Bitki organizatörü analizleri: Kimlik ve kök nodül belirli organizatörü ortak fasulye içinde karakterizasyonu

Özet

Organizatörü ifade analizleri gen düzenlemesi anlayış ve hedef genlerin kronolojik zamanmekansal ifade geliştirmek için büyük önem taşımaktadır. Burada biz tanımlamak, ayırma ve bir bitki organizatörü klon için bir protokol mevcut. Ayrıca, ortak fasulye kıllı kökleri nodül özgü organizatörü karakterizasyonu açıklar.

Özet

Gen dizileri kodlama ters yönde dizisi organizatörü sırası olarak denir. Organizatör ifade şekillerinin eğitim gen düzenlemesi ve kronolojik zamanmekansal ifade desenleri hedef genlerin anlamakta çok önemli. Öte yandan, organizatörü değerlendirme araçları ve hızlı, verimli ve tekrarlanabilir genetik dönüşüm teknikleri kurmak için önemlidir. Bu çalışmada, biz Phaseolus vulgaris rhizobial sembiyoz özgü nodül kuruluşundan (NIN) organizatörü transgenik kıllı kökleri kronolojik zamanmekansal ifade desenini araştırdık. Bitki genom veritabanları ve biz tespit, analiz araçları kullanmak izole ve P. vulgaris NIN organizatörü chimeric gazeteciye transkripsiyon bir füzyon klonlanmış β-glucuronidase (GUS) GUS-enhanced::GFP. Ayrıca, bu iletişim kuralı bir hızlı ve çok yönlü sistem indüklenen Agrobacterium rhizogenes kıllı kökleri kullanarak P. vulgaris genetik dönüşümünün açıklar. Bu sistem, 10-12 gün sonra dönüştürme ≥2 cm kıllı kökleri oluşturur. Daha sonra aşı Rhizobium kıllı kökleri sonrası aşılama belirli aralıklarla NIN organizatörü kronolojik zamanmekansal ifade değerlendirildi. GUS etkinliği tarafından tasvir bizim sonuçlar NIN organizatörü nodulation işlemi sırasında etkin gösterir. Birlikte, mevcut iletişim kuralı tanımlamak, ayırma, klon ve ortak fasulye kıllı kökleri bir bitki organizatörü karakterize gösterilmiştir. Ayrıca, bu iletişim kuralı olmayan uzman laboratuvarlarda kullanımı kolay.

Giriş

Organizatör ilgi genlerin ifade Yönetmeliği anlamada önemli bir rol oynamak önemli moleküler biyolojik araçlardır. Organizatör akıntıya karşı bulunan DNA dizileri vardır çeviri başlama kodonu gen dizileri ve gen; Merkezi düzenleyici bilgi taşırlar Bu nedenle, onların doğru ek açıklama ve karakterizasyonu gen işlevini anlamak için çok önemlidir. İfade desenleri bağlı olarak bitki rehberleri bünye, doku özgü veya geliştirme aşamasında özel ve indüklenebilir¹sınıflandırılır. Transcriptomic teknolojileri, Bilgisayar modellemesi gelişmeler ve artan sayıda genom dizileri farklı bitki türü için kullanılabilirlik gelişmeler organizatörü dizileri²büyük ölçekli tahmin kolaylaştırdı.

Öte yandan, organizatörü değerlendirme araçları ve hızlı, verimli ve tekrarlanabilir genetik dönüşüm teknikleri kurmak için önemlidir. Diğer model bitkilerin esas Phaseolus sp. istikrarlı genetik dönüşümü için inatçı doğası gereği ortak fasulye baklagil (P. vulgaris) gen işlevsel karakterizasyonu engellemiştir. Geçici dönüşüm sistemleri hızlı gen işlevsel karakterizasyon çalışmaları³için bir alternatif olarak hizmet vermektedir. Baklagil sembiyoz araştırmada, baklagil ana bitki ve rhizobial bakteri arasındaki etkileşimi nodül özel genler ve organizatörü çalışmaların fonksiyonel analiz için en uysal modeli sistemlerinden biridir. Şimdiye kadar bu symbioses ilgili birkaç baklagil rehberleri-si olmak be karakterize, sırasıyla, Medicago truncatula PT4'ü⁴, SWEET11⁵, Lotus japonicus Tepegöz, UBQ⁶, VAG1⁷, Glycine max PT5 ⁸, Exo70J⁹, P. vulgaris RbohB^10,11,12, TRE1¹³, PI3K¹⁴, TOR¹⁵, vs. CIS öğeleri doğrudan gen düzenlemesi etkiler. Transkripsiyon faktörü ENBP1A bir CIS düzenleyici bölgenin erken nodulin VfENOD12 için (−692 bp) bağlar ve bu nodül primordia Vicia faba¹⁶bir muhabir gen ifadesinin kolaylaştırır. CIS düzenleyici bölgeleri değiştirme (−161 −48 bp için) nodül özgü düzenleyicinin leghemoglobin GLB3 kapaklı ile kesilmiş rehberleri δ-p35S ve δ-pNOS, nodül özgüllük kaybına neden ve organizatörü faaliyet^{17 azaltılmış} .

Önceki raporlar NIN kök saç hücreleri rhizobial enfeksiyonu başlatılması için gerekli olduğunu ve aynı zamanda nodül organogenesis L. japonicus¹⁸için gerekli transkripsiyon faktörü gösterin. Bu da çalışmanın, bir protokol tanıma, yalıtım, klonlama ve nodül özgü organizatörü ortak fasulye kıllı kökleri karakterizasyonu açıklar. Bunu başarmak için biz P. vulgaris rhizobial bir sembiyoz özgü NIN organizatörü seçili ve transkripsiyon bir füzyon chimeric gazeteciye GUS enhanced::GFP klonlanmış. Ayrıca, bu iletişim kuralı bir hızlı ve çok yönlü sistem indüklenen A. rhizogenes kıllı kökleri kullanarak P. vulgaris genetik dönüşümünün açıklar. Bu sistem dönüştürme sonra 2 haftadan az kıllı kökleri oluşturur. Son olarak, boyama GUS tarafından kolonize rhizobia kök nodüller NIN organizatörü kronolojik zamanmekansal ifade değerlendirilir.

Burada açıklanan yordamı sadece nodulation ve mycorrhization¹¹ baklagil bitkilerin incelenmesi, ancak aynı zamanda organizatörü ifade desenleri kökleri¹⁹çalışma için yararlı olabilir. Ayrıca, bu iletişim kuralı olmayan uzman laboratuvarlarda kullanımı kolay.

Protokol

1. kimlik, yalıtım ve P. Vulgaris NIN organizatörü klonlama

1. Gen ilgi için organizatörü sırasını tanımlayın. Orada birkaç genom veritabanları ve analiz araçları için bitkiler gibi Phytozome, Ensembl bitkiler, NCBI, vb A baklagil organizatörü P. vulgaris NIN (PvNIN; Phvul.009G115800) bu çalışma²⁰dakika içinde kullanıldı.
2. Tasarım oligos için ağ geçidi veya geleneksel restriksiyon enzimi vektör sistemine bağlı olarak klonlama (şekil 1A) kullanılır.
   Not: Standart (25-35 bp), desalted astar iş para cezası. Organizatörü ve gen arasında sarmayı ters oligo dizileri tavsiye vardır.
3. PvNIN organizatörü bölge (veya gen ilgi organizatörü bölge) taze izole P. vulgaris yükseltmek genomik DNA organizatörü özgü oligo seti kullanarak. Yüksek sadakat polimeraz ile aşağıdaki PCR koşullar kullanın: 95 ° C 5 dakika; 30 döngüsü (95 ° C 30 s, 30 55 ° C s, 1 dk 72 ° C); ve 5 min için 72 ° C.
4. % 1'özel jel 60 V 7 x 10 cm jel tepside güçlendirilmiş parçası çalıştırın ve karşılık gelen amplicon elute (700 bp, şekil 1B) ve üreticinin yönergelerine göre pENTR/D-TOPO vektör içine klon.
5. Tepki yetkili Escherichia coli içine 2 µL dönüştürmek lysogeny kardeşim (LB) 50 mg/L sefaloridin (Kan50) ile desteklenmiş üreticinin yönergeleri ve plaka 150 µL dönüştürme karışımı kullanarak hücreleri. 37 ° C'de kaplama hücreleri gecede büyümek.
6. 3-6 kolonileri ve onları Kan50 içeren LB ortamda gecede kültür seçin. Plazmid DNA seçtiğiniz yöntemi kullanarak yalıtmak ve plazmid tarafından PCR vektör belirli M13 oligos kullanarak çözümleyebilirsiniz. PCR, plazmid, 0 pm 3, oligos, kullanım 100 ng için 10 PCR arabellek, 0.5 U Taq DNA polimeraz ve 10 mM dNTPs X.
7. Aşağıdaki PCR güçlendirme koşullar kullanın; 3 min için 95 ° C; 30 döngüsü (95 ° C 30 s, 30 58 ° C s, 75 72 ° C s); ve 7 dk. 72 ° C % 1'özel jel PCR ürünlerde görselleştirin. Doğru eklemeleri 1.024 bp ve vektörler ekler olmadan bir 324 bp grup (şekil 1 c) sahip bir band olduğundan emin olun.
8. LR tepki bir giriş vektör (pENTR/D-TOPO-PvNIN) ve üreticinin yönergelerine göre ticari enzim karışımı kullanarak hedef vektör pBGWFS7.0²¹ arasında gerçekleştirin.
9. LR tepki yetkili E. coli içine 2 µL dönüşümü üreticinin yönergeleri ve plaka 150 µL dönüştürme karışımı 100 mg/L Spektinomisin (Spe100) ile desteklenmiş LB açıklandığı gibi standart yöntemlerle hücreleri. 37 ° C'de kaplama hücreleri gecede büyümek.
10. Yaklaşık 5 kolonileri alın ve onları bir gecede Spe100 içeren LB ortamda kültür. Plazmid DNA seçtiğiniz yöntemi kullanarak yalıtmak ve plazmid tarafından PCR organizatörü özgü oligos kullanarak çözümleyebilirsiniz.
11. PCR koşulları adım 1.3 kullanın. Amplifikasyon onaylamak için % 1'özel jel PCR ürünlerde görselleştirin. Amplicons olan 700 bp.
12. Pozitif plazmid pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP (şekil 1 d) ekleme orijinalliğini doğrulamak için organizatörü özgü oligos ile sıra.
13. Plazmid ( A. rhizogenes diğer suşların ancak, kullanılabilir) A. rhizogenes süzün K599 dönüşümü. Aşağıdaki ayarlarla electrocompetent hücreleri ve electroporate 1 mm küvet içinde 50 µL plazmid hazırlık 2 µL ekleyin: 1.8 kV, 25 µF ve 200 Ω.
14. Hücreleri kurtarmak ~ 500 µL SOC orta ve 28 ° c için 2 h. LB-Spe100 tabağa sallamak ve 28 ° C de 2 gün büyümek.
15. 1.7. adımda belirtildiği gibi koloni tarama gerçekleştirmek ve PCR koşulları adım 1.3 olduğu gibi kullanın. Gliserol hisse senetleri olumlu klonları yapamaz ve stok onları içinde-80 ° C.
16. A. rhizogenes kültür negatif kontrol olarak boş pBGWFS7.0 vektör yataklık kullanın.

2. A. Rhizogenes kıllı kökleri ortak Bean dönüştürdü

1. Fasulye (P. vulgaris cv. zenci Jamapa) tohumları (yaklaşık 20) 50 ml % 96 etanol 1 dk. için sterilize ve etanol atın; daha sonra sabit bir laminar akış mahallede karıştırma ile 10 dakika, 50 mL % 20 çamaşır suyu (sodyum hipoklorit) ekleyin. Çamaşır suyu kaldırmak ve 3 kat fazla steril suda yıkayın.
   Not: Diğer P. vulgaris çeşitlerin kıllı kök indüksiyon için kullanılabilir.
2. Steril filtre kağıtları Broughton ile nemlendirilmiş sterilize tohumlar çimlenme & Dilworth (B & D) çözüm²² (Tablo 1) içinde belgili tanımlık karanlık 28 ° C'de 2 gün
3. Dönüşüm önceki gün birini hazırlayın:
   1. A. rhizogenes kültür (1.13 ve 1.14 adımlarda hazır) ikili vektör yataklık 150 µL dışarı katı LB Spe100 üzerinde çizgi ve 28 ° C'de gecede büyümek.
   2. 15 mL tüp B ile doldurmak & D çözüm ve Değiştir çift katmanlı alüminyum folyo ile vidalı kapak. B 10 mL içeren bir 22 cm cam tüp monte & D çözüm (şekil 2C) ve basınçlı kap onu.
4. Dönüşüm günü, laminar akış hood aşağıdaki steril malzemeler montajı: germinated tohum kimden adım 2.2, adım 2.3.1, adım 2.3.2 tüpler, steril Çift Kişilik distile su (10 mL), Pipetler ve pipet ipuçları, steril forseps, kültür plaka ve 3 mL şırınga.
5. Bükülmüş bir 200 µL ipucu plaka A. rhizogenes hücrelerden microcentrifuge tüpüne scrape ve 1 mL çiftli steril su resuspend için kullanın. Benzer şekilde, ayrı ayrı vektör kontrol hücreleri hazırlayın.
   1. Yavaşça resuspend hücrelere karıştırın. Değil girdap yapmak.
6. Tüpler alüminyum folyo adım steril pipet ucu kullanarak 2.3.2 üzerinde 3 mm delik açın.
7. Adım 2.5 şırınga hücreleri (organizatörü ya da vektör kontrolü) toplamak ve biraz hypocotyls iğne ucu (Şekil 2 g) ile germinated tohum dikmek.
   Not: iğne nüfuz eder (4 - 6 kat) damar dokusu emin olun ve küçük enjekte (~ 5 µL) hücre hypocotyl etrafında farklı pozisyonlarda yaranın üzerine düşer.
8. Dikkatle sokmak enjekte fidan köklerinin B içeren 15 mL tüp 3 mm delik & D çözüm. Tüm kurulum 22 mL cam tüpler dönmek ve onları nem korumak için mühür.
9. 16 h ışık: 8 ile 28 ° C'de tutulan bir büyüme odası tüplerde kuluçkaya s karanlık photoperiod.
   Notlar: 3-4 gün sonra kuluçka, 22 mL cam tüpler azına kadar bitkiler büyümek.

Bu aşamada, caps kaldırmak ve şekil 2Iiçinde gösterildiği gibi RIM ile parafilm kök etrafında mühür.

Kallus yaralama sitelerdeki 5-7 gün gözlemlemek ve bulmak ~ 2 cm kıllı kökleri tarafından 10-12 gün sonra dönüştürme.
Not: B sağlamak önemlidir & D sürekli plastik ve cam tüpler çözümde.

2 hafta sonra birincil kök kök kıllı kökleri aşağıda 2 cm kesim tarafından kaldırmak ve birincil kökleri steril vermikülit içeren tencere nakli. Bir büyüme odası (16 h ışık: 8 h 28 ° C'de karanlık) tesislerinde korumak ve B ile sulama & D çözüm.

3. organizatörü analizi: NIN organizatörü ifade ortak Bean Rhizobial nodüller

1. Kök nodüller indüksiyon için aşılamak Rhizobium tropici veya (ortak fasulye uyumlu olan) Dana eti tas Rhizobium 700 mM CaCl₂ ve 20 mg mL^{– 1} ile desteklenmiş PY orta (0.5 g pepton, 0.3 g maya özü) 100 ml nalidixic asit. 24 h 30 ° C'de 300 devir / dakikada sallayarak ile kuluçkaya.
   Not: Belirli herhangi bir antibiyotik transgenik Rhizobiumsöz konusu olduğunda kullanılabilir.
2. 2.800 x g oda sıcaklığında, 3 dk santrifüj hücrelerde cips ve 10 mL 10 mM MgSO₄resuspend. 0,6 OD₆₀₀ hücrelere OD seyreltme 10 mM MgSO₄ile ayarlayın.
3. 1-2 mL (3.2 adımından hazır) kültür kıllı kökleri üzerinde nodül büyümesini teşvik için bitki (organizatörü ve vektör kontrolü) başına aşılamak. B bitkilerle sulama & nodulation tanıtmak için sınırlı azot (2 mM KNO₃) ile D çözüm.
4. Deneysel ihtiyaç bağlı olarak, farklı zaman noktalarda kıllı kökleri toplamak. 3-5 gün arasında enfeksiyon konu çalışmak için toplama örnekleri aşılama (dpi) sonrası.
   Not: İlkel nodül ve genç nodüller 6-9 dpi ve 10-12 gün dpi, sırasıyla ele. Son olarak, olgun ve fonksiyonel nodüller, 14-21 dpi ve senesced nodüller, okudu > 28 dpi.
5. Kök/nodüller reporter genler (GUS veya GFP) etkinlik için işlem. GUS etkinlik Jefferson²³tarafından açıklanan protokolüne göre analiz. GFP floresan mikroskop altında gözlemlemek. GFP floresan mavi argon iyon lazer ile tahrik (488 nm) ve verilmiş Floresans 510 toplamak için 540 nm.

Sonuçlar

Bu çalışmanın amacı nodül özel P. vulgaris NIN kronolojik zamanmekansal ifade desenini değerlendirmek için yapıldı. Bunu yapmak için çeviri başlama kodonu NIN gen, akıntıya karşı 700 bp bölge seçildi ve birtakım oligos şekil 1A' tasvir gibi tasarlanmıştır. Yüksek sadakat polimeraz kullanarak NIN organizatörü parçası güçlendirilmiş, (şekil 1B) izole ve transkripsiyon bir füzyon ...

Tartışmalar

Sırasında fonksiyonel analiz genlerin çalışma gen ifade kalıplarının genler vivo içindekayma ve temporal Yönetmeliği anlamada önemli bir rol oynar. Gen ifade desen çalışması için iyi bilinen bir yöntem gen düzenleyici bölgesi faiz, clone etmektir muhabir genlerle floresan marker gen (GFP, RFP, vb) veya β-glucuronidase gibi ters yönde. Burada, kök nodül sembiyoz (RNS) belirli bir gen, P. vulgaris spatio-temporal ifade desenleri RNS sırasında çalışmaya NIN, organizat?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Primers for qRT-PCR assay
pNIN Forward	CACC ATA GCT CCC CAA AAT GGT AT
pNIN Reverse	CAT CTT CCT TCC ACT AAC TAA C
M13 Forward	GTA AAA CGA CGG CCA G
M13 Reverse	CAG GAA ACA GCT ATG AC
Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
pENTR/D-TOPO Cloning Kit	Invitrogen	K243520
Gateway LR Clonase II Enzyme Mix	Invitrogen	11791100
pBGWFS7.0	Plant systems biology	https://gateway.psb.ugent.be/vector/show/pBGWFS7/search/index/
Platinum Taq DNA Polymerase	ThermoFisher Scientific	10966018
DNeasy Plant Mini Kit	Qiagen	69104
PureLink Quick Gel Extraction Kit	ThermoFisher Scientific	K210012
Platinum Pfx DNA Polymerase	Invitrogen	11708013
Certified Molecular Biology Agarose	Bio-Rad	1613102
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli	Invitrogen	C404006
Nacl	Sigma-Aldrich	S7653
Tryptone	Sigma-Aldrich	T7293-250G
Yeast extract	Sigma-Aldrich	Y1625-250G
Bacteriological agar	Sigma-Aldrich	A5306-1KG
Kanamycin sulfate	Sigma-Aldrich	60615-25G
Spectinomycin sulfate	Sigma-Aldrich	PHR1441
Ethyl alcohol	Sigma-Aldrich	E7023
Bacteriological peptone	Sigma-Aldrich	P0556
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C1016
Nalidixic acid	Sigma-Aldrich	N8878
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506
Gel loading solution	Sigma-Aldrich	G7654
Name	Company	Catalog Number	Comments
EQUIPMENT
Thermocycler	Veriti Thermal Cycler	4375786
Centrifuge	Sigma	Sigma 1-14K
Gel documentation unit	Carestream	Gel Logic 212 PRO
MaxQ SHKE6000 6000 Shaking Incubator - 115VAC	Thermo scientific	EW-51708-70
Plant growth chamber	MRC	PGI-550RH
Horizantal laminarair flow cabinate	Lumistell	LH-120
Fluorescent microscope	Leica	DM4500 B
Petridish	sym laboratorios	90X15
Scalpel Blade	Fisher scientific	53223
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher scientific	14-959-53A
22 mL glass tubes	Thomas scientific	45048-16150