Venha para o lado da luz: In Vivo monitoramento de infecções por Pseudomonas aeruginosa biofilme em feridas crônicas em um modelo murino Hairless diabética

Resumo

Aqui descrevemos um modelo murino diabético romance utilizando camundongos sem pelos para monitoramento em tempo real, não-invasivo, de infecções de ferida biofilme bioluminescentes Pseudomonas aeruginosa. Esse método pode ser adaptado para avaliar a infecção de outras espécies bacterianas e microrganismos geneticamente modificados, incluindo várias espécies biofilmes e testar a eficácia das estratégias de antibiofilm.

Resumo

A presença de bactérias como biofilmes estruturadas em feridas crônicas, especialmente em pacientes diabéticos, é pensada para evitar a cicatrização e resolução. Modelos de feridas crónicas do mouse têm sido utilizados para entender as interações subjacentes entre os microrganismos e o hospedeiro. Os modelos desenvolvidos até à data dependem terminal coleção de tecido da ferida para determinação de bactérias viáveis e a utilização de animais de pelo. Enquanto uma visão significativa tem sido adquirida com estes modelos, este procedimento experimental requer um grande número de animais e amostragem é demorada. Nós desenvolvemos um novo modelo murino que incorpora várias inovações ideais para avaliar a progressão do biofilme em feridas crônicas: uma) que utiliza camundongos sem pelos, eliminando a necessidade de remoção do cabelo; b) pré-formado biofilmes se aplica para as feridas que permite a avaliação imediata de persistência e o efeito destas comunidades no host; c) monitora a progressão do biofilme por quantificar a produção de luz por uma cepa bioluminescente geneticamente modificada de Pseudomonas aeruginosa, permitindo o monitoramento em tempo real da infecção, reduzindo o número de animais necessários por estudo. Neste modelo, uma única ferida cheia-profundidade é produzida na parte de trás da STZ-induzida ratos diabéticos sem pelos e inoculada com biofilmes da estirpe bioluminescente Xen 41 p. aeruginosa . Saída de luz das feridas é registrada diariamente em um na vivo sistema de imagem, permitindo a visualização de biofilme rápida in vivo e in situ e localização de bactérias do biofilme dentro as feridas. Este novo método é flexível, pois pode ser usado para estudar outros microorganismos, incluindo espécies geneticamente modificadas e biofilmes de várias espécies e podem ser de especial valor em teste antibiofilme estratégias incluindo antimicrobianos pensos oclusivos.

Introdução

Biofilmes são comunidades complexas de microorganismos incorporados numa matriz de substâncias poliméricas que destacaram-se como um fator que contribui para a resolução do pobre de feridas crónicas¹. O estudo dessas populações microbianas altamente organizado, persistente é particularmente importante para pacientes diabéticos, onde a má circulação em membros e mecanismos sensoriais periféricos alterados levar a lesões detectadas². Nos Estados Unidos, estima-se que 15% dos pacientes diabéticos desenvolverão pelo menos uma úlcera no decorrer de suas vidas. Isso se traduz em uma despesa econômica de cerca de 28 bilhões de dólares no tratamento^3,4, sem mencionar a carga emocional e social imensurável. Compreender os fatores que permitem que comunidades microbianas persistir no leito da ferida e o impacto que estes biofilmes nos eventos curativas é imperativo conduzir melhor cuidados para pacientes afetados e impulsionar o desenvolvimento de novas abordagens de tratamento. Portanto, o estabelecimento de modelos reprodutíveis e traduzíveis em vivo para explorar interações bacterianas-host é primordial.

Murino modelos foram desenvolvidos com sucesso para estudar o impacto de biofilmes em feridas crônicas. Estes modelos, no entanto, muitas vezes utilizam espécies de cabelos e avaliar afastamento de biofilme por placa contagens de células bacterianas viáveis do tecido extirpado de animais sacrificados, tornando-os, demorada e dispendiosa.

Uma alternativa de biophotonic para a amostragem de ponto de extremidade de animais na avaliação de infecção foi proposta por Contag et al. (1995) ^{5 ,} quem desenvolveu um método para capturar a luminescência de constitutivamente bioluminescentes Salmonella typhimurium para medir a eficácia do tratamento com antibióticos. Outros estudos, aproveitando-se das bactérias emitem bioluminescência seguido. Por exemplo, Rochetta et al. (2001) ⁶ validado um modelo de infecção para estudar infecções de coxa de Escherichia coli em camundongos através da medição da luminescência usando um intensificação dispositivo de carga acoplada e mais tarde, Kadurugamuwa et al. (2003) ⁷ se aproveitou do fotão emitindo Propriedades de uma engenharia cepa de Staphylococcus aureus para investigar a eficácia de vários antibióticos em um cateter modelo de ferida em ratos.

O método caracterizado aqui apresenta um protocolo simples para induzir diabetes em ratos sem pelos, produzir e inocular as feridas com biofilmes bioluminescentes pré-formado de p. aeruginosa e realizar a biophotonic monitoramento da infecção usando um na vivo sistema de imagem. Ele oferece uma direta, rápida, em situ, processo invasivo e quantitativo para avaliar biofilmes em feridas crônicas e além disso, permite análises adicionais tais como imagem microscópica da cicatrização de feridas, coleta de sangue para medições de citocinas e coleção de terminal de tecidos para a histologia.

Protocolo

experimentos com animais foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso Comitê da Michigan State University.

1. preparação de pensos oclusivos e espaçadores de Silicone

1. cortar o curativo oclusivo transparente fazer quadrados aproximadamente 1 cm x 1 cm com uma tesoura.
2. Cortar 10 milímetros círculos sobre uma folha de silicone grossa de 0,5 mm usando uma biópsia 10mm soco. centro uma biópsia de 5mm soco no meio do círculo de 10mm e pressione firmemente para criar um buraco para formar um " donut "-como o disco que será usado como uma tala.

2. animais experimentais

ratos masculinos de SKH-1

1. uso 8 semana de idade (22-26 g) de um criador comercial. Manter os ratos em condições normais de 21 ° C e um ciclo de claro-escuro de 12 h com livre acesso à comida e água.
2. Para induzir diabetes, injetar intraperitonially de ratos com um 13 mg/ml estreptozotocina (STZ) solutionand 25% glicose (250 µ l por / rato) em 5 dias consecutivos.
   1. Fazer a solução STZ por diluição 65 µ g/ml de STZ 5 µ l de ácido cítrico, pH 4,5 a 100 mM.
   2. Ajustar o volume injetado para cada rato uma massa final de 65 mg STZ por 1 kg de peso corporal de rato. Injetar o controle de ratos com pH de solução de ácido cítrico 100 mM 4.5 nos mesmos dias.
3. Confirmar a hiperglicemia monitorando sangue glicose com um glicosímetro 14 dias após a última injecção de STZ. Ratos diabéticos podem ter poliúria e, então, sua roupa de cama pode precisar ser alterada com mais frequência para eliminar umidade e seus pesos devem ser monitorizados 3 vezes por semana.

3. Biofilmes

1. preparação de biofilme
   1. de biofilmes de colônia crescer ⁸ para inocular as feridas. Dois dias antes do início da cirurgia uma cultura durante a noite de bioluminescentes p. aeruginosa Xen 41 em caldo tryptic soja (TSB) incubado a 37 ° C e agitando a 200 rpm e esterilizar os filtros de membrana de policarbonato com tamanho de poro 0,2 µm pela exposição aos raios UV luz em uma capa de segurança biológica para 15 min cada lado.
   2. Um dia antes da cirurgia centrifugar a cultura durante a noite a 20.000 x g por 2 min e lavar 3 vezes com 1 mL de Dulbelcco ' fosfato s tampão salino (DPBS) pipetando para cima e para baixo.
   3. Diluir a suspensão em DPBS para uma absorvância de 0,05 em 600 nm.
   4. Pipeta de 10 µ l da cultura diluída em cada membrana descansando num prato tryptic soy agar (TSA). Após permitir que seque, incubar as membranas a 35 ° C por 72 h a crescer biofilmes transferir para novas placas TSA cada 24 h.
2. Curva padrão
   1. antes do início do experimento, fazer uma curva padrão para correlacionar contagens de bioluminescência e bacteriano.
   2. Preparar biofilmes, conforme descrito em 3.1.
   3. Fazer diluições em série de biofilmes variando de ½ a 1/24, misturando o biofilme com DPBS e num Vortex até uma solução visualmente homogênea é produzida. Pipeta 200µL das soluções diluídas em uma placa de 96 poços preta e imagem com o na vivo sistema de imagem.
   4. Espalhar as diluições de placa em placas TSA e incubar a 35 ° C por 24 h.
   5. Contava (CFU) de unidades formadoras de placas e criar uma curva padrão para correlacionar contagens de bioluminescência e bacteriano.

4. Ferida cirurgia

1. induzir anestesia geral com isoflurano em 95% oxygen/5% CO ₂ (para evitar a morte de cetoacidose) a uma taxa de fluxo de 1 L/min e manter anestesia utilizando isoflurano 1-3%. Manter animais em esteiras de calor durante a cirurgia.
2. Garantir os reflexos profundos pedais do mouse são suprimidos por beliscar o pé com uma pinça e coloque o mouse na posição propensa.
3. Administrar meloxicam (0,2 mg/kg) através da injeção sub-cutâneo (30 μl) para controle da dor.
4. Limpe a pele das costas com 10% de iodo-povidona três vezes e um pad de isopropanol.
5. Usar um soco de biópsia de 4mm estéril para delinear um padrão circular para a ferida de um lado do mouse ' mediana de s ao nível dos ombros. Contorne o padrão com um marcador permanente.
6. Usar fórceps serrilhado para levantar a pele no meio do contorno e iris tesoura para criar uma ferida de espessura total que se estende através do tecido subcutâneo, incluindo o carnosus panículo adiposo e excisar a peça circular de tecido.
7. Aplique uma cola adesiva médica pele impermeável para a pele dos ratos e posicionar a tala do silicone, aplicando pressão suave. Cobrir a ferida com um penso oclusivo transparente. Após a cirurgia, os animais da gaiola individualmente.

5. Pós-operatórios

1. administrar meloxicam (0,2 mg/kg) uma vez por dia, através da injeção de sub-cutâneo para alívio da dor pós-operatória nos próximos 2 dias.
2. Animais monitor diariamente para manifestações de dor e perda de peso. Animais diabéticos precisam de injeções de insulina quando eles perderam 15% ou mais do peso corporal.

6. Preparação do inóculo de biofilme e infecção

1. inocular ratos 48 h após a cirurgia, conforme descrito nas etapas a seguir.
2. Raspar 72 h biofilmes de membranas usando uma espátula estéril, colocá-lo em um tubo de microcentrifugadora e diluir a 1:2 em DPBS. Mix pipetando brevemente acima e para baixo.
3. Placa de propagação inóculo em placas TSA para calcular o total CFU. Para garantir que as contagens são precisas, quebrar o inóculo de biofilme ainda mais por uma série de dois passos de 1min num Vortex intercaladas por uma etapa de sonication 2 min a 40 kHz em um líquido de limpeza ultra-sônico.
4. Remova a cobertura do curativo a ferida e silicone tala e leve uma micrografia da ferida com um microscópio com câmera anexada usando uma régua como referência.
5. Cortar as pontas das pontas de pipetas 200 µ l e pipetar 10 µ l de inóculo biofilme sobre cada ferimento.
6. Imagem do mouse usando o na vivo sistema usando configurações automática de imagens: exposição tempo s 5-300, com médio binning, 1 de f/stop e filtro aberto e campo de visão C (12,9 x 12,9 cm).
7. Tampa ferida com molho fresco.

7. Ferida a medição e a imagem latente

1. avaliar os sinais clínicos de animais diariamente ⁹.
2. Fornecer alimento, água e alterar as gaiolas conforme necessário.
3. Verificação de integridade de curativos diários. Quando o molho estiver presente, somente a bioluminescência pode ser medida devido à oclusão da ferida. No dia 8, curativos são removidos e substituídos não permitindo a medição de fechamento da ferida.
4. Pesar animais cada outro dia.
5. Para todos os dias, coloque os ratos individualmente em uma câmara de isolamento equipado com um filtro HEPA e a imagem usando o na vivo sistema de imagem diária ou a cada dois dias até que os valores de luminescência cair abaixo do nível do fundo.
6. Após dia 8, induzir anestesia geral e leve micrografias da ferida com um microscópio com câmera anexada usando uma régua como referência todos os dias até que as feridas são curadas.

8. A análise histológica

1. Euthanize os ratos com um fluxo de 2 l/min de CO ₂ em uma eutanásia câmara depois de luminescência cai abaixo dos níveis de fundo e as feridas são completamente curadas. Confirmar a morte por deslocamento cervical como um segundo método de eutanásia.
2. Use tesoura de íris para criar uma excisão completa, ampla em torno e sob a área da ferida (cerca de 1 cm de diâmetro) e preservar o tecido em paraformaldeído 4% para análise histológica.
3. Outras análises: deteção de citocina
   1. coletar sangue retrô-orbitally de animais sob anestesia, usando um tubo de vidro capilar e transferi-lo para tubos tratados com EDTA.
   2. Centrifugar o sangue a 2.000 rpm por 20 min a 4 ° C e congelar o plasma para a deteção de citocina.

Resultados

No desenvolvimento deste novo modelo, observamos muitas vantagens em utilizar sem pelos SKH-1 em camundongos C57BL/6J, que nós usamos no passado. Animais submetidos a injeções de STZ normalmente experimentam perda de peso gradual, com o aparecimento da diabetes; no entanto, na ferida cura experiências anteriormente realizado pelos nossos laboratórios reproduzindo o modelo apresentado por Dunn et al. (2012) ⁹ usando a perda de peso C57BL/6J, drástica ...

Discussão

Aqui descrevemos um novo modelo de mouse para o estudo de biofilmes em feridas diabéticas crônicas que tem muitas vantagens para criar um modelo reproduzível, traduzível e flexível.

A primeira inovação é o uso de camundongos sem pelos. Outros modelos de mouse foram desenvolvidos para estudar diabética ferida crônica cura^10,11, mas todos têm contado com o uso de ratos de cabelos que requerem a remoção de pelo por processos ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Opsite	Smith & Nephew	Model 66000041	Smith & Nephew Flexfix Opsite Transparent Adhesive Film Roll 4" x 11yards
SKH-1 mice Crl:SKH1-Hrhr	Charles River Breeding Laboratories	SKH1	Hairless mice, 8 weeks old
Streptozotocin (STZ)	Sigma Aldrich	S0130-1G	Streptozocin powder, 1g
AccuChek glucometer	Accu-Chek Roche	Art No. 05046025001	ACCU-CHEK CompactPlus Diabetes Monitoring Care Kit
Pseudomonas aeruginosa Xen 41	Perkin Elmer	119229	Bioluminescent Pseudomonas aeruginosa
Polycarbonate membrane filters	Sigma Aldrich	P9199	Millipore polycarbonate membrane filters with 0.2 μm pore size
Dulbelcco phosphate buffer saline (DPBS)	Sigma Aldrich	D8537	PBS
Tryptic soy agar	Sigma Aldrich	22091	Culture agar
Meloxicam	Henry Schein Animal Health	49755	Eloxiject (Meloxicam) 5mg/mL, solution for injection
10% povidone-iodine (Betadine)	Purdue Products LP	301879-OA	Swabstick, Betadine Solution. Antiseptic. Individ. Wrapped, 200/case
4% paraformaldehyde	Fisher Scientific	AAJ61899AK	Alfa Aesar Paraformaldehyde, 4% in PBS
Capillary glass tube	Fisher Scientific	22-362-566	Heparinized Micro-Hematocrit Capillary Tubes
Silicone to make splints	Invitrogen Life Technologies Corp	P-18178	Press-to-Seal Silicone Sheet, 13cm x 18cm, 0.5mm thick, set of 5 sheets
Tryptic soy broth	Sigma Aldrich	22092	Culture broth
IVIS Spectrum	Perkin Elmer	124262	In vivo imaging system
IVIS Spectrum Isolation chamber	Perkin Elmer	123997	XIC-3 animal isolation chamber
HEPA filter	Teleflex	28022	Gibeck ISO-Gard HEPA Light number 28022
Biopsy punches	VWR International Inc	21909-142	Disposable Biopsy Punch, 5mm, Sterile, pack of 50.
Biopsy punches	VWR International Inc	21909-140	Disposable Biopsy Punch, 4mm, Sterile, pack of 50.
Glucose	J.T.Baker	1916-01	Dextrose, Anhydrous, Powder
Citric acid	Sigma Aldrich	C2404-100G	Citric Acid
Mastisol	Eloquest Healthcare	HRI 0496-0523-48	Mastisol Medical Liquid Adhesive 2/3 mL vial, box of 48
Corning 96-well black plates	Fisher Scientific	07-200-567	96-well clear bottom black polysterene microplates
25 gauge 5/8 inch needle	BD	305122	Regular bevel needle
Bransonic M Ultrasonic Cleaning Bath	Branson Ultrasonics	N/A	Ultrasonic Cleaner