Análise do promotor de planta: Identificação e caracterização de raiz nódulo promotor específico no feijão comum

Resumo

As análises de expressão do promotor são cruciais para melhorar a compreensão da regulação gênica e a spatiotemporal expressão de genes-alvo. Aqui apresentamos um protocolo para identificar, isolar e clonar um promotor da planta. Além disso, descrevemos a caracterização do promotor nódulo específicos nas raízes peludo feijão comum.

Resumo

As montante sequências do gene sequências de codificação são denominadas como sequências de promotor. Estudar os padrões de expressão dos promotores são muito importantes na compreensão da regulação gênica e padrões spatiotemporal expressão de genes-alvo. Por outro lado, também é fundamental para estabelecer instrumentos de avaliação do promotor e técnicas de transformação genética rápida, eficiente e reprodutível. Neste estudo, investigamos o padrão de expressão spatiotemporal promotor de início (NIN) da linha específica simbiose nódulo de Phaseolus vulgaris nas raízes transgénicas peludas. Usando bancos de dados do genoma de plantas e ferramentas de análise, identificamos, isolado e clonou o promotor NIN de p. vulgaris em uma fusão transcriptional para o repórter quimérico β-glucuronidase (GUS) GUS-enhanced::GFP. Além disso, este protocolo descreve um sistema de transformação genética no p. vulgaris , usando raízes peludas Agrobacterium rhizogenes induzido rápido e versátil. Este sistema gera raízes peludo de ≥2 cm em 10 a 12 dias após a transformação. Em seguida, avaliamos a expressão spatiotemporal de promotor do NIN em raízes peludas de Rhizobium inoculado em intervalos periódicos de pós inoculação. Nossos resultados retratados pela atividade de GUS mostram que o promotor NIN era ativo durante o processo de nodulação. Juntos, o presente protocolo demonstra como identificar, isolar, clonar e caracterizar um promotor de planta nas raízes peludo feijão comum. Além disso, este protocolo é fácil de usar em laboratórios não especializados.

Introdução

Os promotores são importantes ferramentas moleculares biológicas que desempenham um papel crucial na compreensão do Regulamento da expressão de genes de interesse. Os promotores são sequências de ADN, situadas a montante da tradução códon de iniciação do gene sequences e carregam a informação central reguladora de genes; Portanto, sua correta anotação e caracterização são vitais para entender a função dos genes. Dependendo dos padrões de expressão, promotores da planta são classificados como constitutivas, tecido-específica, ou desenvolvimento-estágio-específicos e inducible¹. Avanços em tecnologias de transcriptomic, melhorias na modelagem de computador e a disponibilidade de um número crescente de sequências do genoma para diferentes espécies de plantas têm facilitado a previsão em grande escala do promotor sequências².

Por outro lado, também é fundamental para estabelecer instrumentos de avaliação do promotor e técnicas de transformação genética rápida, eficiente e reprodutível. Ao contrário das outras plantas de modelo, a caracterização funcional de genes de vegetal (p. vulgaris) feijão comum é impedida principalmente devido à natureza recalcitrante de Phaseolus SP. para transformação genética estável. Sistemas de transformação transitória servem como uma alternativa para a genética de estudos de caracterização funcional³. Na pesquisa de simbiose vegetal, a interação entre a planta hospedeira de vegetal e linha bactéria é um dos sistemas mais tractable modelo para a análise funcional de genes específicos do nódulo e estudos de promotor. Até agora, vários promotores de vegetal relacionados com estes simbiose tem sido caracterizada, Viz, Medicago truncatula PT4⁴, SWEET11⁵, Lotus japonicus Cyclops, UBQ⁶, VAG1⁷, Glycine máx PT5 ⁸, Exo70J⁹, p. vulgaris RbohB^10,11,12, TRE1¹³, PI3K¹⁴, TOR¹⁵, etc. Cis elementos influenciam diretamente a regulação gênica. O fator de transcrição ENBP1A vincula-se a uma região reguladora Cis (−692 bp) de início nodulin VfENOD12, e isso facilita a expressão de um gene repórter no primordia nódulo de Vicia faba¹⁶. Substituição das regiões reguladoras Cis (−161 a −48 bp) promotor da específicas do nódulo leghemoglobin GLB3 com a heteróloga truncado promotores δ-p35S e δ-pNOS, resultou em uma perda de especificidade do nódulo e reduzida actividade promotora¹⁷ .

Relatórios anteriores mostram que o fator de transcrição NIN é necessária para o início da linha infecção nas células da raiz do cabelo e também é essencial para a organogênese nódulo em L. japonicus¹⁸. No presente estudo, descrevemos um protocolo para a identificação, isolamento, clonagem e caracterização do promotor específico nódulo nas raízes peludo feijão comum. Para conseguir isso, selecionamos um linha promotor de NIN simbiose específico de p. vulgaris e clonado em uma fusão transcriptional para o repórter quimérico GUS-enhanced::GFP. Além disso, este protocolo descreve um sistema de transformação genética no p. vulgaris , usando a. rhizogenes induzido peludas raízes rápido e versátil. Este sistema gera raízes peludas em menos de 2 semanas após a transformação. Finalmente, avaliamos a expressão spatiotemporal de promotor do NIN em nódulos de raiz rizóbios colonizados por GUS coloração.

O procedimento descrito aqui pode ser útil não só para o estudo da nodulação e mycorrhization¹¹ dos legumes, mas também para o estudo de padrões de expressão promotor em raízes¹⁹. Além disso, este protocolo é fácil de usar em laboratórios não especializados.

Protocolo

1. identificação, isolamento e clonagem de P. Vulgaris NIN promotor

1. Identifica a sequência do promotor para o gene de interesse. Existem vários bancos de dados do genoma e a ferramentas de análise disponíveis para as plantas tais como Phytozome, plantas de Ensembl, NCBI, etc A vegetal promotor p. vulgaris NIN (PvNIN; Phvul.009G115800) foi utilizado no presente estudo²⁰.
2. Projeto oligos para Gateway ou enzima de restrição tradicional dependendo do sistema de vetor de clonagem usado (figura 1A).
   Nota: Padrão (bp 25-35), as primeiras demão demolhado funcionam bem. Sequências de oligo reversa que flanquean entre o promotor e gene são aconselháveis.
3. Amplificar a região promotora de PvNIN (ou região promotora do gene de interesse) de recém isoladas p. vulgaris DNA genômico, usando o conjunto de oligo promotor específico. Use um polymerase de alta fidelidade com as seguintes condições PCR: 95 ° C por 5 min; 30 ciclos (95 ° C por 30 s, 55 ° C por 30 s, 72 ° C por 1 min); e 72 ° C por 5 min.
4. Execute o fragmento amplificado em gel de agarose 1% em 60 V em uma bandeja de gel de 7 x 10 cm e eluir o amplicon correspondente (700 bp, figura 1B) e clone no vetor pENTR/D-TOPO de acordo com as instruções do fabricante.
5. 2 µ l da reação em competentes de Escherichia coli de transformar células usando as instruções do fabricante e placa 150 µ l da mistura de transformação no irmão lisogenia (LB), suplementado com canamicina 50 mg/L (Kan50). Crescem as células chapeadas a 37 ° C durante a noite.
6. Escolha 3-6 colônias e cultura-los durante a noite em meio LB contendo Kan50. Isolar o plasmídeo usando o método de escolha e analisar o plasmídeo por PCR usando o vetor específico M13 oligos. Para o PCR, uso 100 ng do plasmídeo, 12:03 de oligos, 10 X buffer de PCR, 0,5 U Taq DNA polimerase e 10mm dNTPs.
7. Use as seguintes condições de amplificação do PCR; 95 ° C por 3 min; 30 ciclos (95 ° C por 30 s, 58 ° C por 30 s, 72 ° C para 75 s); e 72 ° C por 7 min. Visualizar os produtos PCR em um gel de agarose 1%. Certifique-se de que as inserções corretas tem uma banda em 1.024 bp e vetores sem inserções de vontade ter uma banda de bp 324 (Figura 1).
8. Realizar a reação de LR entre um vetor de entrada (pENTR/D-TOPO-PvNIN) e destino vector pBGWFS7.0²¹ , usando uma mistura de enzima comercial de acordo com as instruções do fabricante.
9. 2 µ l de reação de LR em competentes de Escherichia coli de transformar células usando técnicas padrão, como descrito nas instruções do fabricante e placa 150 µ l de mistura de transformação na LB suplementado com 100 mg/L de espectinomicina (Spe100). Crescem as células chapeadas a 37 ° C durante a noite.
10. Escolher a aproximadamente 5 colônias e cultura-los durante a noite em meio LB contendo Spe100. Isolar o plasmídeo de DNA usando um método de escolha e analisar o plasmídeo por PCR usando os oligos promotor específico.
11. Use as condições PCR na etapa 1.3. Visualize os produtos PCR em um gel de agarose a 1% para confirmar a amplificação. Amplicons são 700 bp.
12. Sequenciar o plasmídeo positivo pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP (Figura 1) com os oligos promotor específico para verificar a autenticidade da inserção.
13. Transforme os plasmideos cepa da . rhizogenes K599 (no entanto, quaisquer outras cepas da . rhizogenes podem ser usadas). Adicionar 2 µ l da preparação do plasmídeo de 50 µ l de células de electrocompetent e electroporate em uma cubeta de 1 mm, com as seguintes configurações: 1,8 kV, 25 µF e 200 Ω.
14. Recuperar as células em ~ 500 µ l de meio SOC e agitar a 28 ° C, durante 2 h. placa na LB-Spe100 e crescer a 28 ° C durante 2 dias.
15. Realizar triagem de colônia, como mencionado na etapa 1.7 e usar as condições PCR como no passo 1.3. Fazer estoques de glicerol a partir de clones positivos e armazená-los em-80 ° C.
16. Use a. rhizogenes cultura, abrigando o vetor vazio pBGWFS7.0 como controlo negativo.

2. A. Rhizogenes transformado peludas raízes do feijão comum

1. Esterilizar as sementes do feijão (p. vulgaris CV Jamapa Negro) (aproximadamente 20) em 50 mL de etanol a 96% para 1 min e descartar o etanol; em seguida, adicione 50 mL de 20% de alvejante (hipoclorito de sódio) por 10 min, com a mistura constante em uma capa de fluxo laminar. Remover a lixívia e lavar em água estéril excesso 3 vezes.
   Nota: Outras cultivares de p. vulgaris podem ser usados para indução de raiz peludo.
2. Germinar as sementes esterilizadas em papéis de filtro estéril umedecidos com Broughton & Dilworth (B & D) solução²² (tabela 1) para 2 dias no escuro a 28 ° C.
3. O dia antes da transformação, prepare o seguinte:
   1. Raia fora 150 µ l da . rhizogenes cultura, abrigando o vetor binário (preparado em etapas 1.13 e 1.14) no sólido Spe100 LB e crescer a 28 ° C durante a noite.
   2. Encher um tubo de 15ml com B & solução D e substituir a tampa de rosca com folha de alumínio em camadas duplas. Montar um tubo de vidro 22cm contendo 10 mL de B & solução D (Figura 2) e autoclave isso.
4. No dia da transformação, reúna os seguintes materiais esterilizados em uma capa de fluxo laminar: germinadas as sementes da etapa 2.2, placa de cultura de passo 2.3.1, tubos da etapa 2.3.2, água bidestilada estéril (10 mL), pipetas e pontas de pipetas, Pinças esterilizadas, e seringas de 3 mL.
5. Use uma ponta de 200 µ l dobrado para raspar a. rhizogenes células da placa em um tubo de microcentrifugadora e ressuspender em 1 mL de água estéril dupla. Da mesma forma, prepare células de controle de vetor separadamente.
   1. Misture as células suavemente para ressuspender. Fazer não o vórtice.
6. Faça um buraco de 3 mm sobre a folha de alumínio dos tubos da etapa 2.3.2 usando uma ponta de pipeta estéril.
7. Coletar as células (controle de um promotor ou vetor) da etapa 2.5 com a seringa e picar ligeiramente o hipocótilo das sementes germinadas com a ponta da agulha (Figura 2).
   Nota: Certifique-se que a agulha penetra (4 - 6 vezes) o tecido vascular e injetar pequenas (~ 5 µ l) gotas das células na ferida em posições diferentes em torno do hypocotyl.
8. Insira cuidadosamente as raízes das mudas injetadas no orifício de 3 mm do tubo 15 mL contendo B & solução D. Retornar a instalação inteira para o mL 22 tubos de vidro e selá-los para manter a umidade.
9. Incubar os tubos em uma câmara de crescimento a 28 ° C, com 16 h luz: 8 h fotoperíodo escuro.
   Notas: 3-4 dias após a incubação, as plantas crescem até a borda de tubos de vidro de 22 mL.

Nesta fase, retirar as tampas e selar a borda com parafilme em torno da haste, conforme mostrado na Figura 2I.

Observar o calo no sites ferindo de 5-7 dias e encontrar ~ raízes peludo de 2 cm por 10-12 dias após a transformação.
Nota: É importante manter o B & solução D constantemente em tubos plásticos e de vidro.

Depois de 2 semanas, remover a raiz primária pelo corte da haste 2 cm abaixo das raizes peludas e as raízes primárias de transplante para vasos contendo vermiculita estéril. Manter as plantas em uma câmara de crescimento (16 h luz: 8 h escuro a 28 ° C) e irrigar com B & solução D.

3. promotor análise: NIN promotor expressão em linha nódulos do feijão comum

1. Para a indução de nódulos de raiz, inocular Rhizobium tropici ou Rhizobium etli (que são compatíveis para o feijão comum) em 100 mL de meio PY (peptona 0,5 g, 0,3 g de extrato de levedura) suplementado com 700 mM CaCl₂ e 20 mg mL^{− 1} ácido nalidíxico. Incube a 30 ° C por 24 h com agitação a 300 rpm.
   Nota: Qualquer antibiótico específico pode ser usado no caso de transgénicos Rhizobium.
2. As células em uma centrífuga para 3 min a 2.800 x g, à temperatura de pelotas e ressuspender em 10 mL de MgSO₄a 10 mm. Ajuste o OD de células de 0,6 em OD₆₀₀ por diluição com 10 mM de MgSO₄.
3. Inocule 1-2 mL de cultura (preparada a partir de passo 3.2) por planta (tanto o promotor e o vetor de controle) para induzir o crescimento de nódulos nas raízes peludos. Irrigar as plantas com B & solução D com nitrogênio limitado (2mm KNO₃) para promover a nodulação.
4. Dependendo da necessidade experimental, recolha as raízes peludas em pontos diferentes do tempo. Coletamos amostras para o estudo de tópicos de infecção entre 3 a 5 dias pós inoculação (dpi).
   Nota: Nódulo Primordial e jovens nódulos podem ser estudados em dpi 6-9 e 10-12 dias dpi, respectivamente. Finalmente, nódulos maduros e funcionais podem ser estudados em dpi de 14-21 e nódulos de senesced em > 28 dpi.
5. Processe os raiz/nódulos para a atividade de genes repórter (GUS ou GFP). Analise a atividade do GUS de acordo com o protocolo descrito por Jefferson²³. Observe as boas práticas agrícolas sob um microscópio de fluorescência. Excitar a fluorescência de GFP com um laser de íon argônio azul (488 nm) e recolher a fluorescência emitida de 510 a 540 nm.

Resultados

O objetivo deste estudo foi avaliar o padrão de expressão spatiotemporal de nódulo específicas p. vulgaris NIN. Para fazer isso, uma região de bp 700 montante de códon de iniciação da tradução do gene do NIN foi selecionado e um conjunto de oligos foi projetado como ilustrado na figura 1A. Usando um polymerase de alta fidelidade, o fragmento de promotor NIN foi amplificado, isolado (figura 1B) e clonad...

Discussão

Durante a análise funcional de genes, o estudo de padrões de expressão genética desempenha um papel crucial na compreensão do Regulamento espacial e temporal de genes na vivo. Um método conhecido para estudar os padrões de expressão do gene é para clonar a região de promotor do gene de interesse, montante de genes repórter como genes marcador fluorescente (GFP, RFP, etc.) ou β-glucuronidase. Aqui, selecionamos uma região promotora do gene específico da raiz nódulo simbiose (RNS), NIN, par...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Primers for qRT-PCR assay
pNIN Forward	CACC ATA GCT CCC CAA AAT GGT AT
pNIN Reverse	CAT CTT CCT TCC ACT AAC TAA C
M13 Forward	GTA AAA CGA CGG CCA G
M13 Reverse	CAG GAA ACA GCT ATG AC
Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
pENTR/D-TOPO Cloning Kit	Invitrogen	K243520
Gateway LR Clonase II Enzyme Mix	Invitrogen	11791100
pBGWFS7.0	Plant systems biology	https://gateway.psb.ugent.be/vector/show/pBGWFS7/search/index/
Platinum Taq DNA Polymerase	ThermoFisher Scientific	10966018
DNeasy Plant Mini Kit	Qiagen	69104
PureLink Quick Gel Extraction Kit	ThermoFisher Scientific	K210012
Platinum Pfx DNA Polymerase	Invitrogen	11708013
Certified Molecular Biology Agarose	Bio-Rad	1613102
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli	Invitrogen	C404006
Nacl	Sigma-Aldrich	S7653
Tryptone	Sigma-Aldrich	T7293-250G
Yeast extract	Sigma-Aldrich	Y1625-250G
Bacteriological agar	Sigma-Aldrich	A5306-1KG
Kanamycin sulfate	Sigma-Aldrich	60615-25G
Spectinomycin sulfate	Sigma-Aldrich	PHR1441
Ethyl alcohol	Sigma-Aldrich	E7023
Bacteriological peptone	Sigma-Aldrich	P0556
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C1016
Nalidixic acid	Sigma-Aldrich	N8878
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506
Gel loading solution	Sigma-Aldrich	G7654
Name	Company	Catalog Number	Comments
EQUIPMENT
Thermocycler	Veriti Thermal Cycler	4375786
Centrifuge	Sigma	Sigma 1-14K
Gel documentation unit	Carestream	Gel Logic 212 PRO
MaxQ SHKE6000 6000 Shaking Incubator - 115VAC	Thermo scientific	EW-51708-70
Plant growth chamber	MRC	PGI-550RH
Horizantal laminarair flow cabinate	Lumistell	LH-120
Fluorescent microscope	Leica	DM4500 B
Petridish	sym laboratorios	90X15
Scalpel Blade	Fisher scientific	53223
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher scientific	14-959-53A
22 mL glass tubes	Thomas scientific	45048-16150