植物プロモーター解析: 同定とルート、インゲンの根粒特異的プロモーターの解析

要約

プロモーター発現解析は遺伝子の規則の理解と標的遺伝子発現の時空間を改善するために重要です。ここを識別、分離、および植物プロモーターのクローンを作成するためのプロトコルを提案する.さらに、一般的な豆毛状根における根粒特異プロモーターの特性について述べる。

要約

シーケンスを符号化する遺伝子の上流の配列は、プロモータ配列として名づけられます。プロモーターの発現パターンを勉強している非常に重要な遺伝子発現制御と標的遺伝子の時空間の発現パターンを理解します。その一方で、プロモーター評価ツールと、高速で効率的、かつ再現性のある形質転換技術の確立に重要ですも。この研究では、遺伝子組換えの毛状根のインゲンの根粒菌の共生固有結節創業 (NIN) プロモーターの時空間の発現パターンを調べた。植物ゲノム データベースと我々 を識別、分析ツールを使用して孤立してキメラの記者に転写融合でP. 尋常性ニン プロモーターをクローン (GUS) の β-グルクロニダーゼ活性ガス enhanced::GFP。さらに、このプロトコルは、 P. 尋常性サツマイモネコブセンチュウによる毛状根を用いた遺伝的変容の迅速かつ汎用性の高いシステムを説明します。このシステムでは、変換後 10 〜 12 日間で ≥2 cm 毛状根を生成します。次に、根粒菌接種後接種の定期的な間隔で毛状根におけるニン プロモーターの時空間表現を評価しました。ガスの活動によって描かれた結果表示ニン プロモーターが根粒形成のプロセス中にアクティブだった。一緒に、この議定書は、識別、分離、クローン、および一般的な豆毛状根の植物プロモーターを特徴付ける方法を示します。さらに、このプロトコルは、非専門の所で使いやすいです。

概要

プロモーターは、興味の遺伝子の発現調節機構を理解する上で重要な役割を果たす重要な分子生物学的ツールです。プロモーターは、dna 塩基配列を上流にある翻訳の系列の遺伝子の開始コドンと彼らを運ぶ遺伝子の中央の規制情報したがって、正しい注釈、特性は、遺伝子の機能を理解することに不可欠です。発現パターンに応じて植物プロモーターは、構成、組織固有または開発段階固有および誘導の¹として分類されます。トランスクリプトーム技術、コンピュータ モデルの改善および別の植物種のためのゲノム配列の数の増加の可用性の進歩はプロモーター配列²の大規模な予測を容易にしました。

その一方で、プロモーター評価ツールと、高速で効率的、かつ再現性のある形質転換技術の確立に重要ですも。他のモデル植物とは異なり、豆マメ (P. 尋常性) の共通の遺伝子の機能解析はインゲンマメsp 安定な形質転換のための反抗的な性質のために主に阻害します。一時的な変形システムは、迅速な遺伝子機能解析研究³のための代替として機能します。マメ科共生研究のマメ科植物と根粒菌の相互作用は、根粒特異遺伝子のプロモーターの研究機能の解析に最も扱いやすいモデル システムの 1 つです。これまでのところ、これらの共生に関連するいくつかのマメ科植物プロモーターがされている特徴、すなわち、ウマゴヤシ分子PT4⁴SWEET11⁵、ミヤコグササイクロプス UBQ⁶VAG1⁷、グリシン最大 PT5⁸Exo70J⁹, P. 尋常性RbohB^10、11,12、TRE1¹³、PI3K¹⁴、TOR¹⁵、など。Cis要素直接遺伝子に影響を与えます。転写因子 ENBP1A は初期 nodulin VfENOD12 のCisの規制地域 (−692 bp) に結合し、これはソラマメ¹⁶の根粒原基におけるレポーター遺伝子の発現を促進します。Cisの規制領域の置換 (−48 bp −161) 根粒特異プロモーターの異種のレグヘモグロビン GLB3 プロモーター δ p35S と δ pNOS、根粒特異性の損失で起因し、プロモーター活性^{17 低下}.

以前のレポートを示す転写因子ニン根毛細胞における根粒菌感染の開始に必要なミヤコグサ¹⁸根粒器官形成に欠かせないも.現在の研究では、識別、分離、クローニングおよび一般的な豆毛状根における根粒特異プロモーターのキャラクタリゼーションのためのプロトコルについて述べる。、これを達成するためには、 P. 尋常性の根粒菌共生固有ニン プロモーターを選択され、キメラ記者 GUS enhanced::GFP 転写融合のクローンします。さらに、このプロトコルでは、 A. 体の獲得による毛状根を用いたP. 尋常性における遺伝的変換処理の迅速かつ汎用性の高いシステムについて説明します。このシステムは、変換後の 2 週間以内に毛状根を生成します。最後に、GUS 染色によって植民地化された根粒菌根粒でニン プロモーターの時空間の発現を検討しました。

ここで説明する手順は、だけでなく、マメ科植物の根粒形成と mycorrhization の¹¹の研究でも根¹⁹プロモーター発現パターンの調査のために役立ちます。さらに、このプロトコルは、非専門の所で使いやすいです。

プロトコル

1. 識別、分離、およびp. 尋常性ニン プロモーターのクローニング

1. 興味の遺伝子のプロモーターを識別します。Phytozome、Ensembl 植物、NCBI、等A マメ科植物プロモーター P. 尋常性ニン (PvNIN; などの植物に使用できるいくつかのゲノム データベースと解析ツールがあります。Phvul.009G115800) はこの研究²⁰で使用されました。
2. デザイン oligos ゲートウェイまたはクローニング ベクトル システムによって従来の制限の酵素のためには、(図 1 a) が使用されます。
   注: 標準 (25-35 bp) 脱塩プライマー作業罰金。プロモーターと遺伝子との間に逃げ逆オリゴ シーケンスがお勧めです。
3. 新鮮単離P. 尋常性から PvNIN プロモーター領域 (または興味の遺伝子のプロモーター領域) を増幅する DNA のプロモーター固有オリゴ セットを使用して。高品質なポリメラーゼを使用し次の PCR 条件: 95 ° C、5 分。30 サイクル (95 ° C、30 s、55 ° C、30 秒、1 分の 72 ° C);5 分のための 72 ° C。
4. 60 V 7 × 10 cm ゲル トレイ上で 1% アガロースゲルで増幅されたフラグメントを実行し、対応する私アンプリコンを溶出 (700 bp、図 1 b) と製造元の指示に従って力がある pENTR/D ・ TOPO ベクターにクローン。
5. 2 μ L の有能なエシェリヒア属大腸菌に反応を変換ホストゲノム弟 (LB) 50 mg/L カナマイシン (Kan50) を添加した製造元の指示と変換の混合物のプレート 150 μ L を用いた細胞します。37 ° C でめっきされたセルを一晩成長します。
6. 3-6 植民地およびそれらは Kan50 を含む LB 培地で一晩培養を選択します。プラスミッドの選択法を用いた DNA を分離し、ベクトル特定 M13 oligos を用いた PCR によるプラスミドを分析します。PCR プラスミド 12:03 oligos の使用 100 ng の 10 X PCR バッファーの U Taq DNA ポリメラーゼ、10 mM dNTPs の 0.5。
7. 使用して、次の PCR 増幅条件;95 ° C、3 分。30 サイクル (95 ° C、30 s、58 ° C、30 秒、75 のための 72 ° C s);72 ° C で 7 分間は 1% の agarose のゲルの PCR の製品を可視化します。正しい挿入が 324 bp バンド (図 1) を持っている 1,024 の bp とベクトルの挿入はなしでバンドを持っていることを確認します。
8. LR 反応エントリ ベクトル (力がある pENTR/D-トポ-PvNIN) と宛先ベクトル pBGWFS7.0²¹を製造元の指示に従って市販酵素ミックスを使用してを実行します。
9. 2 μ L の有能なエシェリヒア属大腸菌に LR 反応を変換スペクチノマイシン (Spe100) 100 mg/L を添加したポンドに製造元の指示と変換の混合物のプレート 150 μ L で説明したように標準的な手法を用いた細胞します。37 ° C でめっきされたセルを一晩成長します。
10. 約 5 コロニーをピックアップし、Spe100 を含む LB 培地で一晩培養それら。プラスミッドの選択法を用いた DNA を隔離し、プロモーター固有 oligos を用いた PCR によるプラスミドを分析します。
11. 手順 1.3 の PCR 条件を使用します。増幅を確認する 1% の agarose のゲルの PCR の製品を視覚化します。Amplicons が 700 bp。
12. チップの信頼性を検証するプロモーター固有 oligos と肯定的なプラスミド pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP (図 1) をシーケンスします。
13. A. 体の獲得ひずみ K599 (ただし、 a. 体の獲得の他の系統を使用可能) に、プラスミドを変換します。次の設定で electrocompetent 細胞と 1 mm キュベットで electroporate を 50 μ l 添加するプラスミッドの準備の 2 μ L を追加: 1.8 kV、25 μ F、200 Ω。
14. 細胞を回復 〜 500 μ L の SOC 媒体振る 2 英ポンド Spe100 のプレートの 28 ° c と 28 ° C で 2 日間の成長します。
15. 前述のステップ 1.7 でコロニーのスクリーニングを実行し、手順 1.3 のように PCR 条件を使用します。肯定的なクローンからグリセロールを行い、-80 ° C で保存
16. A. 体の獲得文化陰性対照として空 pBGWFS7.0 ベクトルをかくまっているを使用します。

2 A. 体の獲得は一般的な豆の毛状根を変換。

1. 蒸気滅菌する (P. 尋常性品種黒人 Jamapa) の種子 (約 20) 1 分の 96% エタノール 50 mL とエタノール; を破棄層流フードの一定の混合での 10 分間 20% の漂白剤 (次亜塩素酸ナトリウム) の 50 mL を加えます。漂白剤を削除し、過剰な滅菌水で 3 回洗います。
   注: 他のP. 尋常性品種は、毛状根の誘導に使用できます。
2. ブロートンで湿らせた滅菌フィルター ペーパーに滅菌の種子を発芽 & ディルワース (B & D) ソリューション²² (表 1) の 28 ° C で暗闇の中 2 日間
3. 変換前に、の日は、次のものを準備してください。
   1. 固体の LB Spe100 のバイナリのベクトル (1.13 と 1.14 の手順で準備) をかくまっているA. 体の獲得文化の 150 μ L を連勝、一晩 28 ° C で育ちます。
   2. 15 mL チューブを詰めて B & D ソリューションと置換二重層状アルミ箔でスクリュー キャップ。B の 10 mL を含む 22 cm のガラス管を組み立てる & D ソリューション (図 2) とオートクレーブそれ。
4. 変換の日、次の滅菌材料の層流フードを組み立てる: 手順 2.2 から種子、培養プレート ステップ 2.3.1、ステップ 2.3.2 からチューブ、滅菌二重蒸留水 (10 mL)、ピペット、ピペット チップ、滅菌鉗子から発芽・ 3 mL 注射器。
5. 曲がって 200 μ L tip を使用して、遠心管にプレートからA. 体の獲得細胞をこすりし、二重の滅菌水 1 mL で再懸濁します。同様に、ベクトル制御の細胞を個別に準備します。
   1. 再懸濁しますに優しく細胞をミックスします。ボルテックスにかけないでください。
6. 2.3.2 滅菌ピペット チップを使用しての手順からチューブのアルミ箔に 3 mm の穴を確認します。
7. 注射器 2.5 ステップからセル (プロモーターまたはベクトル制御) を収集し、少し針の先端 (図 2) と発芽種子の胚軸を刺します。
   注: 針貫通 (4-6 回) 維管束組織を確認し、小さな注入 (~ 5 μ L) 胚軸まわりの異なった位置で傷の細胞が値下がりしました。
8. B を含む 15 mL チューブの 3 mm の穴に挿入された苗の根を慎重に挿入 & D ソリューション。22 mL ガラス管全体のセットアップに戻すし、湿度を維持するためにそれらを封印します。
9. 16 h 光: 8 の 28 ° C で維持成長槽内管を孵化させなさい h 暗い日長。
   ノート: インキュベーション後、3-4 日植物に育つ 22 mL ガラス管の縁。

この段階で、キャップをはずし、図 2 iで示すように、幹の周りパラフィルムで縁をシールします。

5-7 日で負傷のサイトでカルスを観察し、見つける 〜 10-12 日の変換後に 2 cm 毛状根。
注: それは B を維持するために重要な & 常にプラスチックやガラス管で D ソリューション。

2 週間後毛状根の下 2 cm の幹を切断することによってプライマリ ルートを削除し、滅菌バーミキュ ライトを入れたポットに根を移植します。成長室 (16 h 光: 8 h 28 ° C で暗い) の工場を維持し、B と灌漑 & D ソリューション。

3. プロモーター解析: ニン プロモーター式、インゲンの根粒菌の結節

1. 根粒の誘導、PY 培 (0.5 g ペプトン、酵母エキスを 0.3 g) 700 ミリメートル CaCl₂と 20 mg mL^{− 1}と 100 ml tropici 根粒菌や根粒菌 etli (一般的なマメに対応している) を接種します。ナリジクス酸。24 h の 30 ° C で 300 rpm で振とうしながらインキュベートします。
   注: 任意の特定の抗生物質は、形質転換根粒菌の場合される可能性があります。
2. 常温 2,800 × g で 3 分間遠心分離機でセルをペレットし、10 mM MgSO₄の 10 mL で再懸濁します。10 mM MgSO₄希釈による外径₆₀₀ 0.6 にセルの外径を調整します。
3. あたりの毛状根に根粒の成長を誘導する植物 (プロモーターおよびベクトル制御) (3.2 から準備) 文化の 1-2 mL を接種します。B が付いている植物に水を引く & 根粒形成を促進するために限られた窒素 (2 mM 自演₃) D ソリューション。
4. 実験の必要性によって異なる時点で毛状根を収集します。3-5 日間感染スレッドを勉強するための収集のサンプルの記事接種 (dpi)。
   注: 原始結節と若い結節で調査 6 9 dpi と解像度 10-12 日、それぞれ。最後に、成熟しており、機能性結節は 14-21 dpi とで senesced 結節で学ぶことができます > 28 dpi。
5. レポーター遺伝子 (ガスまたは GFP) の活動のための根粒を処理します。ジェファーソン²³で記述されたプロトコルに従ってガスの利用状況を分析します。GFP を蛍光顕微鏡下で観察します。青いアルゴン イオン レーザーを用いた GFP の蛍光性を刺激 (488 nm)、510 から 540 へ放出される蛍光の収集と nm。

結果

本研究の目的は、根粒特異P. 尋常性ニンの時空間の表現パターンを評価することだった。これを行うには、700 bp の領域は上流のニン遺伝子の翻訳開始コドンが選ばれ、oligos のセットは、図 1 aに示されている、設計されました。高忠実度のポリメラーゼを使用して、ニン プロモーター断片が増幅された、(図 1 b

ディスカッション

遺伝子の機能解析の中には、遺伝子発現パターンの研究は生体内で遺伝子の空間的で、一時的な規則を理解する上で重要な役割を果たしています。遺伝子発現パターンを勉強するよく知られているメソッドは、興味の遺伝子プロモーター領域のクローンを作成する蛍光マーカー遺伝子(GFP、RFP 等)など β-グルクロニダーゼ レポーター遺伝子の上流。ここで、ルート結節の共生 (RNS...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Primers for qRT-PCR assay
pNIN Forward	CACC ATA GCT CCC CAA AAT GGT AT
pNIN Reverse	CAT CTT CCT TCC ACT AAC TAA C
M13 Forward	GTA AAA CGA CGG CCA G
M13 Reverse	CAG GAA ACA GCT ATG AC
Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
pENTR/D-TOPO Cloning Kit	Invitrogen	K243520
Gateway LR Clonase II Enzyme Mix	Invitrogen	11791100
pBGWFS7.0	Plant systems biology	https://gateway.psb.ugent.be/vector/show/pBGWFS7/search/index/
Platinum Taq DNA Polymerase	ThermoFisher Scientific	10966018
DNeasy Plant Mini Kit	Qiagen	69104
PureLink Quick Gel Extraction Kit	ThermoFisher Scientific	K210012
Platinum Pfx DNA Polymerase	Invitrogen	11708013
Certified Molecular Biology Agarose	Bio-Rad	1613102
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli	Invitrogen	C404006
Nacl	Sigma-Aldrich	S7653
Tryptone	Sigma-Aldrich	T7293-250G
Yeast extract	Sigma-Aldrich	Y1625-250G
Bacteriological agar	Sigma-Aldrich	A5306-1KG
Kanamycin sulfate	Sigma-Aldrich	60615-25G
Spectinomycin sulfate	Sigma-Aldrich	PHR1441
Ethyl alcohol	Sigma-Aldrich	E7023
Bacteriological peptone	Sigma-Aldrich	P0556
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C1016
Nalidixic acid	Sigma-Aldrich	N8878
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506
Gel loading solution	Sigma-Aldrich	G7654
Name	Company	Catalog Number	Comments
EQUIPMENT
Thermocycler	Veriti Thermal Cycler	4375786
Centrifuge	Sigma	Sigma 1-14K
Gel documentation unit	Carestream	Gel Logic 212 PRO
MaxQ SHKE6000 6000 Shaking Incubator - 115VAC	Thermo scientific	EW-51708-70
Plant growth chamber	MRC	PGI-550RH
Horizantal laminarair flow cabinate	Lumistell	LH-120
Fluorescent microscope	Leica	DM4500 B
Petridish	sym laboratorios	90X15
Scalpel Blade	Fisher scientific	53223
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher scientific	14-959-53A
22 mL glass tubes	Thomas scientific	45048-16150