mm, Sterile, pack of 50.
Glucose	J.T.Baker	1916-01	Dextrose, Anhydrous, Powder
Citric acid	Sigma Aldrich	C2404-100G	Citric Acid
Mastisol	Eloquest Healthcare	HRI 0496-0523-48	Mastisol Medical Liquid Adhesive 2/3 mL vial, box of 48
Corning 96-well black plates	Fisher Scientific	07-200-567	96-well clear bottom black polysterene microplates
25 gauge 5/8 inch needle	BD	305122	Regular bevel needle
Bransonic M Ultrasonic Cleaning Bath	Branson Ultrasonics	N/A	Ultrasonic Cleaner