מי קולחין יזם: זיהוי ואפיון של השורש גולה יזם ספציפי בתוך השעועית נפוצות

Summary

ניתוח ביטוי יזם מכריעים לשיפור ההבנה של הכונה וביטוי ייתכן היעד גנים. במסמך זה אנו מציגים פרוטוקול כדי לזהות, לבודד לשבט מקדם הצמח. עוד יותר, אנו מתארים את האפיון של האמרגן גולה ספציפיים שורשים שעירים שעועית נפוצות.

Abstract

רצפי במעלה הגן קידוד רצפים מכונים כמו יזם רצפים. לומד את דפוסי ביטוי של היזמים הם מאוד משמעותיים בהבנת הכונה ודפוסי ייתכן ביטוי של גנים היעד. מצד שני, חשוב גם כדי ליצור כלי הערכה יזם טכניקות שינוי גנטי מהיר, יעיל, ו לשחזור. במחקר זה, חקרנו למשמעות הביטוי ייתכן הקמתה (נין) rhizobial ספציפיים סימביוזה גולה האמרגן של מצויה הטרנסגניים שורשים שעירים. צמח הגנום מסדי נתונים באמצעות כלי ניתוח זיהינו, מבודד, שיכפל את המקדם נין דלקתית פ ב פיוז'ן תעתיק לכתב chimeric β-glucuronidase (גאס) גאס-enhanced::GFP. יתרה מזאת, פרוטוקול זה מתאר מערכת מהירה ופסיביות של שינוי גנטי דלקתית פ באמצעות שורשים שעירים Agrobacterium rhizogenes המושרה. מערכת זו יוצרת שורשים שעירים ≥2 ס מ- 10 עד 12 ימים לאחר השינוי. בשלב הבא, אנחנו העריכו הביטוי ייתכן של יזם נין בשורשים שעיר ריזוביום מחוסן במרווחים תקופתיים של פוסט-חיסון. התוצאות שלנו מתואר על ידי גאס פעילות להראות כי ייצוג המקדם נין היה פעיל במהלך התהליך של nodulation. יחד, בפרוטוקול הנוכחי מדגים כיצד לזהות, לבודד, שיבוט, לאפיין את הצמח מקדם מכירות שורשים שעירים שעועית נפוצות. יתר על כן, פרוטוקול זה הוא קל לשימוש במעבדות שאינם מיוחדים.

Introduction

היזמים הם כלים חשובים ביולוגית מולקולרית אשר לשחק תפקיד מכריע בהבנת ויסות הביטוי של הגנים של עניין. היזמים נמצאים רצפי DNA ממוקם במעלה הזרם של התרגום codon חניכה של ג'ין רצף והן נושאות את המידע התקינה המרכזית של גנים; לכן, ביאור נכון ואפיון שלהם הם חיוניים להבנת תפקוד הגן. בהתאם דפוסי ביטוי, היזמים צמח מסווגים מכוננת, רקמות ספציפיות, או פיתוח הבמה- וספציפיים inducible¹. ההתקדמות transcriptomic טכנולוגיות, שיפורים ממוחשבות, והזמינות של מספר גדל והולך של רצפי הגנום מיני צמחים שונים יש הקלה התחזית בקנה מידה גדול של רצפי יזם².

מצד שני, חשוב גם כדי ליצור כלי הערכה יזם טכניקות שינוי גנטי מהיר, יעיל, ו לשחזור. בניגוד דגם צמחים אחרים, אפיון פונקציונלי נפוצים בין קטניות (פ דלקתית) גנים מופרעת בעיקר בגלל אופי Phaseolus sp. לשינוי גנטי יציב הסרבן. מערכות טרנספורמציה ארעי לשמש חלופה עבור ג'ין מהירה אפיון פונקציונלי מחקרים³. במחקר סימביוזה קטניות, האינטראקציה בין חיידק rhizobial מצמח פונדקאי קטניות היא אחת המערכות דגם צייתן ביותר לניתוח פונקציונלי של גנים ספציפיים גולה ולימודים קדם. כל-כך רחוק, מספר היזמים קטניות הקשורים symbioses אלה היה מאופיין, בילוי, אספסת truncatula PT4⁴, SWEET11⁵, לוטוס ג'אפוניכאס קיקלופ, UBQ⁶, VAG1⁷, PT5 מקסימום גליצין ⁸, Exo70J⁹, RbohB דלקתית פ ^10,11,12, TRE1¹³, PI3K¹⁴, טור¹⁵, ועוד. חבר העמים גורמים משפיעים ישירות על הכונה. הפקטור שעתוק ENBP1A נקשר באזור רגולטוריות חבר העמים (−692 bp) של nodulin מוקדם VfENOD12, זה מקל על הביטוי של גן כתב ב גולה primordia בקיה faba¹⁶. החלפה של אזורים רגולטוריות חבר העמים (−161 כדי −48 bp) של האמרגן ספציפיים גולה leghemoglobin GLB3 עם heterologous נחתכות היזמים אלפא-p35S, אלפא-פסנתרים, גרמו לאובדן היחודיות גולה ו מופחתת יזם פעילות¹⁷ .

בדו"חות קודמים מראים את גורם שעתוק נין נדרש עבור אתחול של זיהום rhizobial לתאי השורש, גם חיוני גולה organogenesis ג'אפוניכאס ל'¹⁸. במחקר הנוכחי, אנו מתארים פרוטוקול זיהוי, בידוד, שיבוט של אפיון של גולה ספציפיים יזם שורשים שעירים שעועית נפוצות. כדי להשיג זאת, אנו נבחר מקדם נין סימביוזה ספציפי rhizobial וולגריס פ , שיכפל ב פיוז'ן תעתיק לכתב chimeric גאס-enhanced::GFP. יתרה מזאת, פרוטוקול זה מתאר מערכת מהירה ופסיביות של שינוי גנטי דלקתית פ באמצעות שורשים שעירים rhizogenes א המושרה. מערכת זו יוצרת שורשים שעירים פחות משבועיים לאחר השינוי. בסופו של דבר, אנחנו העריכו הביטוי ייתכן נין יזם ב- rhizobia התנחלו פקעיות מאת GUS מכתים.

ההליך המתואר כאן עשוי להיות שימושי לא רק לצורך המחקר של nodulation ו- mycorrhization¹¹ צמחים קטניות, אלא גם לצורך המחקר דפוסי ביטוי יזם שורשים¹⁹. יתר על כן, פרוטוקול זה הוא קל לשימוש במעבדות שאינם מיוחדים.

Protocol

1. זיהוי, בידוד, שכפול של יזם נין עמ' דלקתית

1. לזהות את רצף יזם עבור הגן עניין. יש מספר מסדי נתונים הגנום, כלי ניתוח זמינים עבור צמחים כגון Phytozome, Ensembl צמחים, NCBI, וכו A קטניות יזם דלקתית פ נין (PvNIN; Phvul.009G115800) היה בשימוש במחקר²⁰.
2. עיצוב oligos גם עבור שער או אנזים הגבלה מסורתי שיבוט בהתאם למערכת וקטור בשימוש (איור 1 א').
   הערה: תקן (25-35 bp), תחל desalted העבודה בסדר. רצפים oligo הפוכה מחזיתות בין יזם הגן הם רצוי.
3. להגביר את האזור יזם PvNIN (או יזם אזור של הגן עניין) של טרי מבודד דלקתית פ הדנ א באמצעות ערכת oligo יזם ספציפי. שימוש של פולימראז באיכות גבוהה עם התנאים הבאים PCR: 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; מחזורים (95 ° C ל 30 s, 55 ° C ל 30 s, 72 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה); 72 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
4. לרוץ השבר מוגבר על 1% ג'ל agarose 60 V על מגש ג'ל 7 x 10 ס מ, elute את אמפליקון המתאים (700 bp, איור 1B) ולשכפל לתוך וקטור pENTR/D-טופוגרפיה על פי הוראות היצרן.
5. שינוי צורה µL 2 התגובה לתוך המוסמכת Escherichia coli תאים באמצעות צלחת 150 µL של תערובת שינוי הוראות היצרן על אחיו lysogeny (LB) בתוספת kanamycin 50 מ ג/ליטר (Kan50). לגדל את התאים מצופה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
6. לבחור המושבות והתרבות 3-6 שאותם בן לילה במדיום LB המכיל Kan50. לבודד פלסמיד DNA בשיטת הבחירה ולנתח את פלסמיד באמצעות PCR באמצעות oligos M13 ספציפית את וקטור. עבור ה-PCR, שימוש 100 ננוגרם של פלסמיד, 0-ב־15 pm של oligos, 10 X PCR מאגר 0.5 U Taq DNA פולימראז, dNTPs 10 מ מ.
7. השתמש התנאים הבאים הגברה PCR; 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות; מחזורים (95 ° C ל 30 s, 58 ° C ל 30 s, 72 ° C עבור 75 s); ו- 72 מעלות צלזיוס במשך 7 דקות לדמיין את המוצרים PCR על ג'ל agarose 1%. ודא הוספות הנכונה שיש להקה-bp 1,024 ווקטורים ללא הוספת יש להקה bp 324 (איור 1C).
8. לבצע את התגובה LR בין ערך וקטור (pENTR/D-טופוגרפיה-PvNIN) לבין היעד וקטור pBGWFS7.0²¹ באמצעות שילוב אנזים מסחרי על פי הוראות היצרן.
9. להפוך את 2 µL של תגובה LR לתוך המוסמכת e. coli תאים באמצעות טכניקות רגיל כפי שמתואר צלחת 150 µL תערובת שינוי הוראות היצרן-LB בתוספת 100 מ ג/ליטר של spectinomycin (Spe100). לגדל את התאים מצופה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
10. לאסוף כ 5 מושבות, תרבות אותם בן לילה במדיום LB המכיל Spe100. לבודד את פלסמיד הדנ א באמצעות שיטה של בחירה ולנתח את פלסמיד באמצעות PCR באמצעות oligos ספציפיים יזם.
11. להשתמש בתנאי PCR בשלב 1.3. דמיינו את המוצרים PCR על ג'ל agarose 1% כדי לאשר הגברה. Amplicons הם 700 bp.
12. רצף של פלסמיד חיובי pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP (איור 1D) עם oligos יזם ספציפיים כדי לאמת את המקוריות של הקדמי.
13. להפוך את פלסמידים זן rhizogenes א K599 (עם זאת, יש זנים אחרים של rhizogenes א יכול לשמש). להוסיף 2 µL של ההכנות פלסמיד 50 µL של תאים electrocompetent electroporate ב cuvette 1 מ מ עם ההגדרות הבאות: 1.8 kV, 25 µF וω 200.
14. לשחזר תאי ~ 500 µL SOC בינוני, לנער ב 28 ° C עבור 2 ח' בלוחית-LB-Spe100 ולגדול ב 28 מעלות צלזיוס במשך יומיים.
15. לבצע סינון המושבה כאמור בשלב 1.7 ולהשתמש התנאים PCR כמו שלב 1.3. להפוך גליצרול מניות מן שיבוטים חיובי ואחסן אותם ב- 80 מעלות צלזיוס.
16. השתמש rhizogenes א תרבות מחסה pBGWFS7.0 ריק וקטור של הפקד שלילי.

2. א Rhizogenes הפך שורשים שעירים של השעועית נפוצות

1. עיקור הזרעים שעועית (דלקתית פ cv. נגרו Jamapa) (כ-20) 50 מ של אתנול 96% עבור 1 דקות ולמחוק האתנול; לאחר מכן להוסיף 50 מ של 20% מלבין (נתרן תת-כלורי) למשך 10 דקות, עם ערבוב מתמיד עם תא למינארי. להסיר את האקונומיקה ולשטוף במים סטריליים עודף 3 פעמים.
   הערה: שאר הזנים דלקתית פ יכול לשמש עבור שורש שעיר אינדוקציה.
2. לנבוט הזרעים סטיריליים על ניירות סינון סטרילי-סוידיש ברוטון & דילוורט (B & D) פתרון²² (טבלה 1) במשך יומיים בחושך ב 28 º C.
3. יום לפני השינוי להכין את הפעולות הבאות:
   1. צובעות את 150 µL התרבות rhizogenes א מחסה הווקטור בינארי (להכין בשלבים 1.13 ו- 1.14) על מוצק LB Spe100 ולגדול ב 28 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
   2. למלא את צינור 15 מ"ל B & D פתרון והחלף הכובע בורג ברדיד אלומיניום ושכבה כפולה. להרכיב את זה לתוך צינור זכוכית 22 ס מ המכיל 10 מ"ל של B & D פתרון (איור 2C) ותא לחץ זה.
4. ביום של טרנספורמציה, להרכיב את החומרים הבאים סטרילי בתוך תא למינארי: מונבטים זרעים מהשלב 2.2, הצלחת תרבות שלב 2.3.1, צינורות מהשלב 2.3.2, סטרילי מים מזוקקים כפול (10 מ"ל), פיפטות ועצות פיפטה, מלקחיים סטרילי, 3 mL מזרקים.
5. השתמש טיפ 200 µL כפופות כדי לגרד rhizogenes א התאים מהצלחת לתוך צינור microcentrifuge ו resuspend ב 1 מ"ל של המים סטרילי כפול. באופן דומה, להכין וקטור שליטה התאים בנפרד.
   1. מערבבים את התאים בעדינות כדי resuspend. לא מערבולת.
6. תעשה חור 3 מ מ על רדיד האלומיניום של הצינורות מהשלב 2.3.2 באמצעות טיפ פיפטה סטרילי.
7. לאסוף את התאים (פקד או יזם או וקטור) משלב 2.5 עם המזרק ומורחים מעט את hypocotyls של הזרעים מונבטים עם קצה המחט (איור 2G).
   הערה: ודא המחט חודרת (4 - 6 פעמים) הרקמה וסקולריים ולהזריק קטן (~ 5 µL) טיפות של התאים על הפצע לעבר עמדות שונות סביב hypocotyl.
8. בזהירות הכנס שורשי השתילים מוזרק לתוך החור 3 מ מ של הצינור 15 מ"ל המכיל B & D פתרון. להחזיר לכל הארגון לתוך 22 mL צינורות זכוכית, לסגור אותם כדי לשמור על לחות.
9. דגירה הצינורות בתוך תא הצמיחה ומתוחזק על 28 מעלות צלזיוס עם 16 h אור: 8 h photoperiod כהה.
   הערות: 3-4 ימים לאחר דגירה, הצמחים גדלים על החישוק הצינורות זכוכית 22 מ"ל.

בשלב זה, הסר את הפקקים, אטום החישוק עם מצלמות-מיקרוסקופים סביב הגבעול, כפי שמוצג באיור 2I.

לצפות את קסם באתרים wounding 5-7 ימים, ולמצוא ~ שורשים שעירים 2 ס מ 10-12 ימים לאחר השינוי.
הערה: חשוב לשמור את B & D פתרון באופן קבוע צינורות פלסטיק וזכוכית.

לאחר 2 שבועות, להסיר את הבסיס העיקרי על ידי חיתוך הגבעול 2 ס מ מתחת שורשים שעירים והשתלת השורשים העיקרי לסירים המכיל ורמיקוליט סטרילי. לשמור על הצמחים בתוך תא צמיחה (16 h אור: 8. ב- 28 ° C h), להשקיית עם B & D פתרון.

3. קדם ניתוח: נין יזם ביטוי Rhizobial גושים של השעועית נפוצות

1. עבור אינדוקציה של פקעיות, לחסן ריזוביום tropici או פידה טרי ונפלא ריזוביום (שיהיו תואמים לשעועית נפוצות) ב- 100 מ של מדיום PY (0.5 ג'י peptone, תמצית שמרים 0.3 גרם) בתוספת 700 מ"מ CaCl₂ ו- 20 מ ג מ ל^{− 1} חומצה nalidixic. דגירה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה ברעידות-300 סל ד.
   הערה: אנטיביוטיקה מסוימת יכול לשמש במקרה של הטרנסגניים ריזוביום.
2. גלולה התאים צנטריפוגה למשך 3 דקות ב g x 2,800 בטמפרטורת החדר, resuspend ב- 10 מ ל 10 מ מ MgSO₄. להתאים את יתר של תאים 0.6-OD₆₀₀ דילול עם 10 מ מ MgSO₄.
3. לחסן 1-2 מ של תרבות (להכין משלב 3.2) לכל צמח (פקד יזם והן וקטורי) כדי לגרום לצמיחה גולה על השורשים שעיר. להשקיית הצמחים עם B & D פתרון עם חנקן מוגבלים (2 מ מ יודע₃) כדי לקדם את nodulation.
4. בהתאם הצורך ניסיוני, לאסוף את השורשים שעיר בנקודות זמן שונות. לאסוף דגימות ללמוד זיהום חוטים בין 3-5 ימים פוסט חיסון (dpi).
   הערה: גולה הקדמוני נודולים צעיר ניתן יהיה ללמוד dpi 6-9 ו- 10-12 ימים dpi, בהתאמה. לבסוף, גושים בוגרת ופונקציונליים ניתן יהיה ללמוד 14-21 dpi, נודולים senesced-> 28 dpi.
5. לעבד את השורש/הגושים לפעילות של גנים כתב (גאס או GFP). לנתח את גאס פעילות לפי הפרוטוקול המתואר על ידי ג'פרסון²³. להתבונן GFP תחת מיקרוסקופ זריחה. לרגש GFP זריחה עם יון ללייזר כחול (488 ננומטר), לאסוף את קרינה פלואורסצנטית הנפלט מן 510 כדי 540 nm.

תוצאות

מטרת המחקר הייתה להעריך למשמעות הביטוי ייתכן גולה ספציפיים דלקתית פ נין. כדי לעשות זאת, נבחר 700 bp אזור במעלה הזרם codon חניכה התרגום של הגן נין , קבוצת oligos תוכנן כפי שהיא מתוארת איור 1A. באמצעות פולימראז אמינות גבוהה, השבר יזם נין היה מוגבר מבודד (

Discussion

במהלך אנליזה פונקציונלית של גנים, המחקר של דפוסי ביטוי הגנים ממלא תפקיד מכריע בהבנת יכולות ויסות הגנים ויוו. שיטה ידועה ללמוד דפוסי ביטוי גנים הוא לשבט את האזור יזם גנים של עניין, במעלה כתב גנים כגון גנים סמן פלורסנט (GFP, RFP, וכו ') או β-glucuronidase. במסמך זה, בחרנו אזור יזם השורש גולה סימב...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Primers for qRT-PCR assay
pNIN Forward	CACC ATA GCT CCC CAA AAT GGT AT
pNIN Reverse	CAT CTT CCT TCC ACT AAC TAA C
M13 Forward	GTA AAA CGA CGG CCA G
M13 Reverse	CAG GAA ACA GCT ATG AC
Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
pENTR/D-TOPO Cloning Kit	Invitrogen	K243520
Gateway LR Clonase II Enzyme Mix	Invitrogen	11791100
pBGWFS7.0	Plant systems biology	https://gateway.psb.ugent.be/vector/show/pBGWFS7/search/index/
Platinum Taq DNA Polymerase	ThermoFisher Scientific	10966018
DNeasy Plant Mini Kit	Qiagen	69104
PureLink Quick Gel Extraction Kit	ThermoFisher Scientific	K210012
Platinum Pfx DNA Polymerase	Invitrogen	11708013
Certified Molecular Biology Agarose	Bio-Rad	1613102
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli	Invitrogen	C404006
Nacl	Sigma-Aldrich	S7653
Tryptone	Sigma-Aldrich	T7293-250G
Yeast extract	Sigma-Aldrich	Y1625-250G
Bacteriological agar	Sigma-Aldrich	A5306-1KG
Kanamycin sulfate	Sigma-Aldrich	60615-25G
Spectinomycin sulfate	Sigma-Aldrich	PHR1441
Ethyl alcohol	Sigma-Aldrich	E7023
Bacteriological peptone	Sigma-Aldrich	P0556
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C1016
Nalidixic acid	Sigma-Aldrich	N8878
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506
Gel loading solution	Sigma-Aldrich	G7654
Name	Company	Catalog Number	Comments
EQUIPMENT
Thermocycler	Veriti Thermal Cycler	4375786
Centrifuge	Sigma	Sigma 1-14K
Gel documentation unit	Carestream	Gel Logic 212 PRO
MaxQ SHKE6000 6000 Shaking Incubator - 115VAC	Thermo scientific	EW-51708-70
Plant growth chamber	MRC	PGI-550RH
Horizantal laminarair flow cabinate	Lumistell	LH-120
Fluorescent microscope	Leica	DM4500 B
Petridish	sym laboratorios	90X15
Scalpel Blade	Fisher scientific	53223
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher scientific	14-959-53A
22 mL glass tubes	Thomas scientific	45048-16150