Llegado al lado de la luz: Vivo en monitoreo de Pseudomonas aeruginosa Biofilm infecciones en las heridas crónicas en un diabético sin pelo modelo murino

Resumen

Aquí describimos un nuevo modelo murino diabético utilizando ratones sin pelo en tiempo real, no invasivo, vigilancia de infecciones de la herida del biofilm de bioluminiscente Pseudomonas aeruginosa. Este método puede adaptarse para evaluar infección de otras especies de bacterias y microorganismos modificados genéticamente, como los biofilms multiespecies y comprobar la eficacia de estrategias antibiofilm.

Resumen

La presencia de bacterias como biofilms estructurados en heridas crónicas, especialmente en pacientes diabéticos, se piensa para prevenir la cicatrización y resolución. Modelos de heridas crónicas de ratón se han utilizado para entender las interacciones subyacentes entre los microorganismos y el huésped. Los modelos desarrollados hasta la fecha se basan en el uso de animales de pelo y terminal colección de tejido de la herida para la determinación de bacterias viables. Mientras que el conocimiento significativo se ha ganado con estos modelos, este procedimiento experimental requiere un gran número de animales y muestreo es desperdiciador de tiempo. Hemos desarrollado un nuevo modelo murino que incorpora varias innovaciones óptima para evaluar progresión de biofilm en heridas crónicas: un) utiliza ratones sin pelo, eliminando la necesidad de depilación; b) biopelículas preformadas se aplica a las heridas, lo que permite la evaluación inmediata de la persistencia y efecto de estas comunidades en host; c) vigila evolución biofilm mediante la cuantificación de producción de luz por una cepa bioluminiscente mediante ingeniería genética de Pseudomonas aeruginosa, que permite el monitoreo en tiempo real de la infección, reduciendo así el número de animales requeridos por el estudio. En este modelo, una sola herida de toda profundidad se produce en la espalda de ratones sin pelo diabetes inducida por STZ e inoculada con biopelículas de la cepa bioluminiscente de p. aeruginosa 41 de Xen. Salida de luz de las heridas se registra diariamente en un en vivo sistema de imagen, permitiendo una visualización rápida de biofilm en vivo y en situ y localización de biofilm de bacterias en las heridas. Este novedoso método es flexible ya que puede ser utilizado para el estudio de otros microorganismos, incluyendo especies genéticamente y biofilms multiespecies y puede ser de especial valor en la prueba anti-biofilm estrategias incluyendo antimicrobianos vendajes oclusivos.

Introducción

Los biofilms son comunidades complejas de microorganismos embebidos en una matriz de sustancias poliméricas que se han destacado como un factor que contribuye a la resolución pobre de heridas crónicas¹. El estudio de estas poblaciones microbianas altamente organizadas y persistente es particularmente importante para los pacientes diabéticos, donde la mala circulación en las extremidades y alteración mecanismos sensoriales periféricos conducen a lesiones no detectadas². En los Estados Unidos, se estima que 15% de los pacientes diabéticos desarrollará al menos una úlcera durante el curso de sus vidas. Esto se traduce en un gasto económico de cerca de 28 billones de dólares en tratamiento^3,4, por no mencionar la carga emocional y social inconmensurable. Comprender los factores que permiten a las comunidades microbianas a persistir en el lecho de la herida y el impacto de estos biofilms en los eventos de sanación es imprescindible para la mejor atención para los pacientes afectados e impulsar el desarrollo de nuevos enfoques de tratamiento. Por lo tanto, es primordial el establecimiento de modelos reproducibles y traducible en vivo para explorar las interacciones bacterianas-host.

Modelos murinos se han desarrollado con éxito para estudiar el impacto de los biofilms en heridas crónicas. Estos modelos, sin embargo, a menudo utilizan especies con pelos y evaluación el despacho de biofilm por cantidad placa de células bacterianas viables del tejido suprimido de animales sacrificados, haciéndolos lentos y costosos.

Una alternativa de la biofotónica para el muestreo de punto final de los animales en la evaluación de la infección primero fue propuesta por Contag et al. (1995) ^{5 ,} que desarrolló un método para capturar de la luminescencia de constitutivamente bioluminiscente Salmonella typhimurium para medir la eficacia del tratamiento antibiótico. Otros estudios aprovechando las bacterias emiten bioluminiscencia seguido. Por ejemplo, Rochetta et al. (2001) ⁶ validado un modelo de infección para estudiar infecciones de muslo de Escherichia coli en ratones mediante la medición de luminiscencia con un intensificado dispositivo acoplado de carga y posteriormente, Kadurugamuwa et al. (2003) ⁷ tomó ventaja del fotón emisión de propiedades de una ingeniería cepa de Staphylococcus aureus para investigar la eficacia de varios antibióticos en un modelo de catéter herida en ratones.

El método caracterizado aquí presenta un protocolo sencillo para inducir diabetes en ratones sin pelo, producir y sembrar las heridas con formadas biofilms bioluminiscentes de p. aeruginosa y biofotónica control de la infección usando un en vivo sistema de imagen. Ofrece un directo, rápido, en situ, proceso cuantitativo y no invasiva para evaluar biofilms en heridas crónicas y además, permite el análisis adicional tales como la proyección de imagen microscópica de curación de la heridas, colección de sangre intermitente para las mediciones del cytokine y colección de tejido terminal para histología.

Protocolo

experimentos con animales fueron aprobados por el cuidado de Animal institucional y Comité de uso de Michigan State University.

1. preparación de vendajes oclusivos y separadores de silicona

1. cortar el apósito oclusivo transparente hacer cuadrados aproximadamente 1 cm x 1 cm con las tijeras.
2. Corte 10 mm círculos en una hoja de silicona espesor de 0,5 mm mediante una biopsia punch. Centro de 10 mm una biopsia 5 mm perforar en el centro del círculo de 10 mm y presione firmemente para crear un orificio para formar un " dona "-como el disco que se utilizará como una tablilla de.

2. animales de experimentación

1. uso 8 semana de edad (22-26 g) ratones SKH-1 machos de un criador comercial. Mantener ratones en condiciones estándar de 21 ° C y un ciclo de luz-oscuridad de 12 h con acceso libre al alimento y al agua.
2. Para inducir diabetes, inyección intraperitoneal de ratones con una solución del streptozotocin (STZ) 13 mg/ml 25% glucosa (250 μl / ratón) durante 5 días consecutivos.
   1. Hacer la solución STZ diluyendo 65 μg de STZ en 5 μl de 100 mM ácido cítrico, pH 4.5.
   2. Ajustar el volumen inyectado para cada ratón a una masa final de 65 mg STZ por 1 kg de peso corporal de ratón. Inyectar a los ratones de control 100 mM ácido cítrico solución pH 4.5 en los mismos días.
3. Confirmar hiperglucemia por sangre monitoreo de glucosa con un glucómetro 14 días después de la última inyección de STZ. Ratones diabéticos pueden tener poliuria y así su ropa de cama puede necesitar ser cambiado más con frecuencia para eliminar la humedad y sus pesos deben ser supervisados 3 veces a la semana.

3. Biofilms

1. preparación de Biofilm
   1. crece Colonia biofilms ⁸ para inocular las heridas. Dos días antes del inicio de la cirugía una cultura noche de bioluminiscente Xen 41 en caldo de soja tríptica (TSB) de p. aeruginosa se incubó a 37 ° C y agitación a 200 rpm y esterilización de filtros de membrana de policarbonato con tamaño de poro de 0,2 μm por la exposición a los rayos UV luz en una campana de seguridad biológica durante 15 min por cada lado.
   2. Un día antes de la cirugía de centrífuga noche cultura a 20.000 x g durante 2 min y lavar 3 veces con 1 mL de Dulbelcco ' fosfato s tampón salino (DPBS) mediante pipeteo arriba y abajo.
   3. Diluir la suspensión en DPBS a una absorbancia de 0.05 a 600 nm.
   4. Pipeta 10 μl de la cultura diluida en cada membrana sobre una placa de agar (TSA) de soja tríptico. Después de dejar que se seque, incubar las membranas a 35 ° C por 72 h para crecer biofilms transfiriendo a las placas TSA frescas cada 24 h.
2. Curva estándar
   1. antes de comenzar el experimento, realizar una curva estándar para correlacionar conteo bacteriano y bioluminiscencia.
   2. Preparar los biofilms como se describe en 3.1.
   3. Hacer diluciones seriadas de biofilms que van de 1/2 a 1/24 por mezcla de biofilm con DPBS y Vortex hasta que se produce una solución visualmente homogénea. Pipeta de 200μL de las soluciones diluidas en una placa de 96 pocillos negra y la imagen con el en vivo sistema de imagen.
   4. Difundir las diluciones de placa en las placas TSA e incubar a 35 ° C durante 24 h.
   5. Contar colonias formando unidades (UFC) con placas y crear una curva estándar para correlacionar conteo bacteriano y bioluminiscencia.

4. Cirugía de la herida

1. inducir anestesia general con isoflurano en el 95% oxygen/5% CO ₂ (para evitar la muerte por cetoacidosis) con un caudal de 1 L/min y mantener la anestesia con isoflurano 1-3%. Mantener animales en esteras de calor durante la cirugía.
2. Asegurar los reflejos pedales profundo del ratón se suprimen pellizcando los pies con las pinzas y coloque el ratón en la posición propensa.
3. Administrar meloxicam (0,2 mg/kg) vía la inyección sub cutánea (30 μl) para controlar el dolor.
4. Limpiar la piel de la espalda con povidona-yodo al 10% tres veces y una almohadilla de isopropanol.
5. Utilizar un punch de biopsia estéril 4 mm para delinear un patrón circular para la herida en un lado del ratón ' línea media de la s a la altura de los hombros. El patrón del esquema con un marcador permanente.
6. Utilizar fórceps dentados para levantar la piel en el contorno y iris tijeras para crear una herida de espesor total que se extiende a través del tejido subcutáneo incluyendo el panniculus carnosus y suprimir la parte circular de tejido.
7. Aplicar un pegamento adhesivo médico piel impermeable sobre la piel de los ratones y colocar la férula de silicona aplicando presión suave. Cubrir la herida con un apósito oclusivo transparente. Después de la cirugía, la jaula individualmente los animales.

5. Postoperatorio

1. administrar meloxicam (0,2 mg/kg) una vez al día vía la inyección sub cutánea para el alivio del dolor postoperatorio durante los próximos 2 días.
2. Animales monitor todos los días de manifestaciones de dolor y pérdida de peso. Animales diabéticos necesitan inyecciones de insulina cuando han perdido 15% o más del peso corporal.

6. Preparación del inóculo de biofilm e infección

1. inocular ratones 48 h después de la cirugía, como se describe en los pasos siguientes.
2. Rascado 72 h biofilms de las membranas con una espátula estéril, colocar en un tubo de microcentrífuga y diluir 1:2 en DPBS. Mezclar mediante pipeteo brevemente arriba y abajo.
3. Placa de propagación inóculo en placas de TSA para calcular las UFC total. Para asegurar que las cuentas son exactas, romper el biofilm inóculo más por una serie de dos pasos de Vortex 1 minuto intercalados por un paso de sonicación de 2 min a 40 kHz en un limpiador ultrasónico.
4. Quitar la cubierta del apósito la herida y silicona férula y toman una micrografía de la herida con un microscopio con cámara adjunta utilizando una regla como referencia.
5. Cortar las puntas de puntas de pipeta de 200 μl y pipetee 10 μl del inóculo de biofilm en cada herida.
6. Ratón de la imagen utilizando el en vivo utilizando la configuración automática del sistema de imagen: tiempo de exposición 5-300 s, con binning mediano, 1 f/stop y filtro abierto y el campo visual C (12,9 x 12,9 cm).
7. Cubierta la herida con vendaje fresco.

7. Herida medición y proyección de imagen

1. evaluar los signos clínicos de animales diario ⁹.
2. Proporcionar alimentos, agua y cambio jaulas según sea necesario.
3. Verificación de integridad de apósitos diariamente. Cuando la preparación está presente, sólo bioluminiscencia puede ser medido debido a oclusión de la herida. En el día 8, se quitan y no sustituida que permite medición de encierro de la herida.
4. Pesar animales día.
5. Para todos los días, poner ratones individualmente en una cámara de aislamiento equipado con un filtro HEPA y el en vivo sistema de imagen todos los días o día por medio hasta valores de luminosidad inferiores a nivel de fondo de la imagen.
6. Día 8, después de inducir anestesia general y tomar fotografías de la herida con un microscopio con cámara adjunta utilizando una regla como referencia cada otro día hasta que sanen las heridas.

8. El análisis histológico

1. Euthanize los ratones con un caudal de 2 l/min de CO ₂ en una eutanasia del compartimiento después de luminiscencia cae por debajo de los niveles de fondo y las heridas se curaron completamente. Confirman muerte por dislocación cervical como un segundo método de la eutanasia.
2. Utilizar tijeras de iris para crear una supresión amplia, a todo alrededor y debajo del área de la herida (alrededor de 1 cm de diámetro) y preservar el tejido en paraformaldehído al 4% para análisis histológico.
3. Otros análisis: detección de citocinas
   1. recoger sangre retro-orbitally de animales bajo anestesia usando un tubo capilar de vidrio y transferir a tubos tratados con EDTA.
   2. Centrifugar sangre a 2.000 rpm por 20 min a 4 ° C y la congelación de plasma para la detección del cytokine.

Resultados

En el desarrollo de este nuevo modelo, observamos muchas ventajas en la utilización sin pelo SKH-1 en ratones C57BL/6J, que hemos utilizado en el pasado. Animales sometidos a inyecciones de STZ normalmente experimentan pérdida de peso gradual con la aparición de la diabetes; sin embargo, en la herida cura experimentos previamente llevó a cabo por nuestros laboratorios reproduciendo el modelo presentado por Dunn et al. (2012) ⁹ uso de pérdida de peso d...

Discusión

Aquí describimos un nuevo modelo de ratón para el estudio de biofilms en las heridas crónicas diabéticos que tiene muchas ventajas para crear un modelo flexible, reproducible y traducible.

La primera innovación es el uso de ratones sin pelo. Se han desarrollado otros modelos de ratón para el estudio de heridas crónicas diabéticos^10,11, pero todos se han basado en el uso de ratones de pelo que requieren la eliminación de la pie...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Opsite	Smith & Nephew	Model 66000041	Smith & Nephew Flexfix Opsite Transparent Adhesive Film Roll 4" x 11yards
SKH-1 mice Crl:SKH1-Hrhr	Charles River Breeding Laboratories	SKH1	Hairless mice, 8 weeks old
Streptozotocin (STZ)	Sigma Aldrich	S0130-1G	Streptozocin powder, 1g
AccuChek glucometer	Accu-Chek Roche	Art No. 05046025001	ACCU-CHEK CompactPlus Diabetes Monitoring Care Kit
Pseudomonas aeruginosa Xen 41	Perkin Elmer	119229	Bioluminescent Pseudomonas aeruginosa
Polycarbonate membrane filters	Sigma Aldrich	P9199	Millipore polycarbonate membrane filters with 0.2 μm pore size
Dulbelcco phosphate buffer saline (DPBS)	Sigma Aldrich	D8537	PBS
Tryptic soy agar	Sigma Aldrich	22091	Culture agar
Meloxicam	Henry Schein Animal Health	49755	Eloxiject (Meloxicam) 5mg/mL, solution for injection
10% povidone-iodine (Betadine)	Purdue Products LP	301879-OA	Swabstick, Betadine Solution. Antiseptic. Individ. Wrapped, 200/case
4% paraformaldehyde	Fisher Scientific	AAJ61899AK	Alfa Aesar Paraformaldehyde, 4% in PBS
Capillary glass tube	Fisher Scientific	22-362-566	Heparinized Micro-Hematocrit Capillary Tubes
Silicone to make splints	Invitrogen Life Technologies Corp	P-18178	Press-to-Seal Silicone Sheet, 13cm x 18cm, 0.5mm thick, set of 5 sheets
Tryptic soy broth	Sigma Aldrich	22092	Culture broth
IVIS Spectrum	Perkin Elmer	124262	In vivo imaging system
IVIS Spectrum Isolation chamber	Perkin Elmer	123997	XIC-3 animal isolation chamber
HEPA filter	Teleflex	28022	Gibeck ISO-Gard HEPA Light number 28022
Biopsy punches	VWR International Inc	21909-142	Disposable Biopsy Punch, 5mm, Sterile, pack of 50.
Biopsy punches	VWR International Inc	21909-140	Disposable Biopsy Punch, 4mm, Sterile, pack of 50.
Glucose	J.T.Baker	1916-01	Dextrose, Anhydrous, Powder
Citric acid	Sigma Aldrich	C2404-100G	Citric Acid
Mastisol	Eloquest Healthcare	HRI 0496-0523-48	Mastisol Medical Liquid Adhesive 2/3 mL vial, box of 48
Corning 96-well black plates	Fisher Scientific	07-200-567	96-well clear bottom black polysterene microplates
25 gauge 5/8 inch needle	BD	305122	Regular bevel needle
Bransonic M Ultrasonic Cleaning Bath	Branson Ultrasonics	N/A	Ultrasonic Cleaner