JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

مروج تعبير تحاليل ضرورية لتحسين فهم تنظيم الجينات والتعبير الزمانية المكانية للجينات المستهدفة. وهنا نقدم بروتوكول لتحديد وعزل واستنساخ مروج نبات. علاوة على ذلك، يصف لنا وصف المروج العقيدات على حدة في جذور شعر الحبة المشتركة.

Abstract

تسلسل المراحل الأولى من الجينات ترميز تسلسلات توصف بأنها متواليات المروج. دراسة أنماط التعبير من المروجين هامة جداً في فهم تنظيم الجينات وأنماط التعبير الزمانية المكانية للجينات المستهدفة. من ناحية أخرى، من المهم أيضا إنشاء مروج تقييم أدوات وتقنيات تحويل الوراثية التي سريعة وفعالة، واستنساخه. في هذه الدراسة، ونحن التحقيق في نمط التعبير الزمانية المكانية مروج إنشائها (نين) رهيزوبيال الخاصة بالتكافل العقيدات فاصولياء الشائع في جذور شعر المحورة وراثيا. استخدام قواعد بيانات الجينوم المصنع وأدوات التحليل التي حددناها، معزولة، واستنساخ المروج الشائع P. نين في انصهار النسخي لمراسل تشيميريك β-glucuronidase (غوس) غوس-enhanced::GFP. علاوة على ذلك، يصف هذا البروتوكول نظام التحول الوراثي في P. الشائع استخدام جذور شعر rhizogenes المتبعة التي يسببها السريع وتنوعاً. هذا النظام يولد جذور شعر سم إيه تو في 10 إلى 12 يوما بعد التحول. بعد ذلك، قمنا بتقييم التعبير الزمانية المكانية للمروج نين في جذور شعر طعمت على فترات دورية للتطعيم بعد. وتبين النتائج لدينا يصور بنشاط غوس أن المروج نين نشطة أثناء عملية نودوليشن. معا، على هذا البروتوكول يوضح كيفية تحديد وعزل واستنساخ وتميز مروج نبات في جذور شعر الحبة المشتركة. علاوة على ذلك، من السهل استخدام هذا البروتوكول في المختبرات غير المتخصصة.

Introduction

مروجي هي أدوات هامة البيولوجية الجزيئية التي تلعب دوراً حاسما في فهم تنظيم الجينات للفائدة. المروجين تسلسل الحمض النووي الموجود في أعلى النهر من الترجمة تسلسل بدء كودون من الجينات وأنها تحمل المعلومات التنظيمية المركزية للجينات؛ ولذلك، وصف وشرح الصحيح أمر حيوي لفهم وظيفة الجينات. اعتماداً على أنماط التعبير، تصنف المروجين المصنع التأسيسي، والأنسجة على حدة، أو الخاصة بالتنمية-المرحلة وإيندوسيبلي1. أوجه التقدم في تكنولوجيات ترانسكريبتوميك وإدخال تحسينات على النمذجة الكمبيوتر وتوفر إعداد متزايدة من تسلسل الجينوم للأنواع النباتية المختلفة قد يسرت التنبؤ على نطاق واسع بتسلسل المروج2.

من ناحية أخرى، من المهم أيضا إنشاء مروج تقييم أدوات وتقنيات تحويل الوراثية التي سريعة وفعالة، واستنساخه. خلافا لغيرها من النباتات النموذجية، تعوق توصيف الوظيفية الشائعة الفول البقول (P. الشائع) الجينات أساسا نظراً لطبيعة المعاندة sp. فاصولياء للتحول الوراثي مستقرة. نظم التحويل عابر كبديل للجينات السريع دراسات التوصيف الوظيفي3. في البقول التكافل بين البحث والتفاعل بين النبات المضيف البقوليات وبكتيريا رهيزوبيال أحد أنظمة نموذجية جانب آخر للتحليل الوظيفي الجينات الخاصة بالعقيدات ودراسات المروج. تتميز حتى الآن، كانت المروجين البقول عدة تتصل بهذه متنافسة، أي، PT4 فصة برميلية 4، SWEET115، العملاق japonicus لوتس ، أوبق6،7من VAG1، PT5 ماكس جليكاين 8Exo70J9ربوهب الشائع ص 10،،من1112، TRE113، PI3K14، تور15،، إلخ. رابطة الدول المستقلة عناصر تنظيم الجينات تؤثر بصورة مباشرة. عامل النسخ ENBP1A بربط منطقة كومنولث الدول المستقلة تنظيمية (−692 bp) من أوائل نودولين فودافونENOD12، وهذا يسهل التعبير عن الجين المراسل في العقيدات primordia فول بيقية16. الاستعاضة عن المناطق التنظيمية المستقلة (−161 إلى −48 bp) من المروج الخاصة بالعقيدات ليغيموجلوبين GLB3 مع مغايرة اقتطاع المروجين δ-p35S و δ-بنوس وأدت إلى فقدان خصوصية العقيدات وانخفاض نشاط المروج17 .

وتظهر التقارير السابقة أن عامل النسخ نين مطلوب لبدء الإصابة رهيزوبيال في خلايا جذور الشعر وضروري أيضا للعقيدات organogenesis في japonicus ل18. في الدراسة الحالية، ويصف لنا بروتوكول تحديد هوية والعزلة، والاستنساخ، وتوصيف المروج العقيدات على حدة في جذور شعر الحبة المشتركة. لتحقيق هذا الهدف، علينا تحديد rhizobial مروج نين خاصة بتكافل من الشائع P. والمستنسخة في انصهار النسخي لمراسل تشيميريك غوس-enhanced::GFP. علاوة على ذلك، يصف هذا البروتوكول نظام التحول الوراثي في P. الشائع استخدام جذور شعر رهيزوجينيس أ التي يسببها السريع وتنوعاً. هذا النظام يولد جذور شعر في أقل من أسبوعين بعد التحول. وأخيراً، قمنا بتقييم التعبير الزمانية المكانية للمروج نين في العقيدات الجذرية رهيزوبيا المستعمر تلطيخ غوس.

قد يكون من المفيد ليس فقط لدراسة نودولاتيون وميكورهيزاتيون11 من نباتات البقول، ولكن أيضا لدراسة أنماط التعبير المروج في جذور19الإجراء الموضح هنا. علاوة على ذلك، من السهل استخدام هذا البروتوكول في المختبرات غير المتخصصة.

Protocol

1-تحديد والعزلة، والاستنساخ من الشائع ص نين المروج

  1. تحديد تسلسل المروج للجينات للفائدة. هناك عدة قواعد بيانات الجينوم وأدوات التحليل المتاحة للنباتات مثل فيتوزومي، ونباتات انسيمبل، نكبي، إلخ بالبقول المروج الشائع ص نين (بفنين؛ واستخدمت في هذه الدراسة20Phvul.009G115800).
  2. يستخدم التصميم أوليجوس للعبارة أو التقليدية تقييد إنزيم الاستنساخ بالاعتماد على نظام مكافحة ناقلات (الشكل 1A).
    ملاحظة: معيار (25-35 شركة بريتيش بتروليوم)، كبسولة تفجير ديسالتيد العمل غرامة. ينصح متواليات اليغو عكس ذلك الجناح بين المروج والجينات.
  3. تضخيم المنطقة مروج بفنين (أو منطقة المروج من الجينات للفائدة) من طازجة معزولة الشائع P. الحمض النووي باستخدام مجموعة اليغو الخاصة بالمروج. استخدام بوليميريز عالية الدقة مع بكر الشروط التالية: 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق؛ دورات 30 (95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة)؛ و 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  4. تشغيل الجزء تضخيم على 1% [اغروس] هلام في 60 الخامس في علبة جل 7 × 10 سم، والوتي amplicon المقابلة (700 شركة بريتيش بتروليوم، الشكل 1B) واستنساخ داخل المتجهة بينتر/د-توبو وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
  5. تحويل 2 ميليلتر من رد الفعل إلى المختصة الإشريكيّة القولونية الخلايا باستخدام تعليمات الشركة المصنعة ولوحة 150 ميليلتر لتحويل المزيج على ليسوجيني الأخ (رطل) وتستكمل مع كاناميسين 50 مغ/لتر (Kan50). تنمو الخلايا مطلي في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  6. بيك 3-6 المستعمرات والثقافة لهم بين عشية وضحاها في رطل المتوسطة التي تحتوي على Kan50. عزل بلازميد الحمض النووي باستخدام طريقة اختيار وتحليل بلازميد بالاسترداد باستخدام أوليجوس M13 محددة في مكافحة ناقلات. لبكر، استخدام 100 نانوغرام من بلازميد، 12:03 م أوليجوس، X 10 العازلة PCR 0.5 بوليميراز "الدنا بوليميراز يو" ودنتبس 10 ملم.
  7. استخدام PCR التضخيم الشروط التالية؛ 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق؛ دورات 30 (95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 58 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية ل 75 s)؛ وتصور 72 درجة مئوية للحد الأدنى 7 منتجات بكر على 1% [اغروس] هلام. ضمان الإدراج الصحيح عصابة في 1,024 بي بي وناقلات دون إرادة إدراج لها عصابة bp 324 (الشكل 1).
  8. القيام برد فعل LR بين دخول ناقلات (بينتر/د-توبو-بفنين) ووجهة متجه pBGWFS7.021 باستخدام مزيج إنزيم تجارية وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
  9. تحويل 2 ميليلتر من رد فعل LR إلى المختصة كولاي الخلايا باستخدام التقنيات القياسية كما هو موضح في تعليمات الشركة المصنعة ولوحة 150 ميليلتر من خليط التحول على رطل وتستكمل مع 100 مغ/لتر السبيكتينوميسين (Spe100). تنمو الخلايا مطلي في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  10. اختيار حوالي 5 مستعمرات والثقافة لهم بين عشية وضحاها في رطل المتوسطة التي تحتوي على Spe100. عزل بلازميد الحمض النووي باستخدام أسلوب لاختيار وتحليل بلازميد بالاسترداد باستخدام أوليجوس الخاصة بالمروج.
  11. استخدام شروط PCR في الخطوة 1، 3. تصور منتجات بكر على 1% [اغروس] هلام لتأكيد التضخيم. أمبليكونس هي 700 شركة بريتيش بتروليوم.
  12. التسلسل في بلازميد الإيجابية pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-التجارة والنقل (الشكل 1) مع أوليجوس الخاصة بالمروج التحقق من صحة الإدراج.
  13. تحويل والبلازميدات rhizogenes ألف سلالة K599 (ومع ذلك، أي سلالات أخرى من رهيزوجينيس (أ) يمكن استخدامها). إضافة 2 ميليلتر من الإعدادية بلازميد إلى 50 ميليلتر من الخلايا اليكتروكومبيتينت واليكتروبوراتي في ومبومو 1 مم مع الإعدادات التالية: 1.8 كيلو فولت و 25 µF و 200 Ω.
  14. استعادة الخلايا في ~ 500 ميليلتر من شركة نفط الجنوب متوسطة ويهز في 28 درجة مئوية حاء 2 لوحة على Spe100 رطل وتنمو في 28 درجة مئوية لمدة يومين.
  15. إجراء الفحص مستعمرة كما هو مذكور في الخطوة 1، 7 واستخدام شروط بكر كما في الخطوة 1، 3. جعل الأرصدة والغليسيرول من استنساخ الإيجابية وتخزينها في-80 درجة مئوية.
  16. استخدام الثقافة rhizogenes) أ ( إيواء متجه pBGWFS7.0 الفارغة كعنصر سلبي.

2- رهيزوجينيس أ تحول شعر جذور الفاصوليا الشائعة

  1. تعقيم بذور الفول (عامالشائع P. جامبا نيغرو) (حوالي 20) في 50 مل إيثانول 96% لمدة 1 دقيقة وتجاهل الإيثانول؛ قم بإضافة 50 مل من 20% التبييض (هيبوكلوريت الصوديوم) لمدة 10 دقيقة، مع خلط مستمر في غطاء الاندفاق الصفحي. إزالة المبيض وتغسل في الماء المعقم الزائدة 3 مرات.
    ملاحظة: يمكن استخدام الأصناف الأخرى الشائع P. لتحريض الجذر شعر.
  2. تنبت بذور معقمة في ورقات تصفية معقم مبلل مع بروتون & Dilworth (ب & د) الحل22 (الجدول 1) لمدة يومين في الظلام في 28 درجة مئوية.
  3. قبل التحول اليوم إعداد الوثائق التالية:
    1. متتالية من 150 ميليلتر الثقافة rhizogenes) أ ( إيواء متجه ثنائي (أعد الخطوات 1.13 و 1.14) في صلب رطل Spe100 وينمو بمعدل 28 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    2. ملء أنبوب 15 مل ب & د حل واستبدال سداده ملولبة مع رقائق الألومنيوم الطبقات المزدوجة. تجميع هذا في أنبوب زجاج 22 سم تحتوي على 10 مل ب & د حل (الشكل 2) والاوتوكلاف عليه.
  4. في يوم التحول، تجميع المواد التالية العقيمة في غطاء الاندفاق الصفحي: نامي البذور من الخطوة 2، 2، لوحة الثقافة من الخطوة 2.3.1 وتعقيم الماء المقطر مزدوجة (10 مل)، الماصات وأنابيب من الخطوة 2.3.2 نصائح ماصة، الملقط العقيمة، والمحاقن مل 3.
  5. استخدام تلميح 200 ميليلتر بنت كشط الخلايا رهيزوجينيس ألف من اللوحة في أنبوب ميكروسينتريفوجي وريسوسبيند في 1 مل الماء المعقم مزدوجة. وبالمثل، تعد ناقل التحكم الخلايا بشكل منفصل.
    1. مزيج من الخلايا بلطف إلى ريسوسبيند. عدم دوامة.
  6. جعل حفرة 3 مم على رقائق الألومنيوم الأنابيب من الخطوة 2.3.2 استخدام تلميح ماصة معقمة.
  7. جمع الخلايا (مراقبة المروج أو ناقل) من الخطوة 2، 5 مع المحاقن ووخز قليلاً هيبوكوتيلس إنبات البذور بطرف الإبرة (الشكل 2).
    ملاحظة: تأكد من أن تخترق الإبرة (4-6 مرات) الأنسجة الوعائية وحقن صغيرة (~ 5 ميليلتر) قطرات من الخلايا على الجرح في مواقع مختلفة حول هيبوكوتيل.
  8. إدراج جذور الشتلات حقن بعناية في حفرة 3 مم 15 مل الأنبوب الذي يحتوي على ب & د حل. إرجاع الإعداد الكامل إلى مل 22 أنابيب زجاجية وختم لهم بالاحتفاظ بالرطوبة.
  9. احتضان هذه الأنابيب في غرفة نمو الحفاظ على 28 درجة مئوية مع الضوء ح 16:8 ح كبيرة مظلمة.
    ملاحظات: 3-4 أيام بعد الحضانة، النباتات تنمو على حافة أنابيب زجاجية مل 22.
وفي هذه المرحلة، إزالة القبعات وختم ريم مع بارافيلم حول الساق كما هو موضح في الشكل 2 طاء.
  • مراقبة دشبذ في المواقع مما أدى إلى إصابة في 5-7 أيام، وتجد ~ جذور شعر سم 2 من 10-12 يوما بعد التحول.
    ملاحظة: من المهم أن تحتفظ ب & د حل باستمرار في الأنابيب البلاستيكية والزجاج.
  • بعد أسبوعين، إزالة الجذر الابتدائي بقطع الساق سم 2 أدناه جذور شعر وزرع جذور الأولى في الأواني التي تحتوي على الفيرميكوليت العقيمة. المحافظة على النباتات في حجرة نمو (ح 16 الضوء: 8 ح الظلام عند 28 درجة مئوية) وري ب & د حل.

    • 3-مروج التحليل: نين مروج التعبير في العقيدات Rhizobial من الفاصوليا الشائعة

    1. لتحريض العقيدات الجذرية، تطعيم الريزوبيوم تروبيسي أو اللحم (المتوافقة للحبة المشتركة) في 100 مل متوسطة PY (ببتون ز 0.5، 0.3 غ خميرة مقتطف) تستكمل مع 700 مم كاكل2 و 20 ملغ مل1 حمض الناليديكسيك. احتضان عند 30 درجة مئوية ل 24 ساعة مع الهز 300 لفة في الدقيقة.
      ملاحظة: يمكن استخدام أي مضادات حيوية محددة في حالة المحورة وراثيا .
    2. بيليه الخلايا في أجهزة الطرد مركزي لمدة 3 دقيقة في 2,800 س ز في درجة حرارة الغرفة وريسوسبيند في 10 مل من 10 مم MgSO4. ضبط القطر الخارجي للخلايا إلى 0.6 OD600 بتمييع مع 10 مم MgSO4.
    3. 1-2 مل ثقافة (أعد من الخطوة 3.2) كل مصنع (مراقبة المروج وناقلات) للحث على نمو العقيدات على جذور شعر تطعيم. ري النباتات مع ب & د حل مع النيتروجين محدودة (2 مم كنو3) لتعزيز نودوليشن.
    4. اعتماداً على الحاجة التجريبية، جمع جذور شعر في نقاط زمنية مختلفة. جمع عينات لدراسة المواضيع الإصابة بين 3-5 أيام بعد تلقيح (نقطة في البوصة).
      ملاحظة: العقيدات البدائية والعقيدات الشباب يمكن دراستها في 6-9 إدارة شؤون الإعلام وإدارة شؤون الإعلام أيام 10-12، على التوالي. وأخيراً، يمكن دراسة العقيدات ناضجة والفنية 14-21 نقطة في البوصة، والعقيدات سينيسسيد في > 28 نقطة في البوصة.
    5. عملية الجذر/العقيدات لنشاط الجينات مراسل (جوس أو بروتينات فلورية خضراء). تحليل النشاط غوس وفقا للبروتوكول، المذكورة جيفرسون23. مراقبة التجارة والنقل تحت مجهر الأسفار. تثير fluorescence بروتينات فلورية خضراء مع ليزر أيون أرجون أزرق (488 نانومتر)، وجمع الأسفار المنبعثة من 510 إلى 540 نانومتر.

    النتائج

    والهدف من هذه الدراسة تقييم نمط التعبير الزمانية المكانية للعقيدات على حدة نين P. الشائع . للقيام بذلك، اختير 700 شركة بريتيش بتروليوم منطقة المنبع كودون الشروع في ترجمة الجين نين وصممت مجموعة من أوليجوس كما هو مبين في الشكل 1 ألف. استخدام بوليميري...

    Discussion

    أثناء التحليل الوظيفي للجينات، دراسة أنماط التعبير الجيني يلعب دوراً حاسما في فهم التنظيم المكاني والزماني للجينات في الجسم الحي. طريقة معروفة لدراسة أنماط التعبير الجيني لاستنساخ منطقة المروج الجين موضع الاهتمام، المنبع لمراسل الجينات مثل الجينات علامة نيون (التجارة والنقل، وطلب...

    Disclosures

    الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

    Acknowledgements

    وأيده هذا العمل جزئيا ديل المديرية العامة للشؤون التاريخ الشخصي، دجابا/بابيت-جامعة المكسيك الوطنية المستقلة (منحة لا. IN219916 M.L و IA205117 إلى م-ك. A) و y Consejo ناسيونال دي العلوم Tecnològia (منحة المجلس الوطني رقم 240614 لحركة التحرير).

    Materials

    NameCompanyCatalog NumberComments
    Primers for qRT-PCR assay
    pNIN ForwardCACC ATA GCT CCC CAA AAT GGT AT
    pNIN ReverseCAT CTT CCT TCC ACT AAC TAA C
    M13 ForwardGTA AAA CGA CGG CCA G
    M13 ReverseCAG GAA ACA GCT ATG AC
    NameCompanyCatalog NumberComments
    REAGENTS
    pENTR/D-TOPO Cloning KitInvitrogenK243520
    Gateway LR Clonase II Enzyme Mix Invitrogen11791100
    pBGWFS7.0 Plant systems biologyhttps://gateway.psb.ugent.be/vector/show/pBGWFS7/search/index/
    Platinum Taq DNA PolymeraseThermoFisher Scientific10966018
    DNeasy Plant Mini KitQiagen69104
    PureLink Quick Gel Extraction KitThermoFisher ScientificK210012
    Platinum Pfx DNA PolymeraseInvitrogen11708013
    Certified Molecular Biology AgaroseBio-Rad1613102
    One Shot TOP10 Chemically Competent E. coliInvitrogenC404006
    NaclSigma-AldrichS7653
    TryptoneSigma-AldrichT7293-250G
    Yeast extractSigma-AldrichY1625-250G
    Bacteriological agarSigma-AldrichA5306-1KG
    Kanamycin sulfateSigma-Aldrich60615-25G
    Spectinomycin sulfateSigma-AldrichPHR1441
    Ethyl alcoholSigma-AldrichE7023
    Bacteriological peptoneSigma-AldrichP0556
    Calcium chlorideSigma-AldrichC1016
    Nalidixic acidSigma-AldrichN8878
    Magnesium sulfateSigma-AldrichM7506
    Gel loading solutionSigma-AldrichG7654
    NameCompanyCatalog NumberComments
    EQUIPMENT
    ThermocyclerVeriti Thermal Cycler4375786
    CentrifugeSigmaSigma 1-14K
    Gel documentation unitCarestreamGel Logic 212 PRO
    MaxQ SHKE6000 6000 Shaking Incubator - 115VACThermo scientificEW-51708-70
    Plant growth chamberMRCPGI-550RH
    Horizantal laminarair flow cabinateLumistellLH-120
    Fluorescent microscopeLeicaDM4500 B
    Petridishsym laboratorios90X15
    Scalpel BladeFisher scientific53223
    Falcon 15mL Conical Centrifuge TubesFisher scientific14-959-53A
    22 mL glass tubesThomas scientific45048-16150

    References

    1. Hernández-Garcia, C. M., Finer, J. J. Identification and validation of promoters and cis-actingregulatory elements. Plant Science. 217-218, 109-119 (2014).
    2. Dhanapal, A. P., Govindaraj, M. Unlimited Thirst for Genome Sequencing, Data Interpretation, and Database Usage in Genomic Era: The Road towards Fast-Track Crop Plant Improvement. Genetics Research International. , 684321 (2015).
    3. Nanjareddy, N., Arthikala, M. K., Blanco, L., Arellano, E. S., Lara, M. Protoplast isolation, transient transformation of leaf mesophyll protoplasts and improved Agrobacterium-mediated leaf disc infiltration of Phaseolus vulgaris: Tools for rapid gene expression analysis. BMC Biotechnol. 16 (1), 53 (2016).
    4. Pumplin, N., Zhang, X., Noar, R. D., Harrison, M. J. Polar localization of a symbiosis-specific phosphate transporter is mediated by a transient reorientation of secretion. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (11), E665-E672 (2012).
    5. Kryvoruchko, I. S., et al. MtSWEET11, a Nodule-Specific Sucrose Transporter of Medicago truncatula. Plant Physiol. 171 (1), 554-565 (2016).
    6. Suzaki, T., Yano, K., Ito, M., Umehara, Y., Suganuma, N., Kawaguchi, M. Positive and negative regulation of cortical cell division during root nodule development in Lotus japonicus is accompanied by auxin response. Development. 139 (21), 3997-4006 (2012).
    7. Suzaki, T., et al. Endoreduplication-mediated initiation of symbiotic organ development in Lotus japonicus. Development. 141 (12), 2441-2445 (2014).
    8. Qin, L., et al. The high-affinity phosphate transporter GmPT5 regulates phosphate transport to nodules and nodulation in soybean. Plant Physiol. 159 (4), 1634-1643 (2012).
    9. Wang, Z., Panfeng, L., Yan, Y., Chi, Y., Fan, B., Chen, Z. Expression and Functional Analysis of a Novel Group of Legume-specific WRKY and Exo70 Protein Variants from Soybean. Sci Rep. 6, 32090 (2016).
    10. Montiel, J., et al. A Phaseolus vulgaris NADPH oxidase gene is required for root infection by Rhizobia. Plant Cell Physiol. 53 (10), 1751-1767 (2012).
    11. Arthikala, M. K., et al. PvRbohB negatively regulates Rhizophagus irregularis colonization in Phaseolus vulgaris. Plant Cell Physiol. 54 (8), 1391-1402 (2013).
    12. Arthikala, M. K., Sánchez-López, R., Nava, N., Santana, O., Cárdenas, L., Quinto, C. RbohB a Phaseolus vulgaris NADPH oxidase gene, enhances symbiosome number, bacteroid size, and nitrogen fixation in nodules and impairs mycorrhizal colonization. New Phytol. 202 (3), 886-900 (2014).
    13. Barraza, A., et al. Down-regulation of PvTRE1 enhances nodule biomass and bacteroid number in the common bean. New Phytol. 197 (1), 194-206 (2013).
    14. Estrada-Navarrete, G., et al. An autophagy-related kinase is essential for the symbiotic relationship between Phaseolus vulgaris and both rhizobia and arbuscular mycorrhizal fungi. Plant Cell. 28 (9), 2326-2341 (2016).
    15. Nanjareddy, K., et al. A Legume TOR Protein Kinase Regulates Rhizobium Symbiosis and Is Essential for Infection and Nodule Development. Plant Physiol. 172 (3), 2002-2020 (2016).
    16. Frühling, M., Schröder, G., Hohnjec, N., Pühler, A., Perlick, A. M., Küster, H. The promoter of the Vicia faba L. gene VfEnod12 encoding an early nodulin is active in cortical cells and nodule primordia of transgenic hairy roots of Vicia hirsuta as well as in the prefixing zone II of mature transgenic V. hirsuta root nodules. Plant Science. 160 (1), 67-75 (2000).
    17. Szabados, L., Ratet, P., Grunenberg, B., de Bruijn, F. J. Functional analysis of the Sesbania rostrata leghemoglobin glb3 gene 5'-upstream region in transgenic Lotus corniculatus and Nicotiana tabacum plants. Plant Cell Online. 2 (10), 973-986 (1990).
    18. Madsen, L. H., Tirichine, L., Jurkiewicz, A., Sullivan, J. T., Heckmann, A. B., Bek, A. S., Ronson, C. W., James, E. K., Stougaard, J. The molecular network governing nodule organogenesis and infection in the model legume Lotus japonicus. Nat Commun. 12, 1-10 (2010).
    19. Montiel, J., Arthikala, M. K., Quinto, C. Phaseolus vulgaris RbohB functions in lateral root development. Plant Signal Behav. 8 (1), 1-3 (2013).
    20. Nanjareddy, K., Arthikala, M. K., Gómez, B. M., Blanco, L., Lara, M. Differentially expressed genes in mycorrhized and nodulated roots of common bean are associated with defense, cell wall architecture, N metabolism, and P metabolism. PLoS ONE. 12 (8), e0182328 (2017).
    21. Karimi, M., Inzé, D., Depicker, A. Gateway vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends Plant Sci. 7 (5), 193-195 (2002).
    22. Broughton, W. J., Dilworth, M. J. Control of leghemoglobin synthesis in snake beans. Biochem J. 125 (4), 1075-1080 (1971).
    23. Jefferson, R. A. Assaying chimeric genes in plants, the GUS gene fusion system. Plant Mol Biol Rep. 5 (4), 387-405 (1987).
    24. Cho, H. J., Farrand, S. K., Noel, G. R., Widholm, J. M. High-efficiency induction of soybean hairy roots and propagation of the soybean cyst nematode. Planta. 210 (2), 195-204 (2000).
    25. Deng, Y., Mao, G., Stutz, W., Yu, O. Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays. J. Vis. Exp. (49), e2633 (2011).
    26. Kumagai, H., Kouchi, H. Gene silencing by expression of hairpin RNA in Lotus japonicus roots and root nodules. Mol Plant Microbe Interact. 16 (8), 663-668 (2003).
    27. Okamoto, S., Yoro, E., Suzaki, T., Kawaguchi, M. Hairy Root Transformation in Lotus japonicus. Bio-protocol. 3 (12), e795 (2013).
    28. Jacobs, T. B., Martin, G. B. High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots. J. Vis. Exp. (110), e53843 (2016).
    29. Estrada-Navarrete, G., et al. Agrobacterium rhizogenes-transformation of the Phaseolus spp.: a tool for functional genomics. Mol Plant Microbe Interact. 19 (12), 1385-1393 (2006).

    Reprints and Permissions

    Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

    Request Permission

    Explore More Articles

    130

    This article has been published

    Video Coming Soon

    JoVE Logo

    Privacy

    Terms of Use

    Policies

    Contact Us

    Recommend to library

    JoVE NEWSLETTERS

    Research

    Education

    Authors

    Librarians

    ABOUT JoVE

    Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved