לצידו. אור: בויוו ניטור של דלקות Biofilm Pseudomonas aeruginosa לפצעים כרוניים במודל מאתר של שיער סוכרתית

Summary

כאן נתאר מודל מאתר סוכרתית הרומן ניצול עכברים שיער ניטור בזמן אמת, לא פולשנית, זיהומים בפצע biofilm של ביולומנאסן Pseudomonas aeruginosa. בשיטה זו ניתן להתאים כדי להעריך את זיהום של אחרים חיידקים ומיקרואורגניזמים מהונדסים, כולל biofilms מינים רב, ולבדוק את היעילות של אסטרטגיות antibiofilm.

Abstract

הנוכחות של חיידקים כמו biofilms מובנית בלפצעים כרוניים, במיוחד בחולים סוכרתיים, נחשב למנוע ריפוי הפצע והרזולוציה. מודלים פצעים כרוניים העכבר שימשו כדי להבין את האינטראקציות הבסיסית בין המיקרואורגניזמים לבין המארח. המודלים שפותחו כדי תאריך מסתמכים על השימוש בבעלי חיים עם שיער ואוסף מסוף רקמת הפצע על הנחישות של חיידקים קיימא. בעוד תובנה משמעותית צבר עם מודלים אלה, הליך ניסיוני זה דורש מספר רב של בעלי חיים, הדגימה הוא זמן רב. פיתחנו מודל מאתר רומן המשלב מספר חידושים אופטימלית כדי להעריך את התקדמות biofilm לפצעים כרוניים:) הוא מנצל עכברים שיער, ומבטלת את הצורך עבור הסרת שיער; ב) מחיל את biofilms הקבועים מראש על הפצעים ומאפשר את הערכה מיידית של התמדה ותוצאה של קהילות אלה במחשב מארח; ג) מפקח על התקדמות biofilm מאת לכימות ייצור אור על ידי זן ביולומנאסן מהונדס גנטית של Pseudomonas aeruginosa, המאפשר ניטור בזמן אמת של הזיהום ובכך להפחית את מספר בעלי חיים נדרש לכל מחקר. במודל זה, פצע מלא-עומק יחיד המיוצר על גב STZ-induced בעכברים שיער סוכרתיים, מחוסן עם biofilms של המתח ביולומנאסן aeruginosa פ Xen 41. פלט אור מהפצע נרשם מדי יום אין ויוו מערכת הדמיה, המאפשר ויזואליזציה biofilm מהירה ב- vivo וב -באתרו ולוקליזציה של חיידקים biofilm שבתוך הפצעים. שיטה חדשנית זו הוא גמיש כמו זה יכול לשמש כדי ללמוד מיקרואורגניזמים אחרים, כולל מינים מהונדסים biofilms מינים רב, וייתכן ערך מיוחד בבדיקות אסטרטגיות אנטי-biofilm כולל רטבים ריטלין מיקרוביאלית.

Introduction

Biofilms הן קהילות מורכבים של מיקרואורגניזמים מוטבע בתוך מטריצה של חומרים פולימריים הודגשו כגורם תורם לפתרון המסכן לפצעים כרוניים¹. המחקר של אוכלוסיות חיידקים אלה מאורגן, מתמיד חשוב במיוחד לחולי הסוכרת לאן מובילה במחזור עניים על איבריו ואת מנגנוני חישה היקפיים שינו נגעים מבלי שיבחינו². בארצות הברית, ההערכה היא כי 15% של חולי סוכרת יפתחו כיב אחד לפחות במהלך חייהם. זה מתורגם הוצאה כלכלית של-28 מיליארד דולר טיפול^3,4, שלא להזכיר את הנטל הרגשי והחברתי immensurable. הבנת הגורמים המאפשרים קהילות מיקרוביאלי להמשיך להעמיד את מיטת הפצע ואת ההשפעה ש-biofilms אלה יש באירועים הריפוי הכרחי כדי לנהוג לטיפול טוב יותר בחולים המושפעת להניע הפיתוח של גישות טיפול חדשות. לכן, הקמת לתרגום הדירים ויוו מודלים עבור חקר אינטראקציות וקרקע הוא בעל חשיבות עליונה.

מודלים מאתר פותחו בהצלחה לחקור את ההשפעה של biofilms הפצעים כרונית. מודלים אלה, עם זאת, לעיתים קרובות לנצל מינים שיער והערכת biofilm אישור מאת צלחת ספירות עבור תאים חיידקיים קיימא של רקמת נכרת מחיות שהקריבה עצמה, שהופך אותם זמן רב ויקר.

אלטרנטיבה biophotonic הדוגמאות נקודת הקצה של חיות הערכת זיהום הועלתה לראשונה על ידי Contag et al. (1995) ^{5 ,} מי שפיתח שיטה ללכידת הפריה חוץ גופית של ביולומנאסן צורונים סלמונלה typhimurium כדי למדוד את יעילות טיפול אנטיביוטי. מחקרים אחרים ניצול של חיידקים פולטי ביולומינסנציה בעקבות. לדוגמה, Rochetta et al. (2001) ⁶ לאמת מודל זיהום ללמוד Escherichia coli זיהומים הירך בעכברים על ידי מדידת הפריה חוץ גופית באמצעות של והחרפת תשלום מצמידים מכשיר, Kadurugamuwa מאוחר יותר, ואח. (2003) ⁷ ניצלו הפוטון פולטות מאפייני זן שעברו הנדסה לאחור של Staphylococcus aureus כדי לחקור את היעילות של אנטיביוטיקה מספר במודל הפצע קטטר בעכברים.

השיטה מאופיין כאן מציג פרוטוקול פשוטה לגרום סוכרת בעכברים שיער, לייצר ואת לחסן פצעים עם הקבועים מראש biofilms ביולומנאסן של פ aeruginosa, התנהגות biophotonic ניטור הזיהום באמצעות יישום ויוו מערכת הדמיה. הוא מציע ישיר, מהירה, בחיי עיר, תהליך פולשני כמותיים להערכת biofilms לפצעים כרוניים, בנוסף, מאפשרת לניתוח נוספים כגון הדמיה מיקרוסקופיים של ריפוי פצעים, איסוף דם לסירוגין במשך ציטוקין מדידות, אוסף רקמה מסוף עבור כפפות.

Protocol

ניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה של אוניברסיטת מישיגן.

1. הכנה של רטבים ריטלין, מפרידי סיליקון

1. לחתוך את הרוטב ריטלין שקופים כדי להפוך ריבועים כ 1 ס"מ על 1 ס"מ עם מספריים.
2. 10 לחתוך עיגולים מ מ על גיליון סיליקון בעובי 0.5 מ מ באמצעות 10 מ מ ביופסיה אגרוף. מרכז ביופסיה 5 מ מ אגרוף במרכז העיגול 10 מ מ ולחץ בחוזקה כדי ליצור חור לטופס " סופגניות "-כמו דיסק זה ישמש בתור סד.

2. חיות ניסוי

1. שימוש בת שבוע 8 (22-26 גרם) עכברים SKH-1 זכר מ תרבית מסחרי. לשמור על עכברים בתנאים סטנדרטיים של 21 ° C ו- 12 שעות אור-כהה מחזור עם גישה חופשית מזון ומים.
2. לזירוז סוכרת, להזריק עכברים intraperitonially solutionand streptozotocin (STZ) 13 מ"ג/מ"ל 25% גלוקוז (µl 250 לכל / עכבר) על 5 ימים רצופים.
   1. להפוך את הפתרון STZ על-ידי µg 65 המדללת של STZ ב µL 5 מ"מ חומצה ציטרית, pH 4.5-
   2. לכוונן את העוצמה מוזרק עבור כל עכבר למסה הסופית של 65 מ ג STZ לק"ג משקל גוף העכבר. להזריק בקרת עכברים עם 100 מ מחומצה ציטרית-פתרון-pH 4.5 באותם ימים-
3. לאשר את היפרגליקמיה הדם ניטור גלוקוז עם סוכר 14 ימים לאחר הזריקה STZ האחרון. בעכברים סוכרתיים ייתכן polyuria אז מצעים שלהם ייתכן שתצטרך להשתנות בתדירות גבוהה יותר כדי למנוע רטיבות ו שלהם משקולות צריך להיות במעקב במשך 3 פעמים בשבוע.

3. Biofilms

1. Biofilm הכנה
   1. לגדול המושבה biofilms ⁸ כדי לחסן את הפצעים. יומיים לפני תחילת הניתוח תרבות לילה של ביולומנאסן aeruginosa פ Xen 41 ב ציר סויה tryptic (TSB) מודגרות ב 37 מעלות צלזיוס, רועדת במהירות של 200 סל ד ולחטא פוליקרבונט מסננים קרום עם גודל הנקבוביות מיקרומטר 0.2 בחשיפה לאור אולטרא אור בשכונה בטיחות ביולוגית למשך 15 דקות בכל צד.
   2. יום אחד לפני הניתוח צנטריפוגה תרבות לילה ב g x 20,000 למשך 2 דקות ולשטוף 3 פעמים עם 1 מ"ל של Dulbelcco ' s פוספט buffered תמיסת מלח (DPBS) על ידי pipetting למעלה ולמטה.
   3. לדלל ההשעיה ב DPBS כדי ספיגת 0.05-600 nm.
   4. פיפטה 10 µL של התרבות מדולל על כל קרום נח על צלחת אגר (TSA) סויה tryptic. לאחר מתן אפשרות לייבוש, דגירה על הממברנות ב 35 מעלות צלזיוס במשך 72 h לגדול biofilms העברת ללוחות TSA טריים כל ה 24
2. עיקול רגיל
   1. לפני תחילת הניסוי תעשה סיבוב סטנדרטי לתאם ספירות ביולומינסנציה ובקטריאלי.
   2. להכין biofilms כמתואר ב- 3.1.
   3. להפוך דילולים טורי של biofilms החל ½ עד 1/24 על ידי ערבוב biofilm עם DPBS ו- vortexing עד פתרון הומוגני מבחינה ויזואלית מופק. פיפטה 200µL של פתרונות מדולל שחור צלחת 96-ובכן, התמונה עם ה-ויוו מערכת הדמיה-
   4. התפשטה דילולים צלחת על גבי לוחות TSA, דגירה ב 35 ° C עבור 24h.
   5. נחשב המושבה יוצרי יחידות (CFU) על צלחות וליצור עיקול רגיל לתאם ספירות ביולומינסנציה ובקטריאלי.

4. פצע הניתוח

1. לגרום הרדמה כללית באמצעות איזופלוריין ב 95% oxygen/5% CO ₂ (כדי למנוע מוות של בחמצת) בספיקה של 1 ליטר/דקה ולתחזק הרדמה באמצעות 1-3% איזופלוריין. לשמור על החיות על מחצלות חום במהלך הניתוח.
2. להבטיח הרפלקסים עמוק פדלים של העכבר מדוכאים על ידי התכווצות כף הרגל עם פינצטה ומקם את העכבר במצב שכיבה.
3. לניהול meloxicam (0.2 מ ג/ק ג) באמצעות הזרקה תת עורית (30 μl) לניהול כאב.
4. לנגב את העור של האחורי עם 10% povidone-יוד שלוש פעמים, רכיב pad אלכוהול איזופרופיל.
5. להשתמש אגרוף ביופסיה 4 מ מ סטרילית חלוקה לרמות אחד בתבנית מעגלית על הפצע על צד אחד של העכבר ' קו האמצע s ברמה של הכתפיים. חלוקה לרמות את התבנית עם סמן קבוע.
6. להשתמש מלקחיים משוננות כדי להרים את העור באמצע המספריים חלוקה לרמות ואיריס כדי ליצור פצע מלא-עובי המשתרע דרך רקמת השומן התת עורית כולל את carnosus panniculus בלו מעגלית פיסת הרקמה.
7. להחיל דבק דבק רפואי עור עמיד למים על העור של העכברים ומקם את הסד סיליקון הפעלת לחץ מתון. לכסות את הפצע עם ההלבשה ריטלין שקוף. לאחר הניתוח, בנפרד בכלוב החיות.

5. ניהול לאחר הניתוח

1. לניהול meloxicam (0.2 מ"ג/ק"ג) פעם ביום באמצעות הזרקה תת עורית לשיכוך כאבים לאחר הניתוח למשך 2 הימים.
2. צג חיות מדי יום עבור גילויי כאבים וירידה במשקל. בעלי חיים סוכרתיים צריך זריקות אינסולין כאשר הם איבדו 15% או יותר של משקל הגוף-

6. הכנה Inoculum Biofilm ולדלקת

1. לחסן עכברים 48 שעות לאחר הניתוח כפי שתואר בשלבים הבאים-
2. לגרד 72 h biofilms של הממברנות בעזרת מרית סטרילי, למקם אותו צינור microcentrifuge ו לדלל 1:2 ב- DPBS. מיקס על ידי בקצרה pipetting למעלה ולמטה.
Inoculum
3. צלחת כפולה על גבי צלחות TSA לחישוב CFU הכולל. כדי להבטיח כי סעיפים מדויק, לשבור את biofilm inoculum עוד יותר על ידי סדרה של שני שלבים vortexing של 1 דקות, intercalated על ידי צעד sonication 2 דקות ב 40 קילו-הרץ בניקוי אולטראסוני.
4. להסיר את כיסוי ההלבשה הפצע, סיליקון תקבע ולקחת מיקרוסקופ של הפצע עם מיקרוסקופ עם המצלמה המצורפת בעזרת סרגל לעיון.
5. לחתוך את קצות 200 µL פיפטה טיפים, פיפטה 10 µL של inoculum biofilm על גבי כל אחד מהפצעים.
6. העכבר תמונה באמצעות ה-ויוו מערכת באמצעות הגדרות אוטומטית הדמיה: חשיפה זמן 5-300 s, עם binning בינוני, 1 f/להפסיק, פתח מסנן שדה ראייה C (12.9 ס"מ x 12.9 ס"מ).
7. המכסה פצע טרי ברוטב.

7. הפצע מדידה והדמיה

1. להעריך את הסימנים הקליניים של חיות יומי ⁹.
2. לספק מזון, מים, לשנות את הכלובים כנדרש.
3. בדיקת התקינות של תחבושות מדי יום. כאשר הרוטב קיים, ניתן למדוד רק ביולומינסנציה עקב חסימה של הפצע. יום 8, רטבים יוסרו and not הוחלף המאפשר מדידה של סגירת הפצע.
4. שוקל חיות בכל יום אחר.
5. עבור כל הימים, מקום עכברים בנפרד בחדר בידוד החדרים מצויידים מסנן HEPA, התמונה באמצעות ה-ויוו מערכת הדמיה כל יום או כל יום אחר עד הפריה חוץ גופית ערכים ליפול מתחת לרמת הרקע.
6. לאחר יום 8, זירוז הרדמה כללית ולקחת micrographs של הפצע עם מיקרוסקופ עם המצלמה המצורפת בעזרת סרגל לעיון בכל יום עד הפצעים הגלידו.

8. ניתוח היסטולוגית

1. Euthanize העכברים עם זרם של 2 ל'/דקה של CO ₂ המתת חסד קאמרית לאחר הפריה חוץ גופית יורד מתחת רקע רמות הפצעים הגלידו לחלוטין. לאשר את מותו על ידי נקע בצוואר הרחם כשיטה נוספת המתת חסד-
2. להשתמש במספריים איריס ליצור כריתה רחבה, מלאה מסביב ותחת אזור הפצע (בערך 1 ס מ קוטר) ולשמר את הרקמה ב 4% paraformaldehyde לבדיקה היסטולוגית.
3. ניתוח אחרים: זיהוי ציטוקינים
   1. לאסוף דם רטרו-orbitally מחיות בהרדמה באמצעות שפופרת זכוכית נימי ולהעביר אותו צינורות שטופלו EDTA.
   2. פלזמה לגילוי ציטוקין צנטריפוגה דם ב-2000 סל ד כעשרים דקות ב 4 ° C ומקפיאים.

תוצאות

פיתוח המודל החדש, הבחנו יתרונות רבים תוך ניצול SKH שיער-1 על C57BL/6J עכברים, שבו השתמשנו בעבר. חיות נתון STZ זריקות בדרך כלל חווים ירידה הדרגתית במשקל עם תחילת סוכרת; עם זאת, בפצע ריפוי ניסויים בעבר שנערך על ידי מעבדות שלנו לשחזר את מודל שהוצגו על ידי דן ואח. (2012) ⁹...

Discussion

כאן נתאר מודל עכבר חדש לחקר biofilms סכרת הפצעים כרונית בעלת יתרונות רבים כדי ליצור מודל גמיש, לתרגום הדירים.

החידוש הראשון הוא השימוש של עכברים חסרי־השיער שמסתובבים באזור. דגמים אחרים העכבר פותחו כדי ללמוד סוכרת פצע כרוני ריפוי^10,11, אבל כולנו צרי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Opsite	Smith & Nephew	Model 66000041	Smith & Nephew Flexfix Opsite Transparent Adhesive Film Roll 4" x 11yards
SKH-1 mice Crl:SKH1-Hrhr	Charles River Breeding Laboratories	SKH1	Hairless mice, 8 weeks old
Streptozotocin (STZ)	Sigma Aldrich	S0130-1G	Streptozocin powder, 1g
AccuChek glucometer	Accu-Chek Roche	Art No. 05046025001	ACCU-CHEK CompactPlus Diabetes Monitoring Care Kit
Pseudomonas aeruginosa Xen 41	Perkin Elmer	119229	Bioluminescent Pseudomonas aeruginosa
Polycarbonate membrane filters	Sigma Aldrich	P9199	Millipore polycarbonate membrane filters with 0.2 μm pore size
Dulbelcco phosphate buffer saline (DPBS)	Sigma Aldrich	D8537	PBS
Tryptic soy agar	Sigma Aldrich	22091	Culture agar
Meloxicam	Henry Schein Animal Health	49755	Eloxiject (Meloxicam) 5mg/mL, solution for injection
10% povidone-iodine (Betadine)	Purdue Products LP	301879-OA	Swabstick, Betadine Solution. Antiseptic. Individ. Wrapped, 200/case
4% paraformaldehyde	Fisher Scientific	AAJ61899AK	Alfa Aesar Paraformaldehyde, 4% in PBS
Capillary glass tube	Fisher Scientific	22-362-566	Heparinized Micro-Hematocrit Capillary Tubes
Silicone to make splints	Invitrogen Life Technologies Corp	P-18178	Press-to-Seal Silicone Sheet, 13cm x 18cm, 0.5mm thick, set of 5 sheets
Tryptic soy broth	Sigma Aldrich	22092	Culture broth
IVIS Spectrum	Perkin Elmer	124262	In vivo imaging system
IVIS Spectrum Isolation chamber	Perkin Elmer	123997	XIC-3 animal isolation chamber
HEPA filter	Teleflex	28022	Gibeck ISO-Gard HEPA Light number 28022
Biopsy punches	VWR International Inc	21909-142	Disposable Biopsy Punch, 5mm, Sterile, pack of 50.
Biopsy punches	VWR International Inc	21909-140	Disposable Biopsy Punch, 4mm, Sterile, pack of 50.
Glucose	J.T.Baker	1916-01	Dextrose, Anhydrous, Powder
Citric acid	Sigma Aldrich	C2404-100G	Citric Acid
Mastisol	Eloquest Healthcare	HRI 0496-0523-48	Mastisol Medical Liquid Adhesive 2/3 mL vial, box of 48
Corning 96-well black plates	Fisher Scientific	07-200-567	96-well clear bottom black polysterene microplates
25 gauge 5/8 inch needle	BD	305122	Regular bevel needle
Bransonic M Ultrasonic Cleaning Bath	Branson Ultrasonics	N/A	Ultrasonic Cleaner