Pflanzenanalysen Promoter: Identifizierung und Charakterisierung der Root Knoten bestimmten Promoter in die Gartenbohne

Zusammenfassung

Promoter-Expressionsanalysen sind entscheidend für besseres Verständnis der Genregulation und der raumzeitlichen Ausdruck der Zielgene. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um zu identifizieren, zu isolieren und zu klonen einen Pflanzen-Promotor. Darüber hinaus beschreiben wir die Charakterisierung des Knötchen-spezifischen Promotors in den gemeinsamen Bohne behaarte Wurzeln.

Zusammenfassung

Die vorgelagerten Sequenzen des Gens Codierung Sequenzen werden als Promotorsequenzen bezeichnet. Studieren die Expressionsmuster der Promotoren sind sehr bedeutsam für das Verständnis der Genregulation und raumzeitlichen Expressionsmuster von Zielgenen. Auf der anderen Seite ist es auch entscheidend für die Projektträger Bewertungsinstrumente und genetische Transformation Techniken, die schnell, effizient und reproduzierbar zu etablieren. In dieser Studie untersuchten wir die raumzeitlichen Expressionsmuster der rhizobial Symbiose-spezifische Knötchen Gründung (NIN) Förderer der Phaseolus Vulgaris in den transgenen behaarte Wurzeln. Mit pflanzlichen Genom Datenbanken und Analyse-Tools, die wir identifiziert, isoliert und geklont p. Vulgaris NIN Promotor transkriptionelle Verschmelzung der Chimären Reporter β-Glucuronidase (GUS) GUS-enhanced::GFP. Dieses Protokoll beschreibt weiter, ein schnelles und vielseitiges System genetische Veränderung bei p. Vulgaris mit Agrobacterium Rhizogenes induzierte behaarte Wurzeln. Dieses System erzeugt ≥2 cm behaarte Wurzeln bei 10 bis 12 Tage nach der Transformation. Als nächstes untersuchten wir den raumzeitlichen Ausdruck von NIN Promoter in Rhizobium geimpft behaarte Wurzeln in regelmäßigen Abständen nach Inokulation. Unsere Ergebnisse dargestellt von GUS-Aktivität zeigen, dass der NIN-Veranstalter während des Prozesses der Nodulation aktiv war. Zusammen, veranschaulicht dieses Protokolls zu identifizieren, zu isolieren, Klonen und zu charakterisieren einen Pflanzen-Promotor in den gemeinsamen Bohne behaarte Wurzeln. Darüber hinaus ist dieses Protokoll in nicht spezialisierten Labors einfach zu bedienen.

Einleitung

Promotoren sind wichtige molekularen biologischen Werkzeuge, die eine entscheidende Rolle bei die Regulierung der Genexpression von Interesse zu verstehen. Promotoren sind DNA-Sequenzen befindet sich oberhalb der Übersetzung Einleitung Codon des Gens-Sequenzen und tragen die zentrale regulatorische Informationen Gene; Daher sind ihre korrekte Beschriftung und Charakterisierung entscheidend zum Verständnis der Genfunktion. Abhängig von der Expressionsmuster sind Pflanze Promotoren als konstitutive, Gewebe-spezifische oder Bühne-entwicklungsspezifische und induzierbaren¹eingestuft. Fortschritte in der transkriptomischen Technologien, Verbesserungen der Computermodellierung und die Verfügbarkeit der steigenden Zahl von Genomsequenzen für verschiedene Pflanzenarten haben die groß angelegte Vorhersage von Promoter Sequenzen²erleichtert.

Auf der anderen Seite ist es auch entscheidend für die Projektträger Bewertungsinstrumente und genetische Transformation Techniken, die schnell, effizient und reproduzierbar zu etablieren. Im Gegensatz zu den anderen Modellpflanzen wird die funktionelle Charakterisierung der gemeinsamen Bohnen Leguminosen (p. Vulgaris) Gene vor allem wegen der widerspenstigen Natur Phaseolus SP. für stabile gentechnische Transformation behindert. Transiente Transformationssysteme dienen als Alternative für schnelle gen funktionelle Charakterisierung Studien³. Hülsenfrucht Symbiose Forschung ist die Interaktion zwischen der Hülsenfrucht Wirtspflanze und rhizobial Bakterium eine der am meisten gefügig Modellsysteme für die Funktionsanalyse von Knötchen-spezifischen Genen und Projektträger Studien. Bisher wurden mehrere Hülsenfrucht Promotoren im Zusammenhang mit diesen Symbiosen gekennzeichnet, dh., Medicago Truncatula PT4⁴, SWEET11⁵, Lotus Japonicus Cyclops, UBQ⁶, VAG1⁷, Glycine max PT5 ⁸, Exo70J⁹, p. Vulgaris RbohB^10,11,12, TRE1¹³, PI3K¹⁴, TOR¹⁵, etc.. GUS Elemente beeinflussen direkt die Genregulation. Der Transkriptionsfaktor ENBP1A bindet an eine regulatorische Region GUS (−692 bp) des frühen Nodulin VfENOD12, und dies ermöglicht den Ausdruck von ein Reportergen in Knötchen Primordia Vicia Faba¹⁶. Ersatz von regulatorischen Regionen GUS (−161 zu −48 bp) des Projektträgers Knötchen-spezifische Leghemoglobin GLB3 mit der heterologen abgeschnitten Promotoren δ-p35S und δ-pNOS, führte zu einem Verlust der Knötchen Spezifität und reduziert Promotoraktivität¹⁷ .

Frühere Berichte zeigen, dass der Transkriptionsfaktor NIN ist erforderlich für die Einleitung von rhizobial Infektion in den Zellen der Wurzelhaare und ist auch wichtig für Knötchen Organogenese in L. Japonicus¹⁸. In der vorliegenden Studie beschreiben wir ein Protokoll zur Identifikation, Isolierung, Klonierung und Charakterisierung von Knötchen-spezifischen Promoter in den gemeinsamen Bohne behaarte Wurzeln. Um dies zu erreichen, wir wählten rhizobial Symbiose-spezifische NIN Förderer von p. Vulgaris und transkriptionelle Verschmelzung der Chimären Reporter GUS-enhanced::GFP geklont. Dieses Protokoll beschreibt weiter, ein schnelles und vielseitiges System genetische Veränderung bei p. Vulgaris mit A. Rhizogenes induzierte behaarte Wurzeln. Dieses System erzeugt behaarte Wurzeln in weniger als 2 Wochen nach der Transformation. Zu guter Letzt untersuchten wir den raumzeitlichen Ausdruck von NIN Promoter in kolonisiert Rhizobien Wurzelknöllchen von GUS Färbung.

Das hier beschriebene Verfahren kann nicht nur für das Studium der Nodulation und Mykorrhizierung¹¹ Hülsenfrucht Pflanzen, sondern auch für das Studium der Projektträger Expressionsmuster in Wurzeln¹⁹nützlich. Darüber hinaus ist dieses Protokoll in nicht spezialisierten Labors einfach zu bedienen.

Protokoll

1. Identifizierung, Isolierung und Klonen von P. Vulgaris NIN Promoter

1. Promotorsequenz für das gen des Interesses zu identifizieren. Es gibt mehrere Genom Datenbanken und Analyse-Tools für Pflanzen wie Phytozome, Ensembl Pflanzen, NCBI, etc. A Hülsenfrucht Promotor p. Vulgaris NIN (PvNIN; Phvul.009G115800) wurde in dieser Studie²⁰verwendet.
2. Design Oligos entweder für Gateway oder traditionelle Restriktionsenzym je nach Vektorsystem Klonen verwendet (Abbildung 1A).
   Hinweis: Standard (25-35 bp), entsalzte Primer funktionieren. Umgekehrte Oligo-Sequenzen, die zwischen dem Veranstalter und dem Gen flankieren sind empfehlenswert.
3. Verstärken Sie die PvNIN-Promotor-Region (oder Promotor-Region des Gens von Interesse) aus frisch isolierte p. Vulgaris genomischer DNA mit dem Promotor-spezifische Oligo-Set. Verwenden Sie eine High Fidelity Polymerase mit folgenden PCR-Bedingungen: 95 ° C für 5 min; 30 Zyklen (95 ° C für 30 s, 55 ° C für 30 s, 72 ° C für 1 min); und 72 ° C für 5 Minuten.
4. Verstärkte Fragment auf 1 % Agarose-Gel bei 60 V auf einem 7 x 10 cm Gel Tablett führen, und die entsprechenden Amplikons eluieren (700 bp, Abbildung 1 b) und Klon in den pENTR/D-TOPO-Vektor nach den Anweisungen des Herstellers.
5. Transformieren von 2 µL der Reaktion in kompetenten Escherichia coli Zellen mit den Anweisungen des Herstellers und Platte 150 µL der Transformation Mischung auf Lysogeny Bruder (LB) mit 50 mg/L Kanamycin (Kan50) ergänzt. Wachsen Sie die vergoldeten Zellen bei 37 ° C über Nacht.
6. Wählen Sie zwischen 3-6 Kolonien und Kultur, die sie über Nacht in LB-Medium mit Kan50. Isolieren Sie Plasmid DNA mit Hilfe der Methode der Wahl zu und zu analysieren Sie das Plasmid mittels PCR unter Verwendung der Vektor spezifische M13 Oligos. Für PCR, Einsatz 100 ng von Plasmid, 12:03 von Oligos, 10 X PCR-Puffer, 0,5 U Taq-DNA-Polymerase und 10 mM dNTPs.
7. Verwenden Sie die folgenden PCR Verstärkung Bedingungen; 95 ° C für 3 min; 30 Zyklen (95 ° C für 30 s, 58 ° C für 30 s, 72 ° C für 75 s); und 72 ° C für 7 min. visualisieren die PCR-Produkte auf einem 1 % Agarose-Gel. Sicherstellen Sie, dass die richtigen Einlagen haben ein Band bei 1.024 bp und Vektoren ohne Einsätze wird eine 324 bp Band (Abbildung 1).
8. Führen Sie die LR-Reaktion zwischen einem Eintrag Vektor (pENTR/D-TOPO-PvNIN) und Ziel Vektor pBGWFS7.0²¹ mit einem kommerziellen Enzym-Mix entsprechend den Anweisungen des Herstellers.
9. Transformieren von 2 µL der LR Reaktion in kompetente E. Coli Zellen mit standard-Techniken, wie in den Anweisungen des Herstellers und Platte 150 µL Transformation Mischung auf LB ergänzt mit 100 mg/L Spectinomycin (Spe100) beschrieben. Wachsen Sie die vergoldeten Zellen bei 37 ° C über Nacht.
10. Wählen Sie etwa 5 Kolonien und Kultur sie über Nacht in LB-Medium mit Spe100. Isolieren Sie das Plasmid DNA mit Hilfe einer Methode der Wahl zu und analysieren Sie das Plasmid mittels PCR unter Verwendung der Promotor-spezifische Oligos.
11. Verwenden Sie die PCR-Zustände im Schritt 1.3. Visualisieren Sie die PCR-Produkte auf einem 1 % Agarosegel, Verstärkung zu bestätigen. Amplifikate sind 700 bp.
12. Reihenfolge der positiven Plasmid pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GLP (Abbildung 1) mit dem Promotor-spezifische Oligos, die Echtheit des Einsatzes.
13. Verwandeln Sie die Plasmiden in A. Rhizogenes Stamm K599 (jedoch können jede andere Stämme von A. Rhizogenes verwendet werden). 50 µL der Electrocompetent Zellen und Electroporate in einem 1 mm-Küvette 2 µL Plasmid Prep hinzufügen, mit den folgenden Einstellungen: 1,8 kV, 25 µF und 200 Ω.
14. Wiederherstellen von Zellen in ~ 500 µL SOC-Medium und schütteln bei 28 ° C für 2 h Platte auf LB-Spe100 und wachsen bei 28 ° C für 2 Tage.
15. Durchführen Sie Kolonie Screening, wie unter Schritt 1,7 und verwenden Sie die PCR-Zustände wie in Schritt 1.3. Glycerin-Bestände von positive Klone und speichern Sie diese bei-80 ° C.
16. Verwenden Sie A. Rhizogenes Kultur beherbergen leer pBGWFS7.0 Vektor als die negativ-Kontrolle.

2. A. Rhizogenes verwandelt behaarte Wurzeln die Gartenbohne

1. Sterilisieren Sie Bohnensamen (p. Vulgaris CV Negro Jamapa) (ca. 20) in 50 mL Ethanol 96 % für 1 min und entsorgen Sie das Ethanol; dann fügen Sie 50 mL 20 % Bleichmittel (Natriumhypochlorit) für 10 min, mit konstanten Mischen in einer Laminar-Flow-Haube. Entfernen Sie das Bleichmittel und waschen Sie 3 Mal in überschüssige steriles Wasser.
   Hinweis: Andere p. Vulgaris -Sorten können für behaarte Wurzel Induktion verwendet werden.
2. Die sterilisierten Samen auf sterile Filterpapiere angefeuchtet mit Broughton Keimen & Dilworth (B & D) Lösung²² (Tabelle 1) für 2 Tage im Dunkeln bei 28 ° C.
3. Bereiten Sie am Tag vor der Transformation Folgendes:
   1. Streifen aus 150 µL A. Rhizogenes Kultur beherbergen die binären Vektor (vorbereitet in Schritten 1.13 und 1.14) auf solide LB Spe100 und wachsen bei 28 ° C über Nacht.
   2. Füllen Sie eine 15 mL-Tube mit B & D-Lösung und ersetzen die Schraubkappe mit doppelt geschichteten Aluminium-Folie. Montieren Sie diese in eine 22 cm-Glasrohr mit 10 mL B & D-Lösung (Abbildung 2) und Autoklaven es.
4. Am Tag der Transformation, montieren die folgenden sterilen Materialien in einem Laminar-Flow-Abzug: gekeimten Samen aus Schritt 2.2, Kultur-Platte aus Schritt 2.3.1, Rohre aus Schritt 2.3.2, sterile doppelt destilliertes Wasser (10 mL), Pipetten und Pipettenspitzen, sterile Pinzetten, und 3 mL Spritzen.
5. Verwenden Sie eine gebogene Spitze 200 µL A. Rhizogenes Zellen von der Platte zu einem Microcentrifuge Schlauch zu kratzen und in 1 mL der doppelten steriles Wasser Aufschwemmen. In ähnlicher Weise bereiten Sie Vektor Kontrollzellen getrennt.
   1. Mischen Sie die Zellen sanft aufzuwirbeln. Tun Sie nicht Wirbel.
6. Machen Sie ein Loch mit 3 mm auf der Alufolie der Rohre aus Schritt mit einer sterilen Pipettenspitze 2.3.2.
7. Kassiere Schritt 2.5 mit der Spritze in die Zellen (Veranstalter oder Vektor-Steuerung) und leicht stechen die Hypocotyle der gekeimten Samen mit der Nadelspitze (Abbildung 2).
   Hinweis: Sicherstellen, dass die Nadel dringt (4 - 6 Mal) der Aderhaut und spritzen kleine (~ 5 µL) sinkt der Zellen auf die Wunde an verschiedenen Positionen um die Keimachse.
8. Legen Sie die Wurzeln der injizierten Sämlinge in das 3 mm Loch von der 15 mL Tube mit B & D-Lösung. Wieder das gesamte Setup in den 22 mL Glasröhrchen und versiegeln Sie, um Feuchtigkeit zu halten.
9. Inkubieren Sie die Rohre in einem Wachstum beibehalten bei 28 ° C mit 16 h Licht: 8 h dunkel Photoperiode.
   Hinweise: 3-4 Tage nach der Inkubation, wachsen die Pflanzen bis zum Rand der Glasröhren 22 mL.

Entfernen Sie in diesem Stadium die Kappen und versiegeln Sie die Felge mit Parafilm um den Stamm zu, wie in Abbildung 2Igezeigt.

Beobachten der Kallus an der Verwundung Standorten ca. 5-7 Tage und finden ~ 2 cm behaarte Wurzeln von 10 bis 12 Tage nach der Transformation.
Hinweis: Es ist wichtig, die B & D Lösung ständig in Kunststoff und Glas-Röhrchen.

Entfernen Sie nach 2 Wochen die primäre Wurzel durch den Stamm 2 cm unterhalb der behaarten Wurzeln abschneiden und verpflanzen der Hauptwurzeln in Töpfen mit sterilen Vermiculit. Pflegen die Pflanzen in einer Kammer Wachstum (16 h Licht: 8 h dunkel bei 28 ° C) und spülen Sie mit B & D-Lösung.

(3) Förderer Analyse: NIN Promoter Ausdruck in Rhizobial Knötchen der Gartenbohne

1. Impfen Sie für die Induktion von Wurzelknöllchen Rhizobium Tropici oder Rhizobium etli¬ (das sind kompatibel zu der Gartenbohne) in 100 mL PY Medium (0,5 g Pepton, 0,3 g Hefeextrakt) mit 700 mM CaCl₂ und 20 mg mL⁻¹ ergänzt Nalidixic Säure. Bei 30 ° C für 24 h unter Schütteln bei 300 u/min inkubieren.
   Hinweis: Bei transgenen Rhizobiumkonnte keine spezifische Antibiotika verwendet werden.
2. Pellet-Zellen in einer Zentrifuge für 3 min bei 2.800 x g bei Raumtemperatur und in 10 mL 10 mM MgSO₄aufzuwirbeln. OD der Zellen um 0,6 OD₆₀₀ durch Verdünnung mit 10 mM MgSO₄einstellen.
3. 1-2 mL der Kultur (aus Schritt 3.2 vorbereitet) pro Pflanze (Promoter und Vektor-Steuerung) induzieren Wachstum Knötchen an den behaarten Wurzeln zu impfen. Bewässern der Pflanzen mit B & D-Lösung mit begrenzten Stickstoff (2 mM KNO₃) Nodulation zu fördern.
4. Je nach der experimentellen Bedarf sammeln Sie die behaarten Wurzeln zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Sammele Proben zur Untersuchung Infektion Fäden zwischen 3-5 Tage post Inokulation (dpi).
   Hinweis: Ur Knötchen und junge Knötchen können bei 6-9 dpi und 10-12 Tage dpi bzw. untersucht werden. Schließlich, ausgereifte und funktionelle Knötchen können untersucht werden, bei 14-21 dpi und gealtert Knötchen am > 28 dpi.
5. Verarbeiten Sie die Wurzelknöllchen für die Aktivität des Reporter-Gene (GUS oder GLP). Analysieren Sie GUS-Aktivität nach dem Protokoll von Jefferson²³beschrieben. Beobachten Sie GFP unter dem Fluoreszenzmikroskop. GFP-Fluoreszenz zu begeistern, mit einem blauen Argon-Ionen-Laser (488 nm), und sammle die emittierte Fluoreszenz von 510 auf 540 nm.

Ergebnisse

Das Ziel dieser Studie war es, das räumlich-zeitliche Expressionsmuster der Knötchen-spezifische p. Vulgaris NIN zu beurteilen. Zu diesem Zweck wurde ein 700 bp Region stromaufwärts von der Übersetzung Einleitung Codon des Gens NIN ausgewählt und eine Reihe von Oligos entworfen wurde, wie in Figur 1Adargestellt. Mit Hilfe einer High Fidelity Polymerase, NIN Promoter Fragment wurde verstärkt, isoliert (Abbildung 1 b...

Diskussion

Während der Funktionsanalyse von Genen Rolle die Untersuchung von gen-Expressionsmuster eine entscheidende für das Verständnis der räumlichen und zeitlichen Regelung der Gene in Vivo. Eine bekannte Methode, gen Expressionsmuster zu studieren ist, die gen-Promotor-Region von Interesse, zu klonen, Reporter-Gene wie fluoreszierende Marker-Gene (GFP, RFP, etc.) oder β-Glucuronidase upstream. Hier haben wir eine Promotor-Region des Wurzel Knötchen Symbiose (RNS) spezifischen Gens, NIN, die räumlich-ze...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Primers for qRT-PCR assay
pNIN Forward	CACC ATA GCT CCC CAA AAT GGT AT
pNIN Reverse	CAT CTT CCT TCC ACT AAC TAA C
M13 Forward	GTA AAA CGA CGG CCA G
M13 Reverse	CAG GAA ACA GCT ATG AC
Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
pENTR/D-TOPO Cloning Kit	Invitrogen	K243520
Gateway LR Clonase II Enzyme Mix	Invitrogen	11791100
pBGWFS7.0	Plant systems biology	https://gateway.psb.ugent.be/vector/show/pBGWFS7/search/index/
Platinum Taq DNA Polymerase	ThermoFisher Scientific	10966018
DNeasy Plant Mini Kit	Qiagen	69104
PureLink Quick Gel Extraction Kit	ThermoFisher Scientific	K210012
Platinum Pfx DNA Polymerase	Invitrogen	11708013
Certified Molecular Biology Agarose	Bio-Rad	1613102
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli	Invitrogen	C404006
Nacl	Sigma-Aldrich	S7653
Tryptone	Sigma-Aldrich	T7293-250G
Yeast extract	Sigma-Aldrich	Y1625-250G
Bacteriological agar	Sigma-Aldrich	A5306-1KG
Kanamycin sulfate	Sigma-Aldrich	60615-25G
Spectinomycin sulfate	Sigma-Aldrich	PHR1441
Ethyl alcohol	Sigma-Aldrich	E7023
Bacteriological peptone	Sigma-Aldrich	P0556
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C1016
Nalidixic acid	Sigma-Aldrich	N8878
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506
Gel loading solution	Sigma-Aldrich	G7654
Name	Company	Catalog Number	Comments
EQUIPMENT
Thermocycler	Veriti Thermal Cycler	4375786
Centrifuge	Sigma	Sigma 1-14K
Gel documentation unit	Carestream	Gel Logic 212 PRO
MaxQ SHKE6000 6000 Shaking Incubator - 115VAC	Thermo scientific	EW-51708-70
Plant growth chamber	MRC	PGI-550RH
Horizantal laminarair flow cabinate	Lumistell	LH-120
Fluorescent microscope	Leica	DM4500 B
Petridish	sym laboratorios	90X15
Scalpel Blade	Fisher scientific	53223
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher scientific	14-959-53A
22 mL glass tubes	Thomas scientific	45048-16150