라이트 사이드에와 서: Vivo에서 당뇨병 털 Murine 모델에 만성 상처에서 녹 농 균 Biofilm 감염의 모니터링

요약

여기는 실시간, 비-침략 적, 발광 녹 농 균의 biofilm 상처 감염의 모니터링을 위한 털 쥐를 활용 하 여 새로운 당뇨병 murine 모델에 설명 합니다. 이 메서드는 다른 세균성 종 및 다 종 biofilms를 포함 하 여 유전자 변형된 미생물의 감염을 평가 하 고 antibiofilm 전략의 효능 테스트에 적용할 수 있습니다.

초록

당뇨병 환자, 특히 만성 상처에 구조적된 biofilms 박테리아의 존재는 상처 치유 및 해상도 방지 하기 위해 생각 된다. 만성 마우스 상처 모델 미생물와 호스트 간의 기본 상호 작용 이해에 사용 되었습니다. 최신 개발 모델 머리 동물의 사용 및 실행 가능한 박테리아의 결정에 대 한 상처 조직의 터미널 컬렉션에 의존 합니다. 이러한 모델 인 사이트를 얻고,이 실험적인 절차 필요 동물의 많은 수 및 샘플링 시간이 소모 되는 중요 한 동안. 우리는 만성 상처에 biofilm 진행을 평가 하기 위해 몇 가지 최적의 혁신을 통합 하는 소설 murine 모델 개발: 한) 털 쥐, 머리 제거;에 대 한 필요성을 제거 사용 b) 지 속성의 즉각적인 평가 호스트;에이 커뮤니티의 효과 대 한 수 있도록 상처에 미리 형성 된 biofilms 적용 c) 녹 농 균, 따라서 연구 당 필요한 동물의 수를 줄이고 감염의 실시간 감시를 허용의 유전자 조작된 발광 변형에 의해 빛 생산 측정 모니터링 biofilm 진행 합니다. 이 모델에서 단일 전체 깊이 상처는 STZ 유도 당뇨병 털 쥐의 뒷면에 생산과 P. 농 균 발광 스트레인 젠 41의 biofilms와 주사. 상처에서 광 출력을 vivo에서 이미징 시스템, vivo에서 그리고 제자리에서 빠른 biofilm 시각화 및 상처 내 biofilm 박테리아의 지역화에 대 한 허용에 매일 기록 됩니다. 이 새로운 메서드는 유연한 유전자 조작된 종 등 여러 종 biofilms, 다른 미생물을 연구 하는 데 사용할 수 있습니다 하 고 항균 성 폐색 드레싱을 포함 한 안티 biofilm 전략 테스트에 특별 한 가치가 있을 수 있습니다.

서문

Biofilms 만성 상처¹의 불 쌍 한 해상도 대 한 기여 요인으로 강조 된 고분자 물질의 매트릭스에 포함 된 미생물의 복잡 한 지역 사회는. 이 매우 조직적이 고 지속적인 미생물 인구의 연구는 특히 당뇨병 환자는 사지 및 변경 된 주변 감각 메커니즘에 냉 들 키 지 않고 병 변²이어질 중요 합니다. 미국에서는, 그것은 당뇨병 환자의 15% 그들의 생활의 과정 동안 적어도 하나의 궤를 개발할 것입니다 추정. 이 치료^3,4, 약 28 십억 달러의 경제 비용 immensurable 정서적 및 사회적 부담을 언급 하지 않기 위하여 변환 됩니다. 상처 침대와 이러한 biofilms 치유 행사에 미칠 영향에 유지 하기 위해 미생물 커뮤니티를 허용 하는 요소를 이해 하는 것은 영향을 받는 환자에 대 한 더 나은 관리를 운전 하 고 새로운 치료 방법의 개발을 추진 하는 것이 필수적. 따라서, 재현할 수 및 번역 vivo에서 박테리아-호스트 상호 작용을 탐구에 대 한 모델의 설립은 최고 이다.

Murine 모델 biofilms 만성 상처에의 영향을 공부를 성공적으로 개발 되었습니다. 그러나이 모델,, 종종 머리 종 그리고 활용 biofilm 정리 삭제 조직의 희생된 동물, 시간이 소모 및 비용이 많이 드는 그들을 만들기에서 실행 가능한 박테리아 세포에 대 한 판 수에 의해 평가.

Biophotonic 대안 평가 감염 동물의 끝점 샘플링을 Contag 외에의해 처음 제안 했다. (1995) ^{5 ,} constitutively 발광 살 모 넬 라 typhimurium 항생제 치료 효능 측정 하에서 발광을 캡처하는 방법 개발. 생물 발광-발광 박테리아를 활용 하는 다른 연구 뒤. 예를 들어 Rochetta은 외. (2001 년) ⁶ 발광 한 강화 전 하 결합 소자를 사용 하 여 측정 하 여 대장균 허벅지 감염 마우스에서 공부 하는 감염 모델 검증 및 나중에, Kadurugamuwa 외. (2003) ⁷ 쥐에서 카 테 터 상처 모델에서 여러 가지 항생제의 효능을 조사 하기 위해 포도 상 구 균 의 설계 긴장의 방출 광자의 이용을 했다.

여기 특징 방법 선물 털이 없는 쥐에 있는 당뇨병을 유도, 생산 및 상처와 미리 형성한 발광 biofilms P. 녹 농 균 의 접종 및 biophotonic 감염의 모니터링을 실시 하는 간단한 프로토콜 사용 하는 비보에 이미징 시스템. 그것은 제공 하는 직접, 급속, 제자리에서비-침략 적, 양적 프로세스 biofilms 만성 상처에 평가 하 고 현미경 이미징 치유의 상처, 간헐적인 혈액 컬렉션에 대 한와 같은 또한 추가 분석에 대 한 수 cytokine 측정, 그리고 조직학에 대 한 터미널 조직 컬렉션.

프로토콜

동물 실험 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 미시간 주립 대학에 의해 승인 했다.

1. 폐색 드레싱의 준비 및 실리콘 스페이서

1. 잘라 투명 한 폐색 드레싱을 사각형 약 1 cm × 1 cm가 위.
2. 잘라 10 m m 10mm 생 검 펀치. 센터 5mm 생 검을 사용 하 여 0.5 m m 두꺼운 실리콘 시트에 10 m m 원형 중간 펀치 원과 형태로 구멍을 만들고에 단단히 눌러는 " 도넛 "-부 목으로 사용 될 디스크 처럼.

2. 실험 동물

상업적인 종 축에서

1. 사용 8 주 오래 된 (22-26 g) 남성 SKH-1 쥐. 음식과 물에 21 ° C와 무료 12 h 빛 어두운 주기의 표준 상태에서 마우스를 유지.
2. 당뇨병을 유도 하는 13 mg/ml streptozotocin (STZ) solutionand 25% 마우스 intraperitonially 주사 포도 당 (당 250 µ l / 마우스) 5 일 연속에.
   1. Diluting 65 µ g STZ의 100 m 구 연산 산 성, pH 4.5 m의 5 µ L에 의해 STZ 솔루션 확인.
   2. 각 마우스의 마우스 몸 무게 1 킬로그램 당 65 mg STZ의 마지막 질량에 대 한 삽입된 볼륨을 조정합니다. 같은 일에 100 m m 구 연산 산 성 솔루션 ph 4.5 통제 쥐를 주입.
3. 혈당 모니터링는 glucometer와 마지막 STZ 주입 후 14 일에 의해 혈당을 확인. 당뇨병 쥐 polyuria 있을 수 있습니다 그래서 그들의 침구 촉촉한 제거를 더 자주 변경 해야 할 수 있습니다 하 고 그들의 무게는 3 회 모니터링 해야 합니다.

3. Biofilms

1. Biofilm 준비
   1. 성장 식민지 biofilms ⁸ 상처를 예방 하. 2 일 수술 시작 전에 발광의 숙박 문화 P. 농 균 젠 tryptic 간장 국물 (TSB)에 41 37 ° C에서 incubated 200 rpm에서 떨고 있고 UV에 노출에 의해 0.2 µ m 기 공 크기와 폴 리 카보 네이트 멤브레인 필터를 소독 사이드 당 15 분에 대 한 생물 안전 후드에 빛.
   2. 수술 전에 1 일 원심 20000 x g 2 분에 대 한 야간 문화 그리고 Dulbelcco의 1 mL로 3 번 세척 ' s 인산 아래로 pipetting으로 식 염 수 (DPBS) 버퍼링.
   3. 0.05 600에서의 흡 광도를 DPBS에 현 탁 액 희석 nm.
   4. Tryptic 간장 agar (TSA) 접시에 각 막에 희석된 문화의 피 펫 10 µ L. 건조를 허용 후 모든 24 h. 신선한 TSA 격판덮개 전송 biofilms 성장 72 h 35 ° C에서 막 품 어
2. 표준 곡선
   1. 실험의 시작 이전에 게 생물 발광 및 세균 수를 연결 하는 표준 곡선.
   2. 3.1에 설명 된 대로 biofilms 준비.
   3. 는 시각적으로 균질 해결책은 생성 될 때까지 vortexing와 DPBS biofilm를 혼합 하 여 1/24 ½에서 배열 하는 biofilms의 직렬 희석 확인 합니다. 피 펫 200µL 블랙 96 잘 접시에 vivo에서 이미징 시스템 이미지 희석 솔루션.
   4. TSA 격판덮개에 격판덮개 dilutions와 24 h. 35 ° C에서 품 어
   5. 접시에 콜로 니 형성 단위 (CFU)를 계산 하 고 생물 발광 및 세균 수를 연결 하는 표준 곡선을 만듭니다.

4. 수술 상처

1. 1 L/min의 유량에서 isoflurane에에서 사용 95% oxygen/5% CO ₂ (ketoacidosis에서 죽음을 방지) 전신 마 취 유도 및 유지 사용 하 여 1-3 %isoflurane 마 취. 수술 하는 동안 열 매트에 동물 유지.
2. 마우스의 깊은 페달 반사는 핀셋으로 발을 곤란 하 게 하 여 억제 하 고 발생 하기 쉬운 위치에 마우스를 놓습니다.
3. Meloxicam (0.2 mg/kg) 통증 관리에 대 한 하위 피부 주입 (30 μ)을 통해 관리.
4. 10 %povidone-요오드 세 번 다시와 소 프로 파 놀 패드의 피부를 닦아.
5. 살 균 4mm 생 검 펀치를 마우스의 1 개의 측에 상처에 대 한 하나의 원형 패턴 개요을 사용 하 여 ' s 중간 어깨의 수준에서. 영구 표시와 함께 패턴 개요.
6. 톱니 모양의 집게를 사용 하 여 panniculus carnosus를 포함 하 여 피하 조직을 통해 확장 하는 전체 두께 상처를 만들고 조직의 원형 조각을 소비 세 개요와 아이리스가 위 중간 피부.
7. 의료 방수 피부 접착제 접착제 쥐의 피부에 적용 하 고 가벼운 압력 실리콘 부를 배치 합니다. 투명 한 폐색 하는 드레싱으로 상처를 커버. 수술 후, 개별적으로 동물 케이지.

5. 수술 후 관리

1. meloxicam (0.2 mg/kg) 다음 2 일에 대 한 수술 후 통증에 대 한 하위 피부 주입을 통해 하루에 한 번씩 관리.
2. 매일 통증 및 체중 감소의 발현에 대 한 모니터 동물. 그들은 몸 무게의 15% 이상을 잃었을 때 당뇨병 동물 인슐린 주사 필요.

6. Biofilm Inoculum 준비 및 감염

1. 다음 단계에 설명 된 대로 마우스 48 h 수술 후 예방.
2. 긁어 72 h biofilms 메 마른 주걱을 사용 하 여 막에서 그것 microcentrifuge 튜브에 놓고 DPBS에 1:2 희석 합니다. 짧게 위아래로 pipetting으로 믹스.
3. 확산 판 inoculum TSA 접시 총 CFU 계산 하에. 초음파 세탁 기술자에서 40 kHz에서 2 분 쥡니다 단계에 의해 삽입 된 두 개의 1 분 vortexing 단계 시리즈로 biofilm inoculum 더 뜨 개수 정확 하도록.
4. 상처와 실리콘 부 목 및 참조에 대 한 눈금자를 사용 하 여 연결 된 카메라와 현미경으로 상처의 현미경 사진 걸릴 드레싱 덮 음을 제거.
5. 200 µ L 피 펫 팁의 팁을 잘라내어 각 상처에 biofilm inoculum의 10 µ L 플라스틱.
6. 는 vivo에서 자동 설정을 사용 하 여 시스템 이미지를 사용 하 여 이미지 마우스: 노출 시간 5-300 s, 중간 binning, 1 f/정지 및 오픈 필터 및 보기의 필드 C (12.9 c m x 12.9 cm).
7. 커버 신선한 드레싱 상처.

7. 상처 측정 및 이미징

1. 동물 일일 ⁹의 임상 증상을 평가.
2. 음식을 제공, 물 및 필요에 따라 새 장 변경.
3. 확인 매일 드레싱의 무결성입니다. 드레싱 있으면, 상처의 폐색으로 인해 생물 발광만을 측정할 수 있습니다. 8 날, 드레싱 제거 되 고 상처 폐쇄의 허용 측정 바뀌지.
4. 무게 동물 매일.
5. 모든 일에 대 한 배치 마우스 개별적으로 고립 약 실에 HEPA 필터와는 vivo에서 매일 또는 하루 걸러 발광 값 배경 수준 이하로 떨어질 때까지 시스템 이미징 사용 하 여 이미지.
6. 8 일 후 전신 마 취를 유도 하 고 카메라로 현미경 현미경으로 상처의 연결 된 통치자를 참조 하 여 상처 치유 될 때까지 매일.

8. 조직학 분석

1. 는 안락사에서 CO ₂의 2 l/min의 흐름으로 쥐 발광 배경 수준 아래로 떨어지면 상처가 완전히 나 았 후 챔버 Euthanize. 안락사의 두 번째 방법으로 자 궁 경부 전위에 의해 죽음을 확인 하십시오.
2. 아이리스가 위 사용 하 여 만들고 주위와 아래 상처 영역 (직경 약 1 c m) 넓은, 전체 절단 조직학 분석을 위한 4 %paraformaldehyde 조직 보존.
3. 다른 분석: Cytokine 감지
   1. 복고풍 orbitally 유리 모 세관 튜브를 사용 하 여 마 취 동물에서 혈액을 수집 하 고 EDTA 대우 관에 그것을 전송.
   2. 4 ° C에서 20 분 2000 rpm에서 혈액을 원심와 플라스마 cytokine 탐지에 대 한 동결.

결과

이 새로운 모델을 개발, C57BL/6J 쥐, 우리가 과거에 사용 되는 동안 털 SKH-1을 활용에 많은 이점이 관찰 합니다. 동물 STZ 주사를 정상적으로 받게; 당뇨병의 발병과 점진적 체중 감소 경험 그러나, 상처 치유 실험 이전 실시 던 외제시한 모델을 재현 하는 우리의 실험실에 의해. (2012 년) ⁹ C57BL/6J, 급격 한 체중 감소를 사용 하 여 (그림 1

토론

여기는 재현, 번역, 그리고 유연한 모델을 만드는 많은 이점이 당뇨 만성 상처에 biofilms의 연구에 대 한 새로운 마우스 모델에 설명 합니다.

첫 번째 혁신은 털이 없는 쥐의 사용 이다. 모든 왁 싱 또는 머리 클리핑 함께 포함 하는 프로세스에 의해 모피의 제거를 요구 하는 발 마우스의 사용에 의존 해야 하지만 다른 마우스 모델 당뇨병 만성 상처 치유^10,

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Opsite	Smith & Nephew	Model 66000041	Smith & Nephew Flexfix Opsite Transparent Adhesive Film Roll 4" x 11yards
SKH-1 mice Crl:SKH1-Hrhr	Charles River Breeding Laboratories	SKH1	Hairless mice, 8 weeks old
Streptozotocin (STZ)	Sigma Aldrich	S0130-1G	Streptozocin powder, 1g
AccuChek glucometer	Accu-Chek Roche	Art No. 05046025001	ACCU-CHEK CompactPlus Diabetes Monitoring Care Kit
Pseudomonas aeruginosa Xen 41	Perkin Elmer	119229	Bioluminescent Pseudomonas aeruginosa
Polycarbonate membrane filters	Sigma Aldrich	P9199	Millipore polycarbonate membrane filters with 0.2 μm pore size
Dulbelcco phosphate buffer saline (DPBS)	Sigma Aldrich	D8537	PBS
Tryptic soy agar	Sigma Aldrich	22091	Culture agar
Meloxicam	Henry Schein Animal Health	49755	Eloxiject (Meloxicam) 5mg/mL, solution for injection
10% povidone-iodine (Betadine)	Purdue Products LP	301879-OA	Swabstick, Betadine Solution. Antiseptic. Individ. Wrapped, 200/case
4% paraformaldehyde	Fisher Scientific	AAJ61899AK	Alfa Aesar Paraformaldehyde, 4% in PBS
Capillary glass tube	Fisher Scientific	22-362-566	Heparinized Micro-Hematocrit Capillary Tubes
Silicone to make splints	Invitrogen Life Technologies Corp	P-18178	Press-to-Seal Silicone Sheet, 13cm x 18cm, 0.5mm thick, set of 5 sheets
Tryptic soy broth	Sigma Aldrich	22092	Culture broth
IVIS Spectrum	Perkin Elmer	124262	In vivo imaging system
IVIS Spectrum Isolation chamber	Perkin Elmer	123997	XIC-3 animal isolation chamber
HEPA filter	Teleflex	28022	Gibeck ISO-Gard HEPA Light number 28022
Biopsy punches	VWR International Inc	21909-142	Disposable Biopsy Punch, 5mm, Sterile, pack of 50.
Biopsy punches	VWR International Inc	21909-140	Disposable Biopsy Punch, 4mm, Sterile, pack of 50.
Glucose	J.T.Baker	1916-01	Dextrose, Anhydrous, Powder
Citric acid	Sigma Aldrich	C2404-100G	Citric Acid
Mastisol	Eloquest Healthcare	HRI 0496-0523-48	Mastisol Medical Liquid Adhesive 2/3 mL vial, box of 48
Corning 96-well black plates	Fisher Scientific	07-200-567	96-well clear bottom black polysterene microplates
25 gauge 5/8 inch needle	BD	305122	Regular bevel needle
Bransonic M Ultrasonic Cleaning Bath	Branson Ultrasonics	N/A	Ultrasonic Cleaner