Analyse de végétaux de promoteur : Identification et caractérisation de racine Nodule promoteur spécifique chez le haricot commun

Résumé

Analyses d’expression promoteur sont essentielles pour améliorer la compréhension de la régulation des gènes et de l’expression spatio-temporelle des gènes cibles. Ici, nous présentons un protocole visant à identifier, isoler et cloner un promoteur de la plante. En outre, les auteurs décrivent la caractérisation du nodule spécifique promoteur dans les racines velues de haricot commun.

Résumé

Les séquences en amont du gène séquences codantes sont désignées comme des séquences promotrices. Étudier les profils d’expression des promoteurs sont très importantes dans la compréhension de la régulation des gènes et des profils d’expression spatio-temporelle des gènes cibles. En revanche, il est également essentiel d’établir des outils d’évaluation de promoteur et de techniques de transformation génétique qui sont rapides, efficaces et reproductibles. Dans cette étude, nous avons étudié le modèle d’expression spatio-temporelle du promoteur création (NIN) rhizobiennes symbiose spécifique nodules de Phaseolus vulgaris dans les racines velues transgéniques. À l’aide de bases de données du génome de plante et les outils d’analyse nous avons identifié, isolé et cloné le promoteur de NIN P. vulgaris dans une fusion transcriptionnelle au journaliste chimérique β-glucuronidase (GUS) GUS-enhanced::GFP. De plus, ce protocole décrit un système rapid et versatile de transformation génétique chez le P. vulgaris à l’aide d' Agrobacterium rhizogenes induit racines velues. Ce système génère des racines velues de ≥ 2 cm 10 à 12 jours après la transformation. Ensuite, nous avons évalué l’expression spatio-temporelle du promoteur NIN en racines velues Rhizobium inoculés à des intervalles périodiques après l’inoculation. Nos résultats dépeints par activité GUS montrent que le promoteur de NIN était actif au cours du processus de nodulation. Ensemble, le présent Protocole montre comment identifier, isoler, cloner et caractériser un promoteur de la plante dans les racines velues de haricot commun. De plus, ce protocole est facile à utiliser dans les laboratoires non spécialisés.

Introduction

Les promoteurs sont des outils biologiques moléculaires importants qui jouent un rôle crucial dans la compréhension de la régulation de l’expression des gènes d’intérêt. Les promoteurs sont des séquences d’ADN situées en amont de la traduction les séquences de codon d’initiation de gène et ils portent les mentions réglementaires centrales de gènes ; donc, leur annotation correcte et la caractérisation sont essentiels pour comprendre la fonction des gènes. Selon les profils d’expression, promoteurs de la plante sont classés comme constitutive, tissu-spécifique, ou spécifique au développement-stade et inductible¹. Avancées dans les technologies de transcriptomique, amélioration de la modélisation informatique et la disponibilité d’un nombre croissant de séquences de génomes de différentes espèces de plantes ont facilité la prédiction à grande échelle de séquences promoteur².

En revanche, il est également essentiel d’établir des outils d’évaluation de promoteur et de techniques de transformation génétique qui sont rapides, efficaces et reproductibles. À la différence des autres plantes de modèle, la caractérisation fonctionnelle des gènes de légumineuse (P. vulgaris) haricot commun est entravée principalement en raison du caractère récalcitrant de Phaseolus SP pour transformation génétique stable. Systèmes de transformation passagère servent d’alternative pour le gène rapide caractérisation fonctionnelle des études³. Dans la recherche de légumineuse de symbiose, l’interaction entre la plante-hôte légumineuse et bactérie rhizobienne est un des systèmes plus tractable modèle pour l’analyse fonctionnelle des gènes spécifiques des nodules et des études de promoteur. Jusqu'à présent, plusieurs promoteurs de légumineuse liés à ces symbioses ont été caractérisés, c'est-à-dire, Medicago truncatula PT4⁴, SWEET11⁵, Lotus japonicus Cyclope, UBQ⁶, VAG1⁷, Glycine max PT5 ⁸, Exo70J⁹, P. vulgaris RbohB^10,11,12, TRE1¹³, PI3K¹⁴, TOR¹⁵, etc.. CIS éléments influencent directement la régulation génique. Le facteur de transcription ENBP1A se lie à une région régulatrice du Cis (−692 bp) d’early noduline VfENOD12, et cela facilite l’expression d’un gène rapporteur dans les primordiums de nodules de Vicia faba¹⁶. Remplacement des régions régulatrices de Cis (−161 à −48 bp) du promoteur nodule spécifique leghémoglobine GLB3 avec l’hétérologue tronqué promoteurs δ-p35S et δ-pNOS, a entraîné une perte de spécificité de nodule et réduit l’activité du promoteur¹⁷ .

Les rapports précédents montrent que le facteur de transcription NIN est requis pour l’initiation de l’infection rhizobienne dans les cellules des poils absorbants et est aussi essentielle à l’organogénèse nodulaire dans L. japonicus¹⁸. Dans la présente étude, les auteurs décrivent un protocole d’identification, isolement, clonage et caractérisation du nodule spécifique promoteur dans les racines velues de haricot commun. Pour y parvenir, nous avons sélectionné un promoteur de NIN spécifiques symbiose rhizobiens de P. vulgaris et cloné dans une fusion transcriptionnelle au journaliste chimérique GUS-enhanced::GFP. De plus, ce protocole décrit un système rapid et versatile de transformation génétique chez le P. vulgaris à l’aide de a. rhizogenes induit racines velues. Ce système génère des racines velues en moins de 2 semaines après transformation. Enfin, nous avons évalué l’expression spatio-temporelle du promoteur NIN en nodules racinaires rhizobiums colonisés par GUS coloration.

La procédure décrite ici peut être utile pour l’étude de la nodulation et la mycorhization¹¹ des plantes légumineuses, mais aussi pour l’étude des modèles d’expression de promoteur en racines¹⁹. De plus, ce protocole est facile à utiliser dans les laboratoires non spécialisés.

Protocole

1. identification, isolement et le clonage de P. Vulgaris NIN promoteur

1. Identifier la séquence du promoteur du gène d’intérêt. Il y a plusieurs bases de données de génome et outils d’analyse disponibles pour les plantes telles que Phytozome, plantes Ensembl, NCBI, etc. A légumineuse promoteur P. vulgaris NIN (PvNIN ; Phvul.009G115800) a été utilisé dans cette étude²⁰.
2. Oligos de conception pour porte d’entrée ou des enzymes de restriction traditionnelle clonage selon le système de vecteur utilisé (Figure 1 a).
   NOTE : Standard (bp 25-35), des amorces de morue dessalée fonctionnent bien. Séquences d’oligo inverse qui flanquent entre le promoteur et le gène sont conseillés.
3. Amplifier la région promotrice de PvNIN (ou de la région promotrice du gène d’intérêt) de fraîchement isolées P. vulgaris en utilisant l’ensemble des oligo promoteur spécifique de l’ADN génomique. Utilisez une polymérase de haute fidélité avec les conditions suivantes de la PCR : 95 ° C pendant 5 min ; 30 cycles (95 ° C pendant 30 s, 55 ° C pendant 30 s, 72 ° C pendant 1 min) ; et 72 ° C pendant 5 min.
4. Exécutez le fragment amplifié sur gel d’agarose à 1 % à 60 V sur une plaque de gel de 7 x 10 cm et éluer les amplicons correspondants (700 bp, Figure 1 b) et clone dans le vecteur pENTR/D-TOPO selon les instructions du fabricant.
5. Transformer 2 µL de la réaction en compétentes d' Escherichia coli cellules utilisant les instructions du fabricant et la plaque 150 µL du mélange transformation sur frère lysogénie (LB) additionné de kanamycine 50 mg/L (Kan50). Cultiver les cellules plaqués à 37 ° C pendant la nuit.
6. Prélever 3-6 colonies et culture que durant la nuit dans le milieu LB contenant Kan50. Isoler l’ADN à l’aide de la méthode de choix de plasmide et d’analyser le plasmide par PCR en utilisant le vecteur spécifique M13 oligos. Pour l’ACP, utilisation 100 ng de plasmide, 12:03 des oligos, 10 X tampon PCR 0,5 U Taq DNA polymérase et 10 mM dNTPs.
7. Utiliser les conditions suivantes de l’amplification PCR ; 95 ° C pendant 3 min ; 30 cycles (95 ° C pendant 30 s, 58 ° C pendant 30 s, 72 ° C pendant 75 s) ; et 72 ° C pendant 7 min. visualiser les produits PCR sur un gel d’agarose à 1 %. S’assurer que les insertions correctes ont une bande à 1 024 bp et vecteurs sans volonté d’insertions ont une bande de bp 324 (Figure 1).
8. Effectuer la réaction de LR entre le vecteur d’entrée (pENTR/D-TOPO-PvNIN) et destination des vecteurs pBGWFS7.0²¹ en utilisant un mélange commercial enzyme selon les instructions du fabricant.
9. Transformer 2 µL de réaction LR en compétent e. coli cellules utilisant des techniques standard tel que décrit dans les instructions du fabricant et la plaque 150 µL du mélange de transformation sur LB additionné de 100 mg/L de spectinomycine (Spe100). Cultiver les cellules plaqués à 37 ° C pendant la nuit.
10. Prélever environ 5 colonies et leur culture du jour au lendemain dans un milieu LB contenant Spe100. Isoler l’ADN à l’aide d’une méthode de choix de plasmide et d’analyser le plasmide de PCR avec les oligos promoteur spécifique.
11. Utiliser les conditions de la PCR dans l’étape 1.3. Visualiser les produits PCR sur un gel d’agarose à 1 % pour confirmer l’amplification. Amplicons sont 700 bp.
12. Le plasmide positive pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP (Figure 1) de la séquence avec les oligos promoteur spécifique de vérifier l’authenticité de l’insert.
13. Transformer les plasmides en souche a. rhizogenes K599 (Toutefois, les autres souches d’a. rhizogenes peuvent être utilisés). Ajouter 2 µL de la préparation de plasmide dans 50 µL de cellules electrocompetent et electroporate dans une cuvette de 1 mm avec les paramètres suivants : 1.8 kV, 25 µF et 200 Ω.
14. Récupérer des cellules en ~ 500 µL de milieu SOC et agiter à 28 ° C pendant 2 h. plaque sur LB-Spe100 et pousse à 28 ° C pendant 2 jours.
15. Effectuer le criblage de colonie comme indiqué dans l’étape 1.7 et utiliser les conditions de la PCR comme dans l’étape 1.3. Faire des stocks de glycérol de clones positifs et les stocker à-80 ° C.
16. Utiliser a. rhizogenes culture nourrissait vecteur vide pBGWFS7.0 comme contrôle négatif.

2. A. Rhizogenes transformé des racines velues de l’haricot

1. Stériliser les graines de haricot (P. vulgaris CV Jamapa Negro) (environ 20) dans 50 mL d’éthanol à 96 % pendant 1 min et jeter l’éthanol ; Ajouter ensuite 50 mL d’eau de Javel (hypochlorite de sodium) de la 20 % pendant 10 min, avec un mélange constant dans une hotte à flux laminaire. Enlever l’eau de Javel et laver à l’eau stérile excès 3 fois.
   Remarque : Les autres cultivars P. vulgaris peuvent être utilisés pour l’induction de racines chevelues.
2. Faire germer les graines stérilisées sur papier-filtre stérile imbibé de Broughton & Dilworth (B & D) solution²² (tableau 1) pendant 2 jours dans l’obscurité à 28 ° C.
3. La veille de la transformation de préparer ce qui suit :
   1. -Ensemencer sur 150 µL de la culture a. rhizogenes , hébergeant le vecteur binaire (préparé en étapes 1.13 et 1.14) sur solide LB Spe100 et poussent à 28 ° C durant la nuit.
   2. Remplir un tube de 15 mL avec B & solution D et remplacer le bouchon à vis avec double couche d’aluminium. Cela s’assemble en un tube de verre de 22 cm contenant 10 mL de B & D solution (Figure 2) et autoclave il.
4. Le jour de la transformation, assembler les matériaux stériles suivants dans une hotte à flux laminaire : germer les graines de l’étape 2.2, plaque de culture d’étape 2.3.1, tubes de l’étape 2.3.2, eau bidistillée stérile (10 mL), pipettes et pointes de pipette, une pince stérile, et les seringues de 3 mL.
5. Utiliser un embout de 200 µL courbé à racler les cellules a. rhizogenes de la plaque dans un tube de microcentrifuge et remettre en suspension dans 1 mL de l’eau stérile double. De même, préparer les hématies vecteur séparément.
   1. Mélanger les cellules doucement pour remettre en suspension. Ne pas vortexer.
6. Faire un trou de 3 mm sur la feuille d’aluminium de l’étape 2.3.2 en utilisant un embout de la pipette stérile des tubes.
7. Recueillir les cellules (promoteur ou vector control) de l’étape 2.5 avec la seringue et piquer légèrement l’hypocotyle des graines germées avec la pointe de l’aiguille (Figure 2).
   Remarque : Veillez à ce que l’aiguille pénètre (4 à 6 fois) les tissus vasculaires et injecter petit (~ 5 µL) supprime des cellules sur la plaie à des endroits différents autour de l’hypocotyle.
8. Insérer délicatement les racines des semis injectés dans le trou de 3 mm du tube 15 mL contenant B & solution D. Retourner l’installation entière dans le mL 22 tubes en verre et joint pour conserver l’humidité.
9. Incuber les tubes dans une chambre de croissance maintenue à 28 ° C avec 16 h lumière : 8 h photopériode sombre.
   Notes : 3-4 jours après l’incubation, les plantes grandissent sur le bord des tubes de verre de 22 mL.

A ce stade, retirer les capuchons et sceller la jante avec parafilm autour de la tige, comme illustré dans la Figure 2I.

Observer les cals sur les sites blessantes à 5-7 jours et trouver ~ racines velues 2 cm par 10 à 12 jours après transformation.
Remarque : Il est important de maintenir le B & solution D constamment dans des tubes de plastique et de verre.

Après 2 semaines, retirer la racine primaire en coupant la tige à 2 cm en dessous des racines velues et transplanter les racines primaires dans des pots contenant de la vermiculite stérile. Maintenir les plantes dans une chambre de croissance (16 h lumière : 8 h obscurité à 28 ° C) et irriguer avec B & solution D.

3. promoteur analyse : NIN promoteur Expression dans les Nodules rhizobiennes du haricot commun

1. Pour l’induction de nodosités racinaires, inoculer Rhizobium tropici ou Rhizobium etli (qui sont compatibles avec le haricot commun) dans 100 mL de milieu PY (peptone de 0,5 g, 0,3 g d’extrait de levure) additionné de 700 mM CaCl₂ et 20 mg mL⁻¹ acide nalidixique. Incuber à 30 ° C pendant 24 h avec agitation à 300 tr/min.
   Remarque : Des antibiotiques spécifiques pourraient être utilisés dans le cas de transgéniques Rhizobium.
2. Les cellules dans une centrifugeuse pendant 3 min à 2 800 x g à la température ambiante de granule et resuspendre dans 10 mL de 10 mM MgSO₄. Ajuster le diamètre extérieur de cellules à 0,6 à OD₆₀₀ par dilution avec du 10 mM MgSO₄.
3. Inoculer 1-2 mL de la culture (préparée à l’étape 3.2) par plant (promoteur tant vector control) pour induire la croissance des nodules sur les racines velues. Arroser les plantes avec B & solution D azote limité (2 mM KNO₃) pour promouvoir la nodulation.
4. Selon les besoins expérimentaux, recueillir les racines velues à différents moments. Collecte d’échantillons pour l’étude des cordons d’infection entre 3-5 jours après l’inoculation (dpi).
   Remarque : Nodule primordiale et jeunes nodules peuvent être étudiés à 6-9 et 10-12 jours PPP, respectivement. Enfin, les nodules matures et fonctionnels peuvent être étudiées au dpi de 14-21 et des nodules de sénescence à > 28 dpi.
5. Traiter les nodules racinaires / l’activité des gènes rapporteurs (GUS ou GFP). Analyser l’activité GUS selon le protocole décrit par Jefferson²³. Observez GFP sous le microscope de fluorescence. Exciter la fluorescence GFP avec un laser à argon bleu ion (488 nm) et recueillir la fluorescence émise de 510 à 540 nm.

Résultats

L’objectif de cette étude était d’évaluer le modèle d’expression spatio-temporelle des nodules spécifiques P. vulgaris NIN. Pour ce faire, une région bp 700 en amont du codon d’initiation traduction du gène NIN est sélectionné et un ensemble d’oligos a été conçu comme l’illustre la Figure 1 a. En utilisant une polymérase de haute fidélité, le fragment de promoteur NIN a été amplifié, isolé (

Discussion

Au cours de l’analyse fonctionnelle des gènes, l’étude des modèles d’expression de gène joue un rôle crucial dans la compréhension de la régulation spatiale et temporelle de la gènes in vivo. Une méthode bien connue pour étudier les profils d’expression génique consiste à cloner la région promoteur du gène d’intérêt, en amont des gènes rapporteurs comme gènes de marqueur fluorescent (GFP, DP, etc.) ou de β-glucuronidase. Ici, nous avons sélectionné une région promotrice r...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Primers for qRT-PCR assay
pNIN Forward	CACC ATA GCT CCC CAA AAT GGT AT
pNIN Reverse	CAT CTT CCT TCC ACT AAC TAA C
M13 Forward	GTA AAA CGA CGG CCA G
M13 Reverse	CAG GAA ACA GCT ATG AC
Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
pENTR/D-TOPO Cloning Kit	Invitrogen	K243520
Gateway LR Clonase II Enzyme Mix	Invitrogen	11791100
pBGWFS7.0	Plant systems biology	https://gateway.psb.ugent.be/vector/show/pBGWFS7/search/index/
Platinum Taq DNA Polymerase	ThermoFisher Scientific	10966018
DNeasy Plant Mini Kit	Qiagen	69104
PureLink Quick Gel Extraction Kit	ThermoFisher Scientific	K210012
Platinum Pfx DNA Polymerase	Invitrogen	11708013
Certified Molecular Biology Agarose	Bio-Rad	1613102
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli	Invitrogen	C404006
Nacl	Sigma-Aldrich	S7653
Tryptone	Sigma-Aldrich	T7293-250G
Yeast extract	Sigma-Aldrich	Y1625-250G
Bacteriological agar	Sigma-Aldrich	A5306-1KG
Kanamycin sulfate	Sigma-Aldrich	60615-25G
Spectinomycin sulfate	Sigma-Aldrich	PHR1441
Ethyl alcohol	Sigma-Aldrich	E7023
Bacteriological peptone	Sigma-Aldrich	P0556
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C1016
Nalidixic acid	Sigma-Aldrich	N8878
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506
Gel loading solution	Sigma-Aldrich	G7654
Name	Company	Catalog Number	Comments
EQUIPMENT
Thermocycler	Veriti Thermal Cycler	4375786
Centrifuge	Sigma	Sigma 1-14K
Gel documentation unit	Carestream	Gel Logic 212 PRO
MaxQ SHKE6000 6000 Shaking Incubator - 115VAC	Thermo scientific	EW-51708-70
Plant growth chamber	MRC	PGI-550RH
Horizantal laminarair flow cabinate	Lumistell	LH-120
Fluorescent microscope	Leica	DM4500 B
Petridish	sym laboratorios	90X15
Scalpel Blade	Fisher scientific	53223
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher scientific	14-959-53A
22 mL glass tubes	Thomas scientific	45048-16150