Venez sur le côté de la lumière: In Vivo surveillance des Infections à Pseudomonas aeruginosa Biofilm dans les plaies chroniques dans un modèle murin glabres diabétique

Résumé

Nous décrivons ici un nouveau modèle murin diabétique utilisant des souris sans poils pour en temps réel, non invasif, surveillance des infections de plaies du biofilm de bioluminescent Pseudomonas aeruginosa. Cette méthode peut être adaptée pour évaluer l’infection d’autres espèces de bactéries et micro-organismes génétiquement modifiés, y compris les biofilms multi-espèces et tester l’efficacité des stratégies antibiofilm.

Résumé

La présence de bactéries comme les biofilms structurés dans les plaies chroniques, surtout chez les patients diabétiques, est censée empêcher la cicatrisation des plaies et la résolution. Murin de plaies chroniques ont été utilisés pour comprendre les interactions sous-jacentes entre les micro-organismes et l’hôte. Les modèles développés à ce jour s’appuient sur l’utilisation des animaux à poil et collection terminale d’un tissu pour la détermination des bactéries viables. Bien que la perspicacité significative a été acquise avec ces modèles, cette procédure expérimentale nécessite un grand nombre d’animaux et échantillonnage prend du temps. Nous avons développé un nouveau modèle murin qui intègre plusieurs innovations optimales afin d’évaluer la progression du biofilm dans les plaies chroniques : une) qu’il utilise des souris sans poils, éliminant le besoin pour l’épilation ; b) s’applique pré-formé biofilms sur les blessures permettant l’évaluation immédiate de la persistance et l’effet de ces communautés sur hôte ; c) surveille la progression du biofilm en quantifiant la production de lumière par une souche génétiquement modifiée bioluminescente Pseudomonas aeruginosa, ce qui permet une surveillance en temps réel de l’infection, réduisant ainsi le nombre d’animaux requis par l’étude. Dans ce modèle, une plaie pleine profondeur unique est produite sur le dos des souris sans poils diabétiques par STZ et inoculée avec des biofilms de la souche de P. aeruginosa bioluminescente Xen 41. Rendement lumineux de la blessure est enregistré chaque jour dans in vivo système d’imagerie, permettant une visualisation rapide de biofilm in vivo et in situ et la localisation des biofilms bactéries dans les plaies. Cette nouvelle méthode est souple car elle permet d’étudier d’autres micro-organismes, y compris les espèces génétiquement modifiées et des biofilms multi-espèces et peut être d’une valeur spéciale dans l’essai de stratégies anti-biofilm, y compris les antimicrobiens pansements occlusifs.

Introduction

Les biofilms sont des communautés complexes de micro-organismes noyées dans une matrice de substances polymériques qui ont été soulignées comme un facteur qui contribue à la faible résolution des plaies chroniques¹. L’étude de ces populations microbiennes hautement organisées et persistantes est particulièrement important pour les patients diabétiques où mauvaise circulation dans les membres et l’altération des mécanismes sensoriels périphériques conduire à des lésions non détecté². Aux États-Unis, on estime que 15 % des patients diabétiques se développera au moins un ulcère au cours de leur vie. Cela se traduit par une dépense économique d’environ 28 milliards dollars en traitement^3,4, sans oublier le fardeau émotionnel et social rafraîchit. Comprendre les facteurs qui permettent à des communautés microbiennes à persister dans le lit de la plaie et l’impact de ces biofilms dans les événements de guérison est impératif pour conduire les meilleurs soins pour les patients atteints et propulser le développement de nouvelles approches de traitement. Par conséquent, la mise en place de traduisible et reproductible le in vivo modèles pour explorer les interactions bactériennes-hôtes est primordiale.

Modèles murins ont été avec succès développés pour étudier l’impact des biofilms dans les plaies chroniques. Ces modèles, cependant, souvent utilisent des espèces aux cheveux et évaluer biofilm clairance de dénombrements de cellules bactériennes viables de tissus excisés d’animaux sacrifiés, ce qui les rend fastidieuse et coûteuse.

Une alternative de biophotonique à l’échantillonnage de point de terminaison des animaux dans l’évaluation de l’infection a été proposée par Contag et al. (1995) ^{5 ,} qui a développé une méthode pour capturer la luminescence de constitutivement bioluminescentes Salmonella typhimurium pour mesurer l’efficacité du traitement antibiotique. D’autres études en profitant des bactéries émettrices de bioluminescence suivi. Par exemple, Rochetta et al. (2001) ⁶ valider un modèle d’infection afin d’étudier les infections de cuisse Escherichia coli chez des souris en mesurant la luminescence à l’aide d’un dispositif de couplage charge intensifié et plus tard, Kandolo et al. (2003) ⁷ a profité du photon émettant des propriétés d’une souche Staphylococcus aureus d’enquêter sur l’efficacité de plusieurs antibiotiques dans un modèle de plaie cathéter chez la souris modifiée.

La méthode caractérisée ici présente un protocole simple pour induire le diabète chez des souris sans poils, produire et ensemencer des plaies avec pré-formé biofilms bioluminescentes de P. aeruginosa et biophotonique une surveillance de l’infection en utilisant un en vivo système d’imagerie. Il offre une directe, rapide, sur place, processus non invasif et quantitatifs d’évaluation des biofilms dans les plaies chroniques et permet en outre, pour des analyses supplémentaires telles que l’imagerie microscopique de la guérison des plaies, prélèvement de sang intermittent pour les mesures de cytokine et collection de tissus terminal pour l’histologie.

Protocole

des expérimentations animales ont été approuvées par le Comité d’utilisation de la Michigan State University et d’institutionnels animalier.

1. préparation des pansements occlusifs et les entretoises de Silicone

1. couper le pansement occlusif transparent pour faire carrés environ 1 cm x 1 cm avec des ciseaux.
2. Couper 10 mm cercles sur une feuille de silicone épaisseur 0,5 mm avec une biopsie punch. Centre de 10 mm une biopsie 5 mm coup de poing au milieu du cercle de 10 mm et appuyez fermement pour créer un trou pour former un " donut "-comme le disque qui sera utilisé comme une gouttière.

2. les animaux de laboratoire

1. utilisation âgés de 8 semaine (22-26 g) de souris mâles SKH-1 chez un éleveur commercial. Garder des souris dans des conditions standards de 21 ° C et un cycle lumière-obscurité de 12 h avec accès libre à la nourriture et l’eau.
2. Pour induire le diabète, injecter souris intraperitonially avec un solutionand de streptozotocine (STZ) de 13 mg/ml 25 % Glucose (250 µl par / souris) sur 5 jours consécutifs.
   1. Faire la solution STZ par dilution à 65 µg de STZ à 5 µL de 100 mM d’acide citrique, pH 4.5.
   2. Régler le volume injecté pour chaque souris à une masse finale de 65 mg STZ / 1 kg de poids corporel de souris. Injecter des souris témoins avec les pH de la solution de l’acide citrique 100 mM 4,5 sur les mêmes jours.
3. Sang surveillance de la glycémie avec un glucomètre 14 jours après la dernière injection de STZ pour confirmer l’hyperglycémie. Les souris diabétiques peuvent avoir une polyurie et donc leur literie doive être changé plus fréquemment afin d’éliminer l’humidité et leurs poids doivent être surveillées à 3 fois par semaine.

3. Biofilms

1. préparation de Biofilm
   1. Grow colonie biofilms ⁸ pour ensemencer les blessures. Deux jours avant le début de l’intervention chirurgicale une culture nuitée de bioluminescent P. aeruginosa Xen 41 dans un bouillon trypticase soja (TSB) incubée à 37 ° C et secouant à 200 tr/min et stériliser les filtres à membrane en polycarbonate avec 0.2 µm taille de pores par l’exposition aux UV lumière dans une hotte de sécurité biologique pour 15 min par face.
   2. Un jour avant l’intervention chirurgicale Centrifuger la culture nuitée à 20 000 x g pendant 2 min et laver 3 fois avec 1 mL de Dulbelcco ' tamponnée au phosphate s saline (SPD) en pipettant également, up et down.
   3. Diluer suspension au SPD à une absorbance de 0,05 à 600 nm.
   4. Pipette 10 µL de la culture diluée sur chaque membrane reposant sur une gélose trypticase soja (TSA). Après avoir laissé sécher, incuber les membranes à 35 ° C pendant 72 h à cultiver des biofilms transférant aux plaques de TSA fraîches chaque 24 h.
2. Courbe standard
   1. avant le début de l’expérience, faire une courbe standard de corréler les comtes de bioluminescence et bactérien.
   2. Préparer les biofilms comme décrit au point 3.1.
   3. Faire des dilutions successives des biofilms allant de ½ à 1/24 en mélangeant le biofilm à SPD et mélangé au vortex jusqu'à ce qu’une solution visuellement homogène est produite. Pipette de 200 µl des solutions diluées dans une plaque à 96 puits noir et image in vivo système d’imagerie.
   4. Propagation des dilutions de gélose sur des plaques de TSA et incuber à 35 ° C pendant 24 h.
   5. Compter (UFC) d’unités formant des colonies sur plaques et créer une courbe d’étalonnage pour corréler les comtes de bioluminescence et bactérien.

4. Plaie de chirurgie

1. induire une anesthésie générale l’isoflurane dans 95 % oxygen/5% CO ₂ (pour éviter la mort d’acidocétose) à un débit de 1 L/min et maintenir l’anesthésie à l’isoflurane 1 à 3 %. Maintenir les animaux sur les tapis de chaleur pendant la chirurgie.
2. Assurer les réflexes profonds de pédale de la souris sont supprimés en pinçant le pied avec des pincettes et placez votre souris en décubitus ventral.
3. Administrer le meloxicam (0,2 mg/kg) par injection sous-cutanée (30 μl) pour la gestion de la douleur.
4. Essuyer la peau du dos avec la povidone iodée 10 % trois fois et un tampon d’alcool isopropylique.
5. Utiliser un poinçon de biopsie stérile de 4 mm d’esquisser un motif circulaire pour la blessure d’un côté de la souris ' médiane s au niveau des épaules. Contournez le modèle avec un marqueur permanent.
6. Pince dentelée permet de soulever la peau au milieu les ciseaux contour et iris pour créer une blessure de pleine épaisseur qui s’étend à travers le tissu sous-cutané, y compris le panniculus carnosus et excise le morceau de tissu circulaire et.
7. Appliquer une colle médicale peau imperméable à l’eau sur la peau des souris et placer l’attelle de silicone appliquant une légère pression. Couvrir la plaie avec un pansement occlusif transparent. Après la chirurgie, les animaux en cage individuellement.

5. Gestion postopératoire

1. administrer le meloxicam (0,2 mg/kg) une fois par jour par injection sous-cutanée pour le soulagement de la douleur post-opératoire pour les 2 prochains jours.
2. Animaux de surveiller tous les jours pour les manifestations de douleur et perte de poids. Les animaux diabétiques ont besoin d’injections d’insuline quand ils ont perdu 15 % ou plus du poids du corps.

6. Préparation des inoculums biofilm et Infection

1. ensemencer souris 48 h après la chirurgie, comme décrit dans les étapes suivantes.
Les biofilms
2. gratter 72 h des membranes à l’aide d’une spatule stérile, placez-le dans un tube de microcentrifuge et diluer 1:2 dans le SPD. Mix en pipettant également brièvement, up et down.
3. Plaque de propagation inoculum sur des plaques de TSA pour calculer le total UFC. Pour s’assurer que les comptes sont exacts, briser l’inoculum de biofilm encore par une série de deux étapes de Vortex 1 min intercalés par une étape de sonication 2 min à 40 kHz dans un nettoyeur à ultrasons.
4. Retirer matériel de pansement, la plaie et la silicone attelle et prennent une micrographie de la plaie avec un microscope avec caméra attachée à l’aide d’une règle pour référence.
5. Couper l’extrémité des pointes de pipette 200 µL et déposer 10µl de l’inoculum de biofilm sur chaque plaie.
6. Image de souris à l’aide de l' in vivo à l’aide de réglages automatiques de système d’imagerie : exposition temps 5-300 s, moyenne binning 1 f/arrêt et ouvrir le filtre et de champ C (12,9 cm x 12,9 cm).
7. Couverture enroulée avec vinaigrette fraîche.

7. Mesure et imagerie

1. évaluer les signes cliniques des animaux tous les jours ⁹.
2. Fournir de la nourriture, l’eau et modifiez les cages si nécessaire.
3. Vérification de l’intégrité des pansements tous les jours. Lorsque le pansement est présent, seulement la bioluminescence peut être mesurée en raison de l’occlusion de la plaie. Au jour 8, les pansements sont enlevés et remplacés pas des mesures permettant de refermer les plaies.
4. Pèse animaux alternats.
5. Pour tous les jours, placez la souris individuellement dans une chambre d’isolement équipé d’un filtre HEPA et l’image en utilisant l' in vivo d’imagerie système tous les jours ou tous les deux jours jusqu'à ce que les valeurs de luminescence inférieur à fond.
6. Après jour 8, induire l’anesthésie générale et prendre les micrographies de la plaie avec un microscope avec caméra attachée une règle en utilisant comme référence tous les deux jours jusqu'à ce que les plaies sont cicatrisées.

8. L’analyse histologique

1. euthanasier les souris avec un débit de 2 l/min de CO ₂ dans une euthanasie de chambre après luminescence tombe en dessous des niveaux de fond et les plaies sont complètement guéries. Confirmer la mort par dislocation cervicale comme une deuxième méthode d’euthanasie.
2. Ciseaux iris permet de créer une excision large, pleine, autour et dans la région de la plaie (environ 1 cm de diamètre) et de préserver le tissu de paraformaldéhyde à 4 % pour faire une analyse histologique.
3. Autre analyse : détection de cytokines
   1. rétro-orbitalement recueillir le sang des animaux sous anesthésie à l’aide d’un tube capillaire de verre et transférez-la sur tubes EDTA traités.
   2. Centrifuger sang à 2 000 tr/min pendant 20 min à 4 ° C et de congeler le plasma pour la détection de la cytokine.

Résultats

Dans l’élaboration de ce nouveau modèle, nous avons observé beaucoup d’avantages en utilisant glabres SKH-1 sur les souris C57BL/6J, que nous avons utilisée dans le passé. Animaux soumis à des injections de STZ normalement l’expérience perte de poids progressive avec l’apparition du diabète ; Cependant, dans la plaie expériences de guérison menée précédemment par nos laboratoires reproduisant le modèle présenté par Dunn et al. (2012) ⁹

Discussion

Nous décrivons ici un nouveau modèle de souris pour l’étude des biofilms dans les plaies chroniques diabétiques qui présente de nombreux avantages pour créer un modèle reproductible, traduisible et flexible.

La première innovation est l’utilisation de souris sans poils. Autres modèles de souris ont été développés pour étudier les diabétique chroniques de cicatrisation de^10,11, mais tous se sont fondés sur l’utilis...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Opsite	Smith & Nephew	Model 66000041	Smith & Nephew Flexfix Opsite Transparent Adhesive Film Roll 4" x 11yards
SKH-1 mice Crl:SKH1-Hrhr	Charles River Breeding Laboratories	SKH1	Hairless mice, 8 weeks old
Streptozotocin (STZ)	Sigma Aldrich	S0130-1G	Streptozocin powder, 1g
AccuChek glucometer	Accu-Chek Roche	Art No. 05046025001	ACCU-CHEK CompactPlus Diabetes Monitoring Care Kit
Pseudomonas aeruginosa Xen 41	Perkin Elmer	119229	Bioluminescent Pseudomonas aeruginosa
Polycarbonate membrane filters	Sigma Aldrich	P9199	Millipore polycarbonate membrane filters with 0.2 μm pore size
Dulbelcco phosphate buffer saline (DPBS)	Sigma Aldrich	D8537	PBS
Tryptic soy agar	Sigma Aldrich	22091	Culture agar
Meloxicam	Henry Schein Animal Health	49755	Eloxiject (Meloxicam) 5mg/mL, solution for injection
10% povidone-iodine (Betadine)	Purdue Products LP	301879-OA	Swabstick, Betadine Solution. Antiseptic. Individ. Wrapped, 200/case
4% paraformaldehyde	Fisher Scientific	AAJ61899AK	Alfa Aesar Paraformaldehyde, 4% in PBS
Capillary glass tube	Fisher Scientific	22-362-566	Heparinized Micro-Hematocrit Capillary Tubes
Silicone to make splints	Invitrogen Life Technologies Corp	P-18178	Press-to-Seal Silicone Sheet, 13cm x 18cm, 0.5mm thick, set of 5 sheets
Tryptic soy broth	Sigma Aldrich	22092	Culture broth
IVIS Spectrum	Perkin Elmer	124262	In vivo imaging system
IVIS Spectrum Isolation chamber	Perkin Elmer	123997	XIC-3 animal isolation chamber
HEPA filter	Teleflex	28022	Gibeck ISO-Gard HEPA Light number 28022
Biopsy punches	VWR International Inc	21909-142	Disposable Biopsy Punch, 5mm, Sterile, pack of 50.
Biopsy punches	VWR International Inc	21909-140	Disposable Biopsy Punch, 4mm, Sterile, pack of 50.
Glucose	J.T.Baker	1916-01	Dextrose, Anhydrous, Powder
Citric acid	Sigma Aldrich	C2404-100G	Citric Acid
Mastisol	Eloquest Healthcare	HRI 0496-0523-48	Mastisol Medical Liquid Adhesive 2/3 mL vial, box of 48
Corning 96-well black plates	Fisher Scientific	07-200-567	96-well clear bottom black polysterene microplates
25 gauge 5/8 inch needle	BD	305122	Regular bevel needle
Bransonic M Ultrasonic Cleaning Bath	Branson Ultrasonics	N/A	Ultrasonic Cleaner