Işık tarafa: In Vivo izleme bir diyabetik tüysüz fare modelinde kronik yaralarda Pseudomonas aeruginosa biyofilm enfeksiyonların

Özet

Burada gerçek zamanlı, non-invaziv, kollarındaki Pseudomonas aeruginosabiyofilm yara enfeksiyonları izleme için tüysüz fareler kullanan bir roman diyabetik fare modeli açıklar. Bu yöntem diğer bakteri ve genetiği değiştirilmiş mikroorganizmalar, çoklu türler biyofilmler, dahil olmak üzere enfeksiyon değerlendirmek ve antibiofilm stratejileri etkinliğini test etmek için adapte edilebilir.

Özet

Bakteri varlığı olarak yapılandırılmış biyofilmler özellikle diyabetik hastalarda kronik yaralarda yara iyileşmesi ve çözünürlük önlemek düşünülmektedir. Kronik fare yaralar modelleri mikroorganizmalar ile ana bilgisayar arasındaki temel etkileşimleri anlamak için kullanılmaktadır. Bugüne kadar geliştirilen modelleri tüylü hayvanlar kullanımı ve uygun bakteri tespiti için yara dokusunun terminal koleksiyonu güveniyor. Bu modellerde önemli anlayış kazanmıştır, bu deneysel bir işlem çok sayıda hayvan gerektirir ve örnekleme zaman alıcıdır. Kronik yaralarda biyofilm ilerlemeyi değerlendirmek için birçok en iyi yenilik içermektedir roman bir fare modeli geliştirdik: bir) tüysüz fareler, epilasyon; ihtiyacını ortadan kaldırarak kullanır b) önceden biçimlendirilmiş biyofilmler sunan sebat hemen değerlendirilmesi ve bu toplulukların ana bilgisayar üzerindeki etkisini yaralar için geçerlidir; c) biyofilm ilerleme Pseudomonas aeruginosaböylece hayvan çalışma gerekli sayısını azaltarak enfeksiyon gerçek zamanlı izleme sağlayan, bir genetik kollarındaki suşu tarafından ışık üretim miktarının tarafından izler. Bu modelde, tek bir tam-derinlik yara STZ-indüklenen diyabetik tüysüz fareler arkasında üretilen ve P. aeruginosa kollarındaki yük Xen 41 biyofilmler ile aşılanmış. Yaraları hafif çıktı günlük görüntüleme sistemi, in vivo ve in situ hızlı biyofilm görselleştirme ve yerelleştirme biyofilm bakteri içinde yaralar için izin bir vivo kaydedilir. Diğer mikroorganizmaların genetik türler ve çoklu türler biyofilmler, dahil olmak üzere, çalışma için kullanılan ve test anti-biyofilm stratejileri antimikrobiyal tıkayıcı sosları da dahil olmak üzere özel değeri olabilir roman bu yöntem esnektir.

Giriş

Biyofilmler kronik yaralar¹zavallı çözümlenmesi için bir faktör olarak vurgulanmış polimer maddelerin bir matris gömülü mikroorganizmaların karmaşık toplulukları bulunmaktadır. Bu son derece organize, kalıcı mikrobiyal nüfus özellikle bacaklarda ve değiştirilmiş çevresel duyusal mekanizmalar zayıf kan dolaşımı undetected lezyonlar²' ye nereye Diyabetik hastalar için önemli bir çalışmadır. Amerika Birleşik Devletleri'nde bu diyabetik hastaların % 15 hayatları boyunca en az bir ülser gelişecektir tahmin edilmektedir. Bu tedavi^3,4, 28 milyar dolar civarında bir ekonomik harcama immensurable duygusal ve sosyal yükünü saymıyorum çevirir. Mikrobiyal topluluklar yara yatak ve şifa olaylarda bu biyofilmler etkisi kalıcı olması izin faktörleri anlamak daha iyi bakımı etkilenen hastalar için sürücü ve yeni tedavi yaklaşımları gelişimi itmek için zorunludur. Bu nedenle, bakteriyel konak etkileşimleri keşfetmek için tekrarlanabilir ve çevrilebilir vivo içinde modeller kurulması her şeyden önemlidir.

Fare modelleri başarıyla biyofilmler kronik yaralarda etkisini incelemek için geliştirilmiştir. Bu modeller ancak, sık sık saçlı tür kullanmak ve bakteriyel hücrelerin onları zaman alıcı ve pahalı hale kurban hayvanlardan çıkarılan doku için plaka sayar tarafından biyofilm izni değerlendirmek.

Bitiş noktası örnekleme enfeksiyon değerlendirilmesinde hayvanların bir biophotonic alternatif ilk Contag ve arktarafından önerilmiş. (1995) ^{5 ,} kim ışıldama antibiyotik tedavisi etkinliği ölçmek için yapısal kollarındaki Salmonella typhimurium sayfasından yakalamak için bir yöntem geliştirdi. Bioluminescence verilirken bakteri yararlanarak diğer çalışmalar izledi. Örneğin, Rochetta ve ark. (2001) ⁶ doğrulanmış yoğun bir şarj kuplajlı cihaz kullanarak ışıldama ölçerek Escherichia coli uyluk enfeksiyonlar farelerde çalışmaya bir enfeksiyon modeli ve daha sonra Kadurugamuwa ve ark. (2003) ⁷ farelerde bir kateter yara modelinde çeşitli antibiyotiklerin etkinliğini araştırmak için Staphylococcus aureus mühendislik bir tür özelliklerini yayan foton kullandı.

Burada karakterize yöntemini diyabet tüysüz farelerde ikna etmek, üretmek ve P. aeruginosa, önceden biçimlendirilmiş kollarındaki biyofilmler yaralarıyla aşılamak ve biophotonic enfeksiyon kontrolü yapmak için basit bir protokol sunar görüntüleme sistemi bir vivo içinde kullanma. O teklif etmek yolu tarif etmek, hızlı, in situ, biyofilmler kronik yaralarda değerlendirmek için non-invaziv ve nicel süreç ve yara iyileşme mikroskobik görüntüleme gibi aralıklı kan toplama için buna ek olarak, ek analiz için sağlar sitokin ölçümleri ve Histoloji terminal dokusu toplamalarında.

Protokol

hayvan deneyleri kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi Michigan State University tarafından onaylanmış.

1. hazırlık tıkayıcı sosları ve silikon çubukları

1. şeffaf tıkayıcı soyunma kesmek yapmak için yaklaşık 1 cm x 1 cm makasla kareler.
2. Kes 10 mm daire bir 10 mm biyopsi yumruk. 5 mm biyopsi Merkezi'yle 0,5 mm kalın silikon sayfadaki yumruk 10 mm çemberin ortasında ve sıkıca forma bir delik oluşturmak için basın bir " poğaça "-alçıya kullanılacak disk gibi.

2. deneysel hayvan

1. kullanımı (22-26 g) 8 hafta eski erkek SKH-1 fare--dan bir ticari doğurmak. Fareler yiyecek ve su için 21 ° C ve 12 h koyu döngüsü ücretsiz erişim ile standart koşullar unutmayın.
2. Diyabet ikna etmek için fare intraperitonially bir 13 mg/ml streptozotocin (STZ) solutionand % 25 ile enjekte glikoz (başına 250 µl / fare) üzerinde 5 gün üst üste.
   1. Tarafından 100 mm sitrik asit, pH 4.5 5 µL 65 µg sulandrarak STZ, STZ çözüm olun.
   2. Her fare fare vücut ağırlığı 1 kg başına 65 mg STZ son bir kitle için enjekte ses düzeyini ayarlamak. Denetim fare 100 mM sitrik asit çözüm pH 4.5 ile aynı günlerde enjekte.
3. Kan şekeri Şeker Ölçüm ile 14 gün sonra son STZ enjeksiyon izleyerek hiperglisemi onaylayın. Diyabetik farelerin polyuria olabilir ve bu yüzden onların yatak ıslaklık ortadan kaldırmak için daha sık değiştirilmesi gerekebilir ve onların ağırlık haftada 3 kez izlenmelidir.

3. Biyofilmler

1. biyofilm hazırlık
   1. yara aşılamak için Grow koloni biyofilmler ⁸. İki gün önce ameliyat başlangıç kollarındaki bir gecede kültür P. aeruginosa Xen tryptic soya suyu (TSB) 41 37 ° C'de inkübe ve 200 devir / dakikada sallayarak ve UV maruz polikarbonat membran filtreleri 0.2 µm gözenek boyutu ile sterilize biyolojik Emanet başlıklı yan başına 15 dakika ışık.
   2. Bir gün ameliyat öncesi santrifüj kapasitesi 20.000 x g 2 min için de gecede kültür ve yıkama Dulbelcco ile 3 kez 1 mL ' s fosfat tamponlu tuz çözeltisi (DPBS) tarafından yukarı ve aşağı pipetting.
   3. Seyreltik DPBS süspansiyon için bir Absorbans 0,05 600 nm.
   4. Pipet 10 µL seyreltilmiş kültür tryptic soya agar (TSA) tabağa dinlenme her membran üzerinde. Kurumaya bırakmak sonra taze TSA tabakaları bana her 24 h aktarma biyofilmler büyümeye 72 h için 35 ° C'de membranlar kuluçkaya
2. Standart eğri
   1. deneme başlamadan önce bioluminescence ve bakteriyel sayar ilişkilendirmek için standart bir eğri olun.
   2. Biyofilmler 3,1 açıklandığı şekilde hazırlayın.
   3. Görsel olarak homojen bir çözüm üretilir kadar biyofilm DPBS ve vortexing ile karıştırarak 1/24 için ½ değişen biyofilmler seri dilutions olun. Pipet 200µL bir siyah 96-şey plaka ve resim görüntüleme sistemi içinde vivo ile seyreltilmiş çözüm.
   4. Plaka dilutions TSA levha üzerine yayıldı ve 35 ° c 24 h için kuluçkaya
   5. Birimleri (CFU) oluşturan colony tabakalarına kadar sayıp bioluminescence ve bakteriyel sayar ilişkilendirmek için standart bir eğri oluşturmak.

4. Ameliyat yarası

1. 1 L/dak Debi genel anestezi (ketoasidoz ölüm önlemek için) % 95 oxygen/5% CO ₂ ' isoflurane kullanarak teşvik ve % 1-3 isoflurane kullanarak anestezi korumak. Hayvanlar üzerinde ısı paspaslar ameliyat sırasında korumak.
2. Fare derin pedal refleksleri cımbız ile ayak pinching tarafından bastırılır ve yüzükoyun sígara fareyi getirin olun.
3. Ağrı yönetimi için alt Kutanöz enjeksiyon (30 μl) üzerinden Meloksikam (0.2 mg/kg) yönetmek.
4. % 10 povidone-iyot üç kez arka ve bir isopropanol paneli deri silin.
5. Dairesel model fare bir tarafta yara için anahat için bir steril 4 mm biyopsi yumruk kullanın ' s orta hat omuzlar düzeyinde. Desen ile kalıcı bir kalem anahat.
6. Panniculus carnosus de dahil olmak üzere subkutan doku ile uzanan bir tam-kalınlık yara oluşturmak ve doku dairesel parça tüketim için anahat ve Iris makas ortasında deri kaldırmak için tırtıklı forseps kullanın.
7. Tıbbi su geçirmez deri yapıştırıcı tutkal fareler kaplamasına uygulamak ve hafif basınç uygulayarak silikon tahta getirin. Şeffaf bir tıkayıcı soyunma yarayla kapsar. Ameliyattan sonra tek tek hayvanlar kafese.

5. Ameliyat sonrası yönetim

1. Meloksikam (0.2 mg/kg) günde bir kez alt Kutanöz enjeksiyon yoluyla önümüzdeki 2 gün için ameliyat sonrası ağrı yönetmek.
2. Monitör hayvanlar günlük ağrı ve kilo kaybı belirtileri için. Diyabetik hayvan lüzum insülin iğneleri ne zaman % 15 veya daha fazla vücut ağırlığının kaybettiler.

6. Biyofilm Inoculum hazırlanması ve enfeksiyon

1. fareler 48 h ameliyattan sonra aşağıdaki adımlarda açıklandığı gibi aşılamak.
2. Kazımak 72 h biyofilmler steril bir spatula kullanarak membranlar üzerinden bir microcentrifuge tüpü yerleştirin ve 1:2 DPBS'sulandırmak. Kısa bir süre yukarı ve aşağı pipetting tarafından Mix.
Toplam CFU hesaplamak için TSA plakalar üzerine
3. yayılan plaka inoculum. Sayıları doğru olduğundan emin olmak için bir dizi iki 1 dk vortexing adım adım bir 2 dk sonication 40 kHz ultrasonik bir süpürge ara biyofilm inoculum daha fazla kır.
4. Yara ve silikon sabitleyecek ve başvuru için bir cetvel kullanarak ekli fotoğraf makinesi ile mikroskop yarayla bir test almak soyunma kaplama kaldırmak.
5. 200 µL pipet ipuçları ipuçları kesmek ve biyofilm inoculum her yaranın üzerine 10 µL pipet.
6. Görüntüleme sistemi otomatik ayarlarla vivo içinde kullanarak görüntü fare: Pozlama süresi 5-300 s, orta binning, 1 f/stop ve açık filtre ve görüş alanı C ile (12.9 cm x 12,9 cm).
7. Kapak yara ile taze soyunma.

7. Yara ölçüm ve görüntüleme

1. hayvanlar günlük ⁹ klinik belirtileri değerlendirmek.
2. Yiyecek, su ve kafesleri gerektiği gibi değiştirin.
Her gün pansuman
3. onay bütünlüğünü. Soyunma olmadığı durumlarda, sadece bioluminescence yara tıkanıklığı nedeniyle ölçülebilir. Gün 8, sosları kaldırılır ve yara kapatma izin ölçüm yerine değil.
4. Her gün hayvanlar tartmak.
5. Tüm gün için fareler tek tek bir tecrit odasında yeri görüntü görüntüleme sistemi günlük veya arka plan seviyenin ışıldama değerleri düşmek kadar her gün içinde vivo kullanarak bir HEPA filtre ile donatılmıştır.
6. Gün 8 sonra genel anestezi teşvik ve filmler bir mikroskop ile yara yara iyileşene kadar her gün başvuru için bir cetvel kullanarak ekli kamerayla çekebilir.

8. Histolojik analizi

1. 2 l/min CO ₂ bir ötenazi bir akışı ile fareler odası ışıldama arka plan düzeyin altına düşer ve yaralar tamamen iyile_melerinin sonra Euthanize. Ölüm ötenazi ikinci bir yöntem olarak servikal çıkığı tarafından onaylayın.
2. Geniş, tam eksizyon çevresinde ve yara alan (yaklaşık 1 cm çapında) altındaki oluşturmak ve histolojik analizler için %4 paraformaldehyde dokusunda korumak için Iris makas kullanın.
3. Diğer analiz: sitokin algılama
   1. toplamak kan retro-orbitally kılcal cam tüp kullanarak anestezi altında hayvanlardan ve EDTA tedavi tüpler için transfer.
   2. Santrifüj kapasitesi 4 ° C'de 20 dk için 2.000 devirde kan ve plazma sitokin hafiye için kımıldama.

Sonuçlar

Bu yeni modeli geliştirirken, biz geçmişte kullanmış C57BL/6J fareler üzerinde tüysüz SKH-1 kullanarak pek çok avantajı gözlenen. Hayvanlar STZ enjeksiyonlar için normalde tabi yavaş yavaş kilo kaybı diyabet başlangıcı ile deneyim; Ancak, yarada deneyler şifa daha önce laboratuarlarımızda Dunn ve arktarafından sunulan modeli üreten tarafından yürütülen. (2012) ⁹ -C57BL/6J, şiddetli kilo kaybı kullanımı (...

Tartışmalar

Burada bir tekrarlanabilir, çevrilebilir ve esnek model oluşturmak için pek çok avantajı vardır biyofilmler diyabetik kronik yaralarda çalışma için yeni bir fare modeli açıklar.

İlk yenilik tüysüz fareler kullanmaktır. Diğer fare modelleri^10,11şifa diyabetik kronik yara incelemek için geliştirilmiştir, ama tüm ağda veya saç kırpma ile birlikte ilgili işlemler tarafından kürk kaldırılmasını gerektiren sa?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Opsite	Smith & Nephew	Model 66000041	Smith & Nephew Flexfix Opsite Transparent Adhesive Film Roll 4" x 11yards
SKH-1 mice Crl:SKH1-Hrhr	Charles River Breeding Laboratories	SKH1	Hairless mice, 8 weeks old
Streptozotocin (STZ)	Sigma Aldrich	S0130-1G	Streptozocin powder, 1g
AccuChek glucometer	Accu-Chek Roche	Art No. 05046025001	ACCU-CHEK CompactPlus Diabetes Monitoring Care Kit
Pseudomonas aeruginosa Xen 41	Perkin Elmer	119229	Bioluminescent Pseudomonas aeruginosa
Polycarbonate membrane filters	Sigma Aldrich	P9199	Millipore polycarbonate membrane filters with 0.2 μm pore size
Dulbelcco phosphate buffer saline (DPBS)	Sigma Aldrich	D8537	PBS
Tryptic soy agar	Sigma Aldrich	22091	Culture agar
Meloxicam	Henry Schein Animal Health	49755	Eloxiject (Meloxicam) 5mg/mL, solution for injection
10% povidone-iodine (Betadine)	Purdue Products LP	301879-OA	Swabstick, Betadine Solution. Antiseptic. Individ. Wrapped, 200/case
4% paraformaldehyde	Fisher Scientific	AAJ61899AK	Alfa Aesar Paraformaldehyde, 4% in PBS
Capillary glass tube	Fisher Scientific	22-362-566	Heparinized Micro-Hematocrit Capillary Tubes
Silicone to make splints	Invitrogen Life Technologies Corp	P-18178	Press-to-Seal Silicone Sheet, 13cm x 18cm, 0.5mm thick, set of 5 sheets
Tryptic soy broth	Sigma Aldrich	22092	Culture broth
IVIS Spectrum	Perkin Elmer	124262	In vivo imaging system
IVIS Spectrum Isolation chamber	Perkin Elmer	123997	XIC-3 animal isolation chamber
HEPA filter	Teleflex	28022	Gibeck ISO-Gard HEPA Light number 28022
Biopsy punches	VWR International Inc	21909-142	Disposable Biopsy Punch, 5mm, Sterile, pack of 50.
Biopsy punches	VWR International Inc	21909-140	Disposable Biopsy Punch, 4mm, Sterile, pack of 50.
Glucose	J.T.Baker	1916-01	Dextrose, Anhydrous, Powder
Citric acid	Sigma Aldrich	C2404-100G	Citric Acid
Mastisol	Eloquest Healthcare	HRI 0496-0523-48	Mastisol Medical Liquid Adhesive 2/3 mL vial, box of 48
Corning 96-well black plates	Fisher Scientific	07-200-567	96-well clear bottom black polysterene microplates
25 gauge 5/8 inch needle	BD	305122	Regular bevel needle
Bransonic M Ultrasonic Cleaning Bath	Branson Ultrasonics	N/A	Ultrasonic Cleaner