Analisi del promotore di pianta: Identificazione e caratterizzazione di radice nodulo specifico promotore nel fagiolo comune

Riepilogo

Analisi di espressione del promotore sono cruciali per migliorare la comprensione della regolazione genica e l'espressione di geni bersaglio spatiotemporal. Qui presentiamo un protocollo per identificare, isolare e clonare un promotore di pianta. Ulteriormente, descriviamo la caratterizzazione del nodulo specifico promotore nelle radici pelosi fagiolo comune.

Abstract

Le sequenze a Monte del gene sequenze codificanti sono definite come sequenze promotrici. Studiando i modelli di espressione dei promotori sono molto significativi nella comprensione della regolazione genica e modelli di spatiotemporal espressione di geni bersaglio. D'altra parte, è anche fondamentale per stabilire gli strumenti di valutazione del promotore e tecniche di trasformazione genetica che sono veloce, efficace e riproducibile. In questo studio, abbiamo studiato il modello di espressione spatiotemporal del promotore inception (NIN) rhizobial specifico simbiosi nodulo di Phaseolus vulgaris nelle radici pelosi transgenici. Utilizzo di pianta genoma database e strumenti di analisi che abbiamo identificato, isolato e clonato il promotore del NIN di p. vulgaris in una fusione trascrizionale al reporter chimerico β-glucuronidasi (GUS) GUS-enhanced::GFP. Inoltre, questo protocollo descrive un sistema rapido e versatile di trasformazione genetica in p. vulgaris mediante Agrobacterium rhizogenes indotto pelosi radici. Questo sistema genera radici pelosi di ≥ 2 cm a 10-12 giorni dopo la trasformazione. Successivamente, abbiamo valutato l'espressione spatiotemporal del promotore di NIN nelle radici pelosi Rhizobium inoculati a intervalli periodici di post-inoculazione. I nostri risultati raffigurati da attività GUS mostrano che il promotore di NIN era attivo durante il processo di nodulazione. Insieme, il presente protocollo viene illustrato come identificare, isolare, clonare e caratterizzare un promotore di pianta nelle radici pelosi fagiolo comune. Inoltre, questo protocollo è facile da usare nei laboratori non specializzati.

Introduzione

I promotori sono importanti strumenti biologici molecolari che svolgono un ruolo cruciale nella comprensione della regolazione dell'espressione di geni di interesse. I promotori sono sequenze di DNA situate a Monte della traduzione sequenze di codone di inizio del gene e trasportano le informazioni regolamentari centrale dei geni; Pertanto, la loro corretta annotazione e la caratterizzazione sono fondamentale per comprendere la funzione del gene. A seconda dei modelli di espressione, promotori di pianta sono classificati come costitutiva, tessuto-specifici, o sviluppo-fase-specifici ed inducibile¹. Progressi nelle tecnologie di trascrittomica, miglioramenti nella modellazione al computer e la disponibilità di un numero crescente di sequenze di genoma per diverse specie di piante hanno facilitato il pronostico su larga scala di promotore sequenze².

D'altra parte, è anche fondamentale per stabilire gli strumenti di valutazione del promotore e tecniche di trasformazione genetica che sono veloce, efficace e riproducibile. A differenza di altre piante modello, la caratterizzazione funzionale dei geni di comuni fagioli legumi (p. vulgaris) è ostacolata principalmente a causa della natura ricalcitrante di Phaseolus SP. per trasformazione genetica stabile. Sistemi di trasformazione transitoria servono come un'alternativa per gene rapida caratterizzazione funzionale studi³. Nella ricerca di simbiosi di legume, l'interazione tra la pianta ospite di legume e batterio rhizobial è uno dei più trattabili sistemi modello per l'analisi funzionale di geni specifici del nodulo e promotore degli studi. Finora, sono stati diversi promotori di legume relazionati a queste simbiosi caratterizzata, cioè, Medicago truncatula PT4⁴, SWEET11⁵, Ciclope Lotus japonicus , UBQ⁶, VAG1⁷, Glycine max PT5 ⁸, Exo70J⁹, p. vulgaris RbohB^10,11,12, TRE1¹³, PI3K¹⁴, TOR¹⁵, ecc. CIS elementi influenzano direttamente la regolazione genica. Il fattore di trascrizione ENBP1A si lega a una regione regolatrice di Cis (bp −692) dei primi nodulin VfENOD12, e questo facilita l'espressione di un gene del reporter nei primordi di nodulo di Vicia faba¹⁶. Sostituzione delle regioni regolarici Cis (−161 a −48 bp) del nodulo specifico promotore Legemoglobina GLB3 con l'eterologa troncato promotori δ-p35S e δ-pNOS, ha provocato una perdita di specificità del nodulo e ridotta attività del promotore¹⁷ .

I rapporti precedenti indicano che il fattore di trascrizione NIN è necessaria per l'inizio dell'infezione rhizobial nelle cellule dei capelli di radice ed è anche essenziale per organogenesi nodulo japonicus L.¹⁸. Nello studio presente, descriviamo un protocollo per identificazione, isolamento, clonazione e caratterizzazione del nodulo specifico promotore nelle radici pelosi fagiolo comune. Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo selezionato un promotore di NIN simbiosi-specifico rhizobial di p. vulgaris e clonato in una fusione trascrizionale al chimerico reporter GUS-enhanced::GFP. Inoltre, questo protocollo descrive un sistema rapido e versatile di trasformazione genetica in p. vulgaris utilizzando radici pelosi a. rhizogenes indotta. Questo sistema genera radici pelosi in meno di 2 settimane dopo la trasformazione. Infine, abbiamo valutato l'espressione spatiotemporal del promotore di NIN in noduli radice rizobi colonizzati da GUS macchiatura.

La procedura qui descritta può essere utile non solo per lo studio di nodulazione e micorizzazione¹¹ delle piante leguminose, ma anche per lo studio dei modelli di espressione del promotore in radici¹⁹. Inoltre, questo protocollo è facile da usare nei laboratori non specializzati.

Protocollo

1. identificazione, isolamento e clonazione di P. Vulgaris NIN promotore

1. Identificare la sequenza del promotore del gene di interesse. Esistono diversi database del genoma e strumenti di analisi disponibili per le piante come Phytozome, piante di Ensembl, NCBI, ecc A legume promotore p. vulgaris NIN (PvNIN; Phvul.009G115800) è stato utilizzato in questo studio²⁰.
2. Oligos design per Gateway o tradizionale degli enzimi di limitazione clonazione a seconda del sistema di vettore utilizzato (Figura 1A).
   Nota: Standard (25-35 bp), primer dissalate funzionano bene. Sequenze di oligo inversa che fiancheggiano tra il promotore e il gene sono consigliabili.
3. Amplificare la regione del promotore di PvNIN (o regione del promotore del gene di interesse) da appena isolato p. vulgaris DNA genomic utilizzando il set di oligo promotore-specifiche. Utilizzare una polimerasi ad alta fedeltà con le seguenti condizioni PCR: 95 ° C per 5 min; 30 cicli (95 ° C per 30 s, 55 ° C per 30 s, 72 ° C per 1 min); e 72 ° C per 5 min.
4. Eseguire il frammento amplificato su gel di agarosio 1% a 60 V su un vassoio di gel di 7 x 10 cm ed eluire l'amplicone corrispondente (700 bp, Figura 1B) e clone nel vettore pENTR/D-TOPO secondo le istruzioni del produttore.
5. Trasformare 2 µ l della reazione in competente Escherichia coli cellule utilizzando le istruzioni del produttore e piastra 150 µ l della miscela trasformazione il fratello Lisogenesi (LB) completato con kanamicina 50 mg/L (Kan50). Crescere le cellule placcate a 37 ° C durante la notte.
6. Prendere 3-6 colonie e cultura che durante la notte in mezzo LB contenente Kan50. Plasmide DNA usando il metodo di scelta di isolare e analizzare il plasmide mediante PCR utilizzando il vettore specifico M13 oligos. Per PCR, uso 100 ng di plasmide, 12:03 di oligos, 10 X tampone di PCR, 0,5 U Taq DNA polimerasi e i dNTPs da 10 millimetri.
7. Utilizzare le seguenti condizioni di amplificazione di PCR; 95 ° C per 3 min; 30 cicli (95 ° C per 30 s, 58 ° C per 30 s, 72 ° C per 75 s); e 72 ° C per un minimo di 7 visualizzare i prodotti di PCR su un gel di agarosio 1%. Assicurarsi che il corretto numero di inserzioni hanno una banda in 1.024 bp e vettori senza inserti volontà hanno una banda di bp 324 (Figura 1).
8. Eseguire la reazione di LR tra un vettore di ingresso (pENTR/D-TOPO-PvNIN) e destinazione vector pBGWFS7.0²¹ utilizzando un mix di enzima commerciale secondo le istruzioni del produttore.
9. Trasformare 2 µ l di reazione LR in competente Escherichia coli cellule usando tecniche standard come descritto nelle istruzioni del produttore e piastra 150 µ l di miscela di trasformazione a LB completati con 100 mg/L di spectinomicina (Spe100). Crescere le cellule placcate a 37 ° C durante la notte.
10. Prendere circa 5 colonie e loro cultura durante la notte in mezzo LB contenente Spe100. Il plasmide DNA usando un metodo di scelta di isolare e analizzare il plasmide mediante PCR usando i oligos promotore-specifiche.
11. Utilizzare le condizioni PCR nel passaggio 1.3. Visualizzare i prodotti di PCR su un gel di agarosio all'1% per confermare l'amplificazione. Ampliconi sono 700 bp.
12. Sequenza del plasmide positivo pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP (Figura 1) con i oligos promotore-specifiche per verificare l'autenticità dell'inserto.
13. Trasformare i plasmidi in a. rhizogenes ceppo K599 (Tuttavia, possono essere utilizzati qualsiasi altri ceppi di a. rhizogenes ). Aggiungere 50 µ l di celle electrocompetent ed electroporate in una cuvetta di 1 mm 2 µ l della preparazione del plasmide con le seguenti impostazioni: 1.8 kV, 25 µF e 200 Ω.
14. Recuperare le cellule in ~ 500 µ l di terreno SOC e agitare a 28 ° C per 2 h. piastra su LB-Spe100 e crescere a 28 ° C per 2 giorni.
15. Eseguire lo screening di Colonia come indicato al punto 1.7 e utilizzare le condizioni PCR come descritto al punto 1.3. Fanno scorte di glicerolo da cloni positivi e conservarli a-80 ° C.
16. Utilizzare a. rhizogenes cultura che harboring vettoriale vuoto pBGWFS7.0 come controllo negativo.

2. A. Rhizogenes trasformato pelosi radici del fagiolo comune

1. Sterilizzare i semi di fagiolo (p. vulgaris c.v. Negro Jamapa) (circa 20) in 50 mL di etanolo al 96% per 1 min e scartare l'etanolo; quindi aggiungere 50 mL di 20% candeggina (ipoclorito di sodio) per 10 min, con miscelazione costante in una cappa a flusso laminare. Rimuovere la candeggina e lavare in acqua sterile in eccesso 3 volte.
   Nota: Altre cultivar di p. vulgaris può essere utilizzato per l'induzione di radice pelosa.
2. Germinare i semi sterilizzati su carta da filtro sterile inumidito con Broughton & Dilworth (B & D) soluzione²² (tabella 1) per 2 giorni al buio a 28 ° C.
3. Il giorno prima trasformazione preparare il seguente:
   1. Striscia fuori 150 µ l di cultura a. rhizogenes che harboring il vettore binario (preparato nei passaggi 1.13 e 1.14) il solido LB Spe100 e crescere a 28 ° C durante la notte.
   2. Riempire una provetta da 15 mL con B & la soluzione D e sostituire il tappo a vite con doppia a strati di alluminio. Assemblare questo in una provetta di vetro 22 cm contenente 10 mL di B & soluzione D (Figura 2) ed autoclave esso.
4. Il giorno della trasformazione, assemblare i seguenti materiali sterili in una cappa a flusso laminare: germinati semi dal punto 2.2, piastra di coltura da punto 2.3.1, tubi dal punto 2.3.2, di acqua distillata sterile doppia (10ml), pipette e puntali, pinze sterili, e siringhe da 3 mL.
5. Utilizzare una punta ricurva di 200 µ l per raschiare le cellule a. rhizogenes dalla piastra in un tubo del microcentrifuge e risospendere in 1 mL di acqua sterile doppia. Allo stesso modo, preparare le cellule di controllo vettoriale separatamente.
   1. Mescolare le cellule dolcemente per risospendere. Non centrifugare.
6. Fare un foro di 3 mm sulla lamina di alluminio dei tubi dal punto 2.3.2 utilizzando una pipetta sterile.
7. Raccogliere le cellule (o promotore o vector control) da passo 2.5 con la siringa e pungere leggermente ipocotili di semi germinati con la punta dell'ago (Figura 2).
   Nota: Assicurarsi che l'ago penetra (4 - 6 volte) il tessuto vascolare e iniettare piccole (~ 5 µ l) gocce delle cellule sulla ferita in diverse posizioni intorno l'ipocotile.
8. Inserire con cautela le radici delle piantine iniettate nel foro 3 mm del tubo da 15 mL contenente B & la soluzione D. Restituire l'intera impostazione in 22 mL provette in vetro e sigillarli per mantenere l'umidità.
9. Incubare le provette in una camera di crescita mantenuta a 28 ° C con 16 h luce: 8 h fotoperiodo scuro.
   Note: 3-4 giorni dopo l'incubazione, le piante crescono al bordo dei tubi di vetro 22ml.

In questa fase, è necessario rimuovere i tappi e sigillare il bordo con parafilm intorno al fusto come mostrato in Figura 2I.

Osservare il callo presso i siti ferimento in 5-7 giorni e trovare ~ 2cm pelosi delle radici di 10-12 giorni dopo la trasformazione.
Nota: È importante mantenere il B & la soluzione D costantemente in tubi di plastica e di vetro.

Dopo 2 settimane, rimuovere la radice primaria tagliando il gambo 2 cm sotto le radici pelosi e trapiantare le radici primarie in vasi contenenti vermiculite sterile. Mantenere le piante in una camera di crescita (16 h luce: 8 h scuro a 28 ° C) e irrigare con B & la soluzione D.

3. analisi promotore: NIN promotore espressione nei noduli Rhizobial del fagiolo comune

1. Per induzione dei noduli di radice, inoculare Rhizobium tropici o Rhizobium etli (che sono compatibili per il fagiolo comune) in 100 mL di medium PY (peptone 0,5 g, Estratto di lievito g 0,3) completate con 700 mM CaCl₂ e 20 mg mL^{− 1} acido nalidixico. Incubare a 30 ° C per 24 h con agitazione a 300 giri/min.
   Nota: Qualsiasi antibiotici specifici possono essere utilizzati nel caso di transgenici Rhizobium.
2. Appallottolare le celle in una centrifuga per 3 min a 2.800 x g e a temperatura ambiente e risospendere in 10 mL di 10 mM MgSO₄. Regolare il diametro esterno delle cellule a 0,6 a OD₆₀₀ mediante diluizione con 10mm MgSO₄.
3. Inoculare 1-2 mL di coltura (preparato da passo 3.2) per pianta (sia promotore e vector control) per indurre la crescita dei noduli sulle radici pelosi. Irrigare le piante con B & la soluzione D con azoto limitato (2 mM KNO₃) per promuovere la nodulazione.
4. A seconda delle necessità sperimentali, raccogliere le radici pelosi in diversi momenti. Raccogli campioni per lo studio delle discussioni di infezione tra 3-5 giorni dopo l'inoculazione (dpi).
   Nota: Nodulo primordiale e giovani noduli possono essere studiati a 6-9 e 10-12 giorni dpi, rispettivamente. Infine, noduli maturi e funzionali possono essere studiati a dpi 14-21 e noduli di senesced a > 28 dpi.
5. Elaborare il radice/noduli per l'attività di geni reporter (GUS o GFP). Analizzare l'attività di GUS secondo il protocollo descritto da Jefferson²³. Osservare GFP sotto un microscopio a fluorescenza. Eccitare la fluorescenza di GFP con un laser a ioni argon blu (488 nm) e raccogliere la fluorescenza emessa da 510 a 540 nm.

Risultati

L'obiettivo di questo studio era di valutare il modello di espressione spatiotemporal del nodulo specifico vulgaris del p. NIN. Per effettuare questa operazione, è stata selezionata una regione 700 bp a Monte del codone di inizio di traduzione del gene di NIN e un set di oligos è stato progettato come raffigurato in Figura 1A. Utilizzando una polimerasi ad alta fedeltà, il frammento del promotore di NIN è stato amplificato, isolato (

Discussione

Durante l'analisi funzionale di geni, lo studio di espressione genica gioca un ruolo cruciale nella comprensione della regolazione spaziale e temporale dei geni in vivo. Un metodo ben noto per lo studio di espressione genica è clonare regione del promotore del gene di interesse, a Monte di geni reporter come geni marcatori fluorescenti (GFP, RFP, ecc.) o β-glucuronidasi. Nel presente documento, abbiamo selezionato una regione del promotore del gene specifico radice nodulo simbiosi (RNS), NIN, per stud...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Primers for qRT-PCR assay
pNIN Forward	CACC ATA GCT CCC CAA AAT GGT AT
pNIN Reverse	CAT CTT CCT TCC ACT AAC TAA C
M13 Forward	GTA AAA CGA CGG CCA G
M13 Reverse	CAG GAA ACA GCT ATG AC
Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
pENTR/D-TOPO Cloning Kit	Invitrogen	K243520
Gateway LR Clonase II Enzyme Mix	Invitrogen	11791100
pBGWFS7.0	Plant systems biology	https://gateway.psb.ugent.be/vector/show/pBGWFS7/search/index/
Platinum Taq DNA Polymerase	ThermoFisher Scientific	10966018
DNeasy Plant Mini Kit	Qiagen	69104
PureLink Quick Gel Extraction Kit	ThermoFisher Scientific	K210012
Platinum Pfx DNA Polymerase	Invitrogen	11708013
Certified Molecular Biology Agarose	Bio-Rad	1613102
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli	Invitrogen	C404006
Nacl	Sigma-Aldrich	S7653
Tryptone	Sigma-Aldrich	T7293-250G
Yeast extract	Sigma-Aldrich	Y1625-250G
Bacteriological agar	Sigma-Aldrich	A5306-1KG
Kanamycin sulfate	Sigma-Aldrich	60615-25G
Spectinomycin sulfate	Sigma-Aldrich	PHR1441
Ethyl alcohol	Sigma-Aldrich	E7023
Bacteriological peptone	Sigma-Aldrich	P0556
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C1016
Nalidixic acid	Sigma-Aldrich	N8878
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506
Gel loading solution	Sigma-Aldrich	G7654
Name	Company	Catalog Number	Comments
EQUIPMENT
Thermocycler	Veriti Thermal Cycler	4375786
Centrifuge	Sigma	Sigma 1-14K
Gel documentation unit	Carestream	Gel Logic 212 PRO
MaxQ SHKE6000 6000 Shaking Incubator - 115VAC	Thermo scientific	EW-51708-70
Plant growth chamber	MRC	PGI-550RH
Horizantal laminarair flow cabinate	Lumistell	LH-120
Fluorescent microscope	Leica	DM4500 B
Petridish	sym laboratorios	90X15
Scalpel Blade	Fisher scientific	53223
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher scientific	14-959-53A
22 mL glass tubes	Thomas scientific	45048-16150