Приходите в сторону света: В Vivo мониторинг Pseudomonas aeruginosa биопленки инфекций, хронических ран в диабетической голые мышиных модели

Резюме

Здесь мы описываем Роман Диабетическая мышиных модель, используя лысых мышей мониторинга в реальном времени, неинвазивный, биопленки раневые инфекции биолюминесцентных синегнойной палочки. Этот метод может быть адаптирована к инфекции других бактериальных видов и генетически измененных микроорганизмов, в том числе многовидового биопленки, оценить и протестировать эффективность стратегий antibiofilm.

Аннотация

Считается, что наличие бактерий как структурированных биопленки в хронических ран, особенно у больных сахарным диабетом, предотвращения заживление ран и резолюции. Хронический мыши раны модели были использованы для понимания основных взаимодействий между микроорганизмы и принимающей. Модели, разработанные к настоящему времени полагаются на использование волосами животных и терминал сбора ткани раны для определения жизнеспособных бактерий. В то время как значительное понимание был накоплен с этими моделями, эта экспериментальная процедура требует большое количество животных и выборки отнимает много времени. Мы разработали Роман мышиных модель, которая включает несколько оптимальных инноваций для оценки биопленки прогрессирования хронической раны:) он использует лысых мышей, устраняя необходимость удаления волос; b) применяет предварительно сформированных биопленки на раны, позволяя для непосредственной оценки стойкости и эффект этих общин на узле; c) контролирует биопленки прогрессии, количественного определения света производства путем генной инженерии биолюминесцентных штамм Pseudomonas aeruginosa, позволяя мониторинг в реальном времени заражения, тем самым уменьшая количество животных, требуется для каждого исследования. В этой модели одной полную глубину раны производится на задней части СТЗ индуцированной сахарным диабетом лысых мышей и привиты с биопленки биолюминесцентных штамм P. aeruginosa Xen 41. Ежедневно в в естественных условиях изображений системы, позволяющие в естественных условиях и в situ быстрого биопленки визуализации и локализации биопленки бактерий в пределах раны записывается светоотдачи от ран. Этот новый метод является гибким, как он может использоваться для изучения других микроорганизмов, в том числе генетически модифицированных видов и многовидового биопленки и может иметь особое значение в тестировании анти биопленки стратегий, включая антимикробной окклюзионной повязки.

Введение

Биоплёнки являются сложные сообществ микроорганизмов, внедренные в матрицу, полимерных веществ, которые выделены в качестве фактора для бедных решения хронических ран¹. Изучение этих высокоорганизованных, постоянные микробного населения особенно важно для больных сахарным диабетом, где плохое кровообращение конечностей и изменены периферической сенсорной механизмы привести к незамеченными поражений². Согласно оценкам, в Соединенных Штатах, что 15% больных сахарным диабетом будет развиваться по крайней мере один из желудка в течение их жизни. Это приводит к экономических расходов около 28 млрд долларов на лечение^3,4, не упоминать immensurable эмоциональное и социальное бремя. Понимание факторов, которые позволяют микробных сообществ упорствовать в рану кровать и то влияние, которое эти биоплёнки имеют в лечебных мероприятий необходимо управлять лучший уход для пострадавших пациентов и стимулирования разработки новых подходов к лечению. Таким образом создание воспроизводимых и переводимых в vivo моделей для изучения взаимодействия бактерий хост имеет первостепенное значение.

Мышиных моделях была успешно разработана для изучения влияния биопленки в хронических ран. Однако, эти модели, часто используют волосатая видов и оценивать биопленки Распродажа, плиты счетчики для жизнеспособных бактериальных клеток подакцизным ткани от жертвенных животных, делая их трудоемким и дорогостоящим.

Биофотонный альтернативой конечной точки выборки животных в оценке инфекции была впервые предложена КОНТАГ и др. (1995) ^{5 ,} кто разработал метод для захвата люминесценции от конститутивно биолюминесцентных Salmonella typhimurium для измерения эффективности лечения антибиотиками. Другие исследования, воспользовавшись биолюминесценции излучающих бактерий последовали за. К примеру, предлагает и др. (2001) ⁶ проверка инфекции модель для изучения бедра инфекции Escherichia coli у мышей путем измерения люминесценции с помощью активизации зарядовой и позднее, Kadurugamuwa и др. (2003) ⁷ воспользовался фотон, излучающие свойства инженерии штамма золотистого стафилококка , чтобы исследовать эффективность нескольких антибиотиков в катетер рану модели мышей.

Этот метод характеризуется здесь представляет простой протокол вызвать диабет в лысых мышей, производить и прививать раны с предварительно сформированных биолюминесцентных биоплёнки P. aeruginosa, и проводить мониторинг Биофотонный инфекции использование в vivo imaging системы. Он предлагает прямой, быстрого, в месте, неинвазивная и количественный процесс оценки биопленки в хронических ран и Кроме того, позволяет для дополнительного анализа, такие как микроскопических изображений заживление раны, прерывистый крови коллекции для цитокинов измерения и терминал ткани коллекции для гистологии.

протокол

эксперименты на животных были утверждены институциональный уход животных и использование Комитета Мичиганского государственного университета.

1. Подготовка окклюзионной повязки и силиконовые прокладки

1. Вырезать прозрачный окклюзионной повязки сделать квадраты примерно 1 см x 1 см ножницами.
2. Вырезать 10 мм круги на 0,5 мм толщиной силиконовые листа с помощью биопсии 10 мм Панч. центра биопсии 5 мм punch в середине круг 10 мм и нажмите твердо для создания отверстия в форме " пончик "-как диск, который будет использоваться в качестве шины.

2. подопытных животных

1. использования 8 неделя старый (22-26 g) мышей-самцов SKH-1 от коммерческих заводчика. Держите мышь в стандартных условиях 21 ° C и 12 h свето тени цикл с свободный доступ к продовольствию и воде.
2. Вызвать диабет, придать intraperitonially мышей с 13 мг/мл Стрептозотоцин (СТЗ) решениеИ 25% глюкозы (250 мкл в / мышь) на 5 дней подряд.
   1. Сделать СТЗ решения путем разбавления 65 мкг СТЗ в 5 мкл, 100 мм лимонной кислоты, pH 4.5.
   2. Вводят громкости для каждой мыши для окончательного массой 65 мг СТЗ на 1 кг массы тела мыши. Внедрить контроль мышей с 100 мм лимонной кислоты раствор pH 4.5 в те же дни.
3. Крови глюкозы с глюкометр 14 дней после последнего введения СТЗ для подтверждения гипергликемии. Диабетических мышей может иметь полиурия и поэтому их постельные принадлежности может потребоваться более часто менять для ликвидации влаги и их весов должно контролироваться 3 раза в неделю.

3. Биоплёнки

1. биопленки подготовки
   1. растут колонии биоплёнки ⁸ для инокуляции раны. За два дня до начала операции на ночь культуры биолюминесцентных P. aeruginosa Xen в tryptic соевый бульон (TSB) 41 инкубировали при 37 ° C и тряски на 200 об/мин и стерилизовать поликарбоната мембранные фильтры с 0,2 мкм поры под воздействием УФ свет в капюшоне биологической безопасности 15 мин в стороне.
   2. За один день до хирургии центрифуга ночь культуры на 20000 x g на 2 мин и мыть 3 раза с 1 мл Dulbelcco ' s фосфат буфер солевой раствор (DPBS), закупорить вверх и вниз.
   3. Развести подвеска в DPBS для поглощения 0,05 на 600 Нм.
   4. Пипетки 10 мкл разбавленного культуры на каждом мембраны, отдыхая на плите tryptic соевый агар (TSA). После позволяя высохнуть, инкубации мембран при 35 ° C для 72 h расти биоплёнки передачи свежие TSA тарелки каждые 24 ч.
2. Калибровочной кривой
   1. до начала эксперимента сделать стандартной кривой соотнести биолюминесценции и бактериальных графов.
   2. Подготовить биопленки, как описано в пункте 3.1.
   3. Сделать серийных разведений биоплёнки, начиная от ½ до 1/24, смешивая биопленки с DPBS и vortexing до тех пор, пока производится визуально однородных решений. Дозатор 200µL разбавленных растворов в черный 96-луночных пластины и изображения с в vivo imaging системы.
   4. Распространения пластины разведений на TSA пластин и Инкубируйте на 35 ° C в течение 24 ч.
   5. Рассчитывать колонии, образуя единиц (CFU) на тарелках и создания стандартной кривой соотнести биолюминесценции и бактериальных графов.

4. Ранение хирургии

1. вызвать общий наркоз, используя изофлюрановая в 95% oxygen/5% CO ₂ (для предупреждения смерти от кетоацидоз) со скоростью потока 1 Л/мин и поддержания анестезии, с помощью изофлюрановая 1-3%. Сохранить животных на циновках тепла во время хирургии.
2. Обеспечить глубокий педали рефлексы мыши подавляются путем сжимать ноги с помощью пинцета и поместите указатель мыши в лежачем положении.
3. Администрирование мелоксикам (0,2 мг/кг) через подкожной инъекции (30 мкл) для управления боли.
4. Протрите кожу спины с 10% повидон йод три раза и площадку изопропаноле.
5. Использовать стерильные 4 мм биопсии удар наметить один круговой узор для раны на одной стороне мыши ' s срединной линии на уровне плеч. Определить шаблон с постоянным маркером.
6. Использовать зубчатый щипцы подтянуть кожу в середине наброски и Ирис ножницы для создания полного толщина рану, которая простирается через подкожной клетчатки, включая carnosus подкожной и акцизный круговой кусочек ткани.
7. Медицинский водонепроницаемый кожи клей клей наносится на кожу мышей и положение силиконовые шину, применяя мягкое давление. Покрывают рану с прозрачной окклюзионной повязки. После операции, индивидуально клетки животных.

5. Послеоперационное управление

1. Администрирование мелоксикам (0,2 мг/кг) один раз в день через подкожной инъекции для послеоперационной боли в течение 2 дней.
2. Монитор животных ежедневно для проявления боль и потерю веса. Диабетической животных нужно инъекции инсулина, когда они потеряли 15% или более от веса тела.

6. Подготовка посевным материалом биопленки и инфекции

1. инокуляции мышей 48 ч после операции, как описано в следующих шагах.
2. Скрип 72 h биопленок от мембраны, с помощью стерильных шпателя, поместите его в пробки microcentrifuge и разбавить 1:2 в DPBS. Микс, кратко закупорить вверх и вниз.
3. Распространение пластины посевным материалом на TSA пластин для вычисления общей кое. Чтобы гарантировать точное количество, сломать биопленки посевным материалом далее, ряд двух шагов 1 мин vortexing, интеркалированного sonication шаг 2 мин 40 кГц в ультразвуковой очистки.
4. Удаление Туалетная покрытие раны и силиконовые шину и принять Микрофотография раны с помощью микроскопа с подключенной камеры с помощью линейки для справки.
5. Сократить советы 200 мкл наконечники и Пипетка 10 мкл биопленки посевным материалом на каждой раны.
6. Изображение мыши, используя в vivo imaging системы с помощью автоматической настройки: Выдержка времени s 5-300, с среднего биннинга, 1 f/stop и открыть фильтр и поле зрения C (12,9 x 12,9 см).
7. Крышка раны с соусом из свежей.

7. Рану измерения и визуализации

1. оценивать клинические признаки животных ежедневно ⁹.
2. Предоставления продовольствия, воды и при необходимости измените клетки.
3. Проверки целостности повязок ежедневно. Когда соус присутствует, только биолюминесценции может быть измерена вследствие окклюзии раны. На 8 день, удаляются и не заменил позволяет измерение закрытия ран.
4. Весят животных каждый день.
5. Для всех дней, место мышей индивидуально в камеру изоляции оснащен фильтром HEPA и изображения с помощью в vivo imaging системы, ежедневно или через день, до тех пор, пока значения свечения падает ниже уровня фона.
6. После 8 день, вызвать общий наркоз и взять микроскопии раны с помощью микроскопа с подключенной камеры с помощью линейки для ссылки каждый день до заживления раны.

8. Гистологический анализ

1. Euthanize мышей с потоком 2 л/мин CO ₂ в эвтаназии камеры после свечения падает ниже фоновых уровней и раны полностью исцелен. Подтвердить смерть шейки матки дислокации как второй метод эвтаназии.
2. Использовать Ирис ножницы для создания широкого, полное иссечение вокруг и под области раны (около 1 см в диаметре) и сохранить ткани в параформальдегида 4% для гистологического анализа.
3. Другие анализа: определение цитокинов
   1. ретро орбитально сбор крови от животных под наркозом с использованием капиллярной стеклянной трубки и перенести его на лечение ЭДТА трубы.
   2. Центрифуга крови при 2000 об/мин в течение 20 минут при температуре 4 ° C и замораживания плазмы для обнаружения цитокина.

Результаты

В разработке этой новой модели, мы наблюдали много преимуществ в использовании голые SKH-1 над мышей C57BL/6J, которые мы использовали в прошлом. Животные обычно подвергается СТЗ инъекции опыт постепенного похудения с наступлением диабета; Однако в рану исцеление экспериме...

Обсуждение

Здесь мы опишем новую модель мыши для изучения биопленки в диабетической хронических ран, который имеет много преимуществ для создания воспроизводимых, переводимые и гибкие модели.

Первый инновации является использование лысых мышей. Другие мыши модели были разработан...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Opsite	Smith & Nephew	Model 66000041	Smith & Nephew Flexfix Opsite Transparent Adhesive Film Roll 4" x 11yards
SKH-1 mice Crl:SKH1-Hrhr	Charles River Breeding Laboratories	SKH1	Hairless mice, 8 weeks old
Streptozotocin (STZ)	Sigma Aldrich	S0130-1G	Streptozocin powder, 1g
AccuChek glucometer	Accu-Chek Roche	Art No. 05046025001	ACCU-CHEK CompactPlus Diabetes Monitoring Care Kit
Pseudomonas aeruginosa Xen 41	Perkin Elmer	119229	Bioluminescent Pseudomonas aeruginosa
Polycarbonate membrane filters	Sigma Aldrich	P9199	Millipore polycarbonate membrane filters with 0.2 μm pore size
Dulbelcco phosphate buffer saline (DPBS)	Sigma Aldrich	D8537	PBS
Tryptic soy agar	Sigma Aldrich	22091	Culture agar
Meloxicam	Henry Schein Animal Health	49755	Eloxiject (Meloxicam) 5mg/mL, solution for injection
10% povidone-iodine (Betadine)	Purdue Products LP	301879-OA	Swabstick, Betadine Solution. Antiseptic. Individ. Wrapped, 200/case
4% paraformaldehyde	Fisher Scientific	AAJ61899AK	Alfa Aesar Paraformaldehyde, 4% in PBS
Capillary glass tube	Fisher Scientific	22-362-566	Heparinized Micro-Hematocrit Capillary Tubes
Silicone to make splints	Invitrogen Life Technologies Corp	P-18178	Press-to-Seal Silicone Sheet, 13cm x 18cm, 0.5mm thick, set of 5 sheets
Tryptic soy broth	Sigma Aldrich	22092	Culture broth
IVIS Spectrum	Perkin Elmer	124262	In vivo imaging system
IVIS Spectrum Isolation chamber	Perkin Elmer	123997	XIC-3 animal isolation chamber
HEPA filter	Teleflex	28022	Gibeck ISO-Gard HEPA Light number 28022
Biopsy punches	VWR International Inc	21909-142	Disposable Biopsy Punch, 5mm, Sterile, pack of 50.
Biopsy punches	VWR International Inc	21909-140	Disposable Biopsy Punch, 4mm, Sterile, pack of 50.
Glucose	J.T.Baker	1916-01	Dextrose, Anhydrous, Powder
Citric acid	Sigma Aldrich	C2404-100G	Citric Acid
Mastisol	Eloquest Healthcare	HRI 0496-0523-48	Mastisol Medical Liquid Adhesive 2/3 mL vial, box of 48
Corning 96-well black plates	Fisher Scientific	07-200-567	96-well clear bottom black polysterene microplates
25 gauge 5/8 inch needle	BD	305122	Regular bevel needle
Bransonic M Ultrasonic Cleaning Bath	Branson Ultrasonics	N/A	Ultrasonic Cleaner