植物启动子分析: 菜豆根瘤特异启动子的鉴定与表征

摘要

启动子表达分析对于提高对基因调控的理解和靶基因的时空表达至关重要。在这里, 我们提出了一个协议, 以确定, 隔离和克隆植物启动子。此外, 我们还描述了在菜豆多毛根中的根瘤特异启动子的特性。

摘要

基因编码序列的上游序列被称为启动子序列。研究促进剂的表达模式对于了解靶基因的基因调控和时空表达模式具有重要意义。另一方面, 建立启动子评估工具和遗传转化技术是快速、高效和可重现性的关键。在本研究中, 我们研究了在转基因毛状根中, 根瘤菌共生特异性结节启动子 (菜豆) 的时空表达模式。利用植物基因组数据库和分析工具, 我们在转录融合中发现、分离和克隆了P. 寻常的启动子酶 (gus) gus 增强:: GFP。此外, 该协议还描述了一种快速而多样的遗传转化系统, 使用 农杆菌杆菌诱导的毛状根。该系统在转化后10至12天内产生≥2厘米毛状根。接下来, 我们评估了在 post-inoculation 的周期性时间间隔内, 在根瘤菌中接种多毛根的时空表达。GUS 活动的结果表明, 在结瘤过程中, 该启动子是活跃的。同时, 本协议还演示了如何识别、分离、克隆和描述在菜豆多毛根中的植物启动子。此外, 本协议易于在非实验室中使用。

引言

促进剂是重要的分子生物学工具, 在理解基因表达的调节方面起着至关重要的作用。发起人是基因序列的翻译起始密码子的上游的 DNA 序列, 它们携带着基因的中央调控信息;因此, 正确的注释和描述是理解基因功能的关键。根据表达模式, 植物促进剂被归类为本构、组织特异性, 或发展阶段特定和诱导的¹。组技术的进步, 计算机建模的改进, 以及不同植物种类的基因组序列数量的增加, 促进了启动子序列的 large-scale 预测²。

另一方面, 建立启动子评估工具和遗传转化技术是快速、高效和可重现性的关键。与其他模型植物不同的是, 主要由于菜豆sp 的顽固性质, 导致了普通豆科豆类 (寻常型) 基因的功能特性。瞬变系统是一种替代的快速基因功能表征研究³。豆科植物共生研究中, 豆科寄主与根瘤菌细菌之间的相互作用是最易于操作的模型系统, 可用于结核特异基因的功能分析和促进剂研究。到目前为止, 与这些共生相关的几个豆类促进剂已经被描绘了, viz.,苜蓿蒺藜PT4⁴, SWEET11⁵,莲花日本的独眼巨人, UBQ⁶, VAG1⁷, 甘氨酸最大 PT5⁸, Exo70J⁹, 不寻常RbohB¹⁰,^11,12, TRE1¹³, PI3K¹⁴, TOR¹⁵,等。顺式元素直接影响基因调控。转录因子 ENBP1A 绑定到Cis管理区域 (−692 bp) 的早期瘤VfENOD12, 这有助于表达一个记者基因在结核原的蚕豆¹⁶。将结核特异性启动子 leghemoglobin GLB3 与异源截断促进剂δ-p35S 和δ-pNOS 的Cis管理区域 (−161 to −48 bp) 替换为结核特异性和减少启动子活性的损失¹⁷.

以前的报告显示, 在根毛细胞中启动根瘤菌感染需要转录因子, 对L. 日本对虾¹⁸中的根瘤发生器官也至关重要。在本研究中, 我们描述了一个协议的识别, 分离, 克隆, 并表征结核特异性启动剂在共同豆毛根。为了达到这一目的, 我们选择了一个根瘤菌的共生特异的一个. ....。此外, 该协议还描述了使用 a. 杆菌诱导的毛状根快速而多样的遗传转化系统。该系统在转化后不到2周内产生毛状根。最后, 用 GUS 染色法对根瘤菌定植的根瘤的时空表达进行了评价。

这里描述的过程不仅对于研究结瘤和根的豆科植物的¹¹是有用的, 而且对于在根¹⁹中的启动子表达模式的研究也是有益的。此外, 本协议易于在非实验室中使用。

研究方案

1. 识别、分离和克隆寻常型的促进者

1. 确定感兴趣基因的启动子序列。有几个基因组数据库和分析工具可用于植物, 如 Phytozome, Ensembl 植物, NCBI,等豆类启动子P. 寻常(PvNIN;Phvul. 009G115800) 在本研究中使用了²⁰。
2. 设计寡为网关或传统限制酶克隆取决于所使用的向量系统 (图 1A)。
   注: 标准 (25-35 bp), 盐水底漆工作正常。反向寡核苷酸序列, 在启动子和基因之间的侧翼是可取的。
3. 使用启动子特异性寡集, 从新近分离的P. 寻常基因组 DNA 中放大 PvNIN 启动子区域 (或感兴趣基因的启动子区域)。使用高保真聚合酶与以下 PCR 条件:95 ° c 为5分钟;30周期 (95 ° c 为三十年代, 55 ° c 为三十年代, 72 ° c 为 1 min);和72° c 为 5 min。
4. 运行放大片段1% 琼脂糖凝胶在 7 x 10 cm 凝胶托盘上, 并洗相应的增 (700 bp,图 1B) 和克隆到 pENTR/d-拓扑向量根据制造商的说明。
5. 使用制造商的说明和性兄弟 (LB) 补充50毫克/升卡那霉素 (Kan50) 的µL 150 µL, 将反应转化为合格的大肠杆菌细胞。在37° c 的夜间生长镀膜细胞。
6. 选择3-6 殖民地和文化过夜, 在 LB 培养基含有 Kan50。采用选择方法分离质粒 DNA, 用 PCR 法对质粒进行 M13 寡。用于 pcr, 使用 100 ng 质粒, 0.3 pm 寡, 10X pcr 缓冲, 0.5 U Taq DNA 聚合酶, 和10毫米 dNTPs。
7. 使用以下 PCR 扩增条件;95° c 为 3 min;30周期 (95 ° c 为三十年代, 58 ° c 为三十年代, 72 ° c 为七十五年代);72° c 为7分钟, 在1% 琼脂糖凝胶上可视化 PCR 产物。确保正确的插入有一个波段在 1024 bp 和没有插入的向量将有一个 324 bp 波段 (图 1C)。
8. 根据制造商的说明, 在输入向量 (pENTR/D-拓扑-PvNIN) 和目标矢量 pBGWFS7.0²¹之间执行 LR 反应。
9. 将2µL 的 LR 反应转化为合格的大肠杆菌细胞, 使用标准技术, 如制造商的说明和板150µL 的转化混合物在 LB 补充与100毫克/升霉 (Spe100)。在37° c 的夜间生长镀膜细胞。
10. 选择大约5殖民地和文化他们过夜在 LB 培养基含有 Spe100。用选择的方法分离质粒 DNA, 利用启动子特异寡对质粒进行 PCR 分析。
11. 在步骤1.3 中使用 PCR 条件。在1% 琼脂糖凝胶上可视化 PCR 产品, 以确认放大。增是 700 bp。
12. 序列阳性质粒 pBGWFS7.0/PvNIN:: GUS-GFP (图 1D) 与启动子特定的寡验证插入的真实性。
13. 将质粒转化为杆菌应变 K599 (但是, 可以使用a. 杆菌的任何其他菌株)。添加2µL 的质粒准备到50µL electrocompetent 细胞和 electroporate 在一个1毫米试管与以下设置: 1.8 伏, 25 µF, 和200Ω。
14. 回收500µL 的 SOC 介质中的电池, 在28° c 下为 2 h 板上的 LB-Spe100, 在28° c 下生长2天。
15. 执行步骤1.7 所述的菌落筛选, 并使用步骤1.3 中的 PCR 条件。使甘油的库存从积极的克隆和存储在-80 ° c。
16. 使用杆菌区域性将空的 pBGWFS7.0 向量作为负控制。

2. a. 杆菌转换普通 Bean 的毛状根

1. 用50毫升的96% 乙醇为1分钟消毒豆类 (Jamapa) 种子 (约 20), 丢弃乙醇;然后加入50毫升20% 漂白剂 (次氯酸钠) 为10分钟, 在层流罩中不断混合。去除漂白剂, 在多余的无菌水中洗涤3次。
   注意: 其他的寻常型品种可用于毛状根的诱导。
2. 在 #38 的无菌滤纸上萌发灭菌种子; 迪尔沃斯 (B 和 #38;D) 解决方案²² (表 1) 在黑暗中在28° c 的2天。
3. 转换前一天准备以下内容:
   1. 条纹出150µL 的杆菌区域性, 它窝藏二进制向量 (在步骤1.13 和1.14 中准备) 在固态 LB Spe100 上, 在一夜之间生长在28° c。
   2. 用 B 和 #38;D 溶液填充15毫升管, 并用双层铝箔代替螺钉盖。组装成一个22厘米的玻璃管包含10毫升的 B 和 #38;D 解决方案 (图 2C) 和高压釜。
4. 在转换的当天, 在层流罩中组装以下无菌材料: 从步骤2.2 萌发的种子, 从台阶2.3.1 的培养基, 2.3.2 的试管, 无菌双蒸馏水 (10 毫升), 管和吸管提示, 无菌钳,和3毫升注射器
5. 使用弯曲的200µL 尖将杆菌细胞从板上刮到离心管和重1毫升的双无菌水中。同样, 分别准备矢量控制单元。
   1. 将细胞轻轻地混合到重。不要涡流。
6. 使用无菌吸管尖端在2.3.2 的管子的铝箔上制造一个 3 mm 的孔。
7. 收集的细胞 (无论是启动子或矢量控制) 从步骤2.5 与注射器和轻微刺痛胚的发芽种子与针尖 (图 2G)。
   注意: 确保针穿透 (4-6 次) 的血管组织, 并注入小 (〜5µL) 滴的细胞在不同位置的伤口周围的下胚轴。
8. 小心地将注入苗的根部插入包含 B 和 #38;D 溶液中的 15 mL 管的 3 mm 孔中。返回整个安装到22毫升玻璃管和密封他们保持湿度。
9. 孵育在28° c 保持的生长腔中的管, 16 h light:8 的暗光周期。
   注: 孵化后3-4 天, 植株生长到22毫升玻璃管的边缘。

在这个阶段, 取下瓶盖, 用膜在阀杆周围封住边缘, 如图 2I所示。

在5-7 天内观察伤口部位的愈伤组织, 并在转化后10-12 天内发现2厘米毛状根。
注意: 在塑料和玻璃管中经常保持 B 和 #38;D 解决方案是很重要的。

2周后, 通过切割茎2厘米以下的毛状根, 将原根移植到含有无菌蛭石的盆中。将植物保持在生长室 (16 小时 light:8 28 ° c), 用 B 和 #38;D 溶液冲洗。

3. 启动子分析: 菜豆根瘤菌结节的启动子表达

1. 为诱导根瘤, 接种根瘤菌 tropici或根瘤菌 etli (与普通豆类相容) 在100毫升培养基 (0.5 克蛋白胨, 0.3 克酵母提取物) 补充与700毫米 CaCl₂和20毫克毫升¹啶酸孵育在30° c 为 24 h 与摇晃在300转每分钟。
   注: 在转基因根瘤菌的情况下, 可以使用任何特定的抗生素。
2. 将离心机中的细胞在室温下为3分钟, 在10毫升的 10 mM MgSO₄中重。通过稀释与 10 mM MgSO₄, 在 od₆₀₀时将单元格外径调整为0.6。
3. 接种1-2 毫升的培养 (从步骤 3.2) 每株 (促进剂和矢量控制) 诱导结节生长的毛状根。用有限的氮气 (2 mM₃) #38;D 溶液灌溉植物以促进结瘤。
4. 根据实验需要, 收集不同时间点的毛状根。收集用于研究3-5 天后接种 (dpi) 的感染线索的样本。
   注: 原始结核和幼结节可分别在 6-9 dpi 和10-12 天的 dpi 处进行研究。最后, 成熟和功能性结节可在 14-21 dpi、senesced 结节和 #62; 28 dpi。
5. 处理报告基因活动的根/结节 (GUS 或 GFP)。根据杰斐逊²³描述的协议分析 GUS 活动。荧光显微镜下观察 GFP。用蓝色氩离子激光 (488 nm) 激发 GFP 荧光, 并从510到 540 nm 收集发射荧光。

结果

本研究的目的是评估结核特异性P的时空表达模式。为此, 选择了寡基因的翻译起始密码子的上游 700 bp 区域, 并在 图 1A中描述了一组设计。使用高保真的聚合酶, 该在一级启动子片段被放大, 孤立 (图 1B), 并通过网关方法克隆到目标二进制向量 pBGWFS7.0 (图 1C), 从而生成一个转录融合到嵌合记者 g...

讨论

在基因的功能分析中, 基因表达模式的研究对理解体内的基因的时空调控起着至关重要的作用。研究基因表达模式的一个众所周知的方法是克隆感兴趣的基因启动子区, 上游到报告基因如荧光标记基因 (GFP, RFP,等) 或β-酶。在此, 我们选择了根结节共生 (RNS) 特异性基因的启动子区域, 以研究在 RNS 中的P. ) 中的时空表达模式。选定的启动子序列已被克隆到上游的 GFP:: GUS 记者使用网...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Primers for qRT-PCR assay
pNIN Forward	CACC ATA GCT CCC CAA AAT GGT AT
pNIN Reverse	CAT CTT CCT TCC ACT AAC TAA C
M13 Forward	GTA AAA CGA CGG CCA G
M13 Reverse	CAG GAA ACA GCT ATG AC
Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
pENTR/D-TOPO Cloning Kit	Invitrogen	K243520
Gateway LR Clonase II Enzyme Mix	Invitrogen	11791100
pBGWFS7.0	Plant systems biology	https://gateway.psb.ugent.be/vector/show/pBGWFS7/search/index/
Platinum Taq DNA Polymerase	ThermoFisher Scientific	10966018
DNeasy Plant Mini Kit	Qiagen	69104
PureLink Quick Gel Extraction Kit	ThermoFisher Scientific	K210012
Platinum Pfx DNA Polymerase	Invitrogen	11708013
Certified Molecular Biology Agarose	Bio-Rad	1613102
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli	Invitrogen	C404006
Nacl	Sigma-Aldrich	S7653
Tryptone	Sigma-Aldrich	T7293-250G
Yeast extract	Sigma-Aldrich	Y1625-250G
Bacteriological agar	Sigma-Aldrich	A5306-1KG
Kanamycin sulfate	Sigma-Aldrich	60615-25G
Spectinomycin sulfate	Sigma-Aldrich	PHR1441
Ethyl alcohol	Sigma-Aldrich	E7023
Bacteriological peptone	Sigma-Aldrich	P0556
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C1016
Nalidixic acid	Sigma-Aldrich	N8878
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506
Gel loading solution	Sigma-Aldrich	G7654
Name	Company	Catalog Number	Comments
EQUIPMENT
Thermocycler	Veriti Thermal Cycler	4375786
Centrifuge	Sigma	Sigma 1-14K
Gel documentation unit	Carestream	Gel Logic 212 PRO
MaxQ SHKE6000 6000 Shaking Incubator - 115VAC	Thermo scientific	EW-51708-70
Plant growth chamber	MRC	PGI-550RH
Horizantal laminarair flow cabinate	Lumistell	LH-120
Fluorescent microscope	Leica	DM4500 B
Petridish	sym laboratorios	90X15
Scalpel Blade	Fisher scientific	53223
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher scientific	14-959-53A
22 mL glass tubes	Thomas scientific	45048-16150