إينترافيتال المجهري لصاروخ موجه الوحيدات والأوعية المتصلة بورم في نموذج مورين لأمراض الشرايين الطرفية

Summary

هي وحيدات الوسطاء هامة من أرتيريوجينيسيس في سياق أمراض الشرايين المحيطية. باستخدام مصفوفة مثل الغشاء والفحص المجهري إينترافيتال، يحقق هذا البروتوكول الوحيدات صاروخ موجه والمتصلة بورم الأوعية بعد حقن الوحيدات في نموذج موريني ربط شريان فخذي.

Abstract

والهدف العلاجي لأمراض الشرايين المحيطية، ومرض القلب الاقفاري زيادة تدفق الدم إلى المناطق الدماغية الناجمة عن تضيق الفسيولوجية. جراحة الأوعية الدموية خياراً قابلاً للتطبيق في حالات مختارة، ولكن للمرضى دون مؤشرات لعملية جراحية مثل التقدم بقية الألم، الاسكيمية الحرجة أطرافهم، أو اختلالات كبيرة في الحياة أو العمل، وهناك احتمالات قليلة للتخفيف من حدة المرض. خلية العلاج عن طريق نضح الوحيدات محسنة من خلال تحفيز تشكيل الجانبية واحدة من عدد قليل من الخيارات غير الغازية.

ويبحث مجموعتنا أرتيريوجينيسيس بعد زرع الوحيدات في الفئران باستخدام نموذج الاسكيمية اللكتات. سابقا، قد أثبتنا تحسن التروية اللكتات استخدام زرع الوحيدات سينجينيك حفز الكزاز. بالإضافة إلى آثار على تشكيل الجانبية، نمو الورم يمكن أن تتأثر بهذا العلاج، وكذلك. للتحقق من هذه التأثيرات، نستخدم نموذج مصفوفة الغشاء مثل ماوس عن طريق حقن المصفوفة خارج الخلية من ساركومه انجيلبريث-هولم-سرب في الجناح الماوس، بعد انسداد الشريان فخذي.

بعد الدراسات الورم الاصطناعي، نستخدم الفحص المجهري إينترافيتال للدراسة في فيفو ورم الأوعية والوحيدات صاروخ موجه داخل الشرايين الجانبية. وقد وصف الدراسات السابقة النسيجي النظر في نماذج حيوانية، الذي يفترض التحليل اللاحق للتحف بعد الوفاة . نهجنا يتصور الوحيدات صاروخ موجه إلى مجالات الضمانات الاحتياطية في تسلسل الوقت الحقيقي، من السهل القيام به، ويحقق عملية تولد الأوعية أرتيريوجينيسيس وورم في الجسم الحي.

Introduction

أمراض القلب والأوعية الدموية، بما في ذلك أمراض القلب والشرايين أو أمراض الشرايين الطرفية، هي الأسباب الأكثر شيوعاً للوفاة على الصعيد العالمي¹. خلية العلاج هو اتباع نهج واعدة لعلاج أمراض القلب والأوعية الدموية، خاصة بالنسبة للأشخاص غير القادرين على الخضوع لعمليات جراحية. وهناك عدة نهج لاستخدام خلايا أو على مواد يفرزها كأداة علاجية^2،3، مع الهدف العام لتحسين التروية والحفاظ على وظيفة الأنسجة الدماغية وأونديربيرفوسيد. محاولة واحدة لتحقيق هذا الهدف هو تحسين أرتيريوجينيسيس، مما يعزز تنمية الشرايين الجانبية. وحيدات نوع خلية هامة المرتبطة بالضمانات الاحتياطية. مجموعتنا ركزت على البحث في آثار وحيدات في مناطق من الالتهاب^4،5، لا سيما باستخدام نموذج الاسكيمية اللكتات لحمل الاسكيمية، والتهاب اللاحقة⁶. الصفحة الرئيسية لمجالات التهاب وحيدات وتتسبب في الاستجابات النظامية المعقدة التي تؤدي إلى تطوير الضمانات الاحتياطية⁷.

مع استخدام الفحص المجهري إينترافيتال، يمكننا دراسة سلوك هذه الخلايا في الجسم الحي والاحتفال باستضافة أكثر من حقن وحيدات لمناطق التهاب. وتصف معظم الدراسات السابقة إلا بعد الوفاة من التحليلات، التي تنطوي على أضرار بما في ذلك مقدمة من التحف غذائها وإعداد كبيرة من الحيوانات اللازمة للأعمال التحضيرية. مع النهج الذي نتبعه، نحن يمكن التحقيق في العمليات المناعية ويعيش تشكيل الجانبية عن طريق التصوير في نقاط زمنية متعددة.

بالإضافة إلى وضع الشرايين الجانبية في المناطق الدماغية، وحيدات تؤثر أيضا على نمو الورم. للتحقيق في هذه العمليات، ونحن إدخال مصفوفة مثل الغشاء يستخرج من انجيلبريث-هولم-سرب ساركومه الماوس، ورم غنية في المصفوفة خارج الخلية البروتينات⁸، وتحليل استخدام الفحص المجهري إينترافيتال. يستخدم هذه المصفوفة لجزيئات اختبار الشاشة لتشكيل شبكة خلية بطانية أو العلاجات المضادة للسرطان عن طريق تثبيط الأوعية؛ وفي هذه الحالة، سوف نقيم إمكانيات الأوعية الورم وحيدات الخلية العلاج^9،،من¹⁰¹¹.

والهدف من هذا البروتوكول إظهار طريقة سهلة وفعالة دراسة العمليات المناعية الناجمة عن الاسكيمية في نموذج في فيفو . ونحن يمكن أن تولد بيئة اختبار أكثر واقعية مقارنة ب workup النسيجي للأنسجة العضلية بعد الوفاة .

Protocol

وأجرى دراستنا بإذن الدولة لسكسونيا، لانديسفيروالتونجسامت هالي، وفقا للمادة 8 من القانون الألماني لحماية الحيوانات. (المادة 8، الفقرة 1 من القانون الألماني لحماية الحيوانات من 18.05.2016-بجبي. أنا س 1206، 1313، تيرشفيرسف § 31 من 13.08.2013).

ملاحظة: استخدمت للتجارب هنا، 8 إلى 12 أسبوع القديمة بالب/ج الفئران الذكور، واستخدمت وحيدات البشرية من المتبرعين بالدم لتصور وحيدات عبر الفحص المجهري إينترافيتال-

1. "إعداد خلية"

ملاحظة: لعزل وحيدات، الرجاء راجع لدينا الفيديو المنشورة السابقة في جوف للحصول على إرشادات: " العزلة والحقن حقن من مورين نخاع العظام المستمدة وحيدات " قبل Wagner et al. ⁴

ملاحظة: عند العمل مع الخلايا جميع الخطوات يجب أن تكون معقمة لتجنب التلوث.

1. "خلية تلطيخ" مع 3,3 '-بيركلورات ديوكتاديسيلوكساكاربوسيانيني
   1. ريسوسبيند الخلايا في المصل المتوسطة الثقافة الحرة مع كثافة 1 × 10 ⁶ خلايا/مل.
      ملاحظة: يمكن فقط المصل المتوسطة الحرة تلطيخ كفاءة، حيث صبغ محبتين خلاف ذلك سوف تكون التقاطها بالفعل بمكونات محبتين للمصل.
   2. إضافة 5 ميليلتر من 1 مم 3,3 '-بيركلورات ديوكتاديسيلوكساكاربوسيانيني في ديميثيلفورماميدي إلى 1 مل تعليق خلية وريسوسبيند بعناية-
   3. إينكوباتي حل الخلية عند 37 درجة مئوية عن 20 دقيقة
   4. الطرد المركزي الخلايا في 37 درجة مئوية و 500 غرام x للحد الأدنى 5
   5. إزاحة المادة طافية وريسوسبيند في الخلايا التي تحتوي على 37 درجة مئوية الحارة العجل الجنين المصل تكمل المتوسطة-
   6. كرر الخطوات 1.1.4 و 1.1.5 مرتين.
   7. عد الخلايا مع الصيغة:
      
   8. ريسوسبيند الخلايا مع محلول كلوريد الصوديوم 0.9% ميليلتر العقيمة 150-
   9. حقن الخلايا في هذا السياق الذيل.

2. التخدير

1. التخدير استنشاق
   1. تبخير isoflurane مع المساعدة من المبخر باستخدام تركيز 5% في حاوية مغلقة تحت غطاء سلامة كيميائية-
   2. التعامل مع الماوس بعناية ووضعه في سلة المهملات.
   3. التعامل مع الحيوان بالجلد من مؤخرة العنق بعد أن توقف تتحرك.
2. التخدير داخل
   ملاحظة: استخدام التخدير إيسوفلوراني، المذكورة في الخطوة 2-1، القيام بحقنه داخل. مع انتعاش سريع ومفعول التخدير isoflurane المخدرة المفعول القصير الأمد، من الأسهل للتعامل مع الماوس وحقن التخدير داخل.
   1. استخدام حل 2.4 مل الكيتامين (10 في المائة) و 0.8 مل Xylazine (2%) 6.8 مل كلوريد الصوديوم (0.9%) للحقن داخل-
   2. وزن الحيوان قبل تطبيق مخدر.
      ملاحظة: صيغة المخدر:
      
   3. استخدام حقنه الأنسولين 1 مل مع 30 غ إبرة حقن الحل في أسفل البطن الأيسر.
   4. ضع الماوس في قفصة والانتظار لتأثير المخدرات-
      ملاحظة: يظهر تأثير المخدرات عادة ضمن 5 دقائق إذا تم الحقن بنجاح. يمكن تحديد العمق الصحيح للتخدير وغياب منعكس غطاء أو كرد فعل لقرصة أخمص القدمين، فضلا عن معدل التنفس العادية، الخاضعة للرقابة-

3. غرس مصفوفة مثل الغشاء

ملاحظة: يتم استخدام هذا الأسلوب من مجموعتنا لدراسة الأوعية الورم بعد حقن الوحيدات. اعتماداً على هذه التجارب، يمكن إضافة عوامل النمو إلى المصفوفة مثل الغشاء. ونحن إجراء ربط شريان فخذي قبل الحقن الورم في الجناح الماوس. المصفوفة يجب أن تكون درجة حرارة 4 درجة مئوية للحقن. في درجة الحرارة، وهذه المصفوفة هو السائل؛ الهلام يصلب إلى مادة صلبة في درجة حرارة الجسم (37 درجة مئوية). لرؤية أفضل لمصفوفة تحت الجلد المكونات، يحلق جلد الماوس في موقع الحقن.

ملاحظة: اختياري: إضافة 100 نانوغرام عامل النمو تنتجها الخلايا الليفية الأساسية و 300 نانوغرام الأوعية الدموية غشائي عامل النمو 26 وحدة دولية الهيبارين تحت ظروف معقمة للمصفوفة مثل الغشاء.

1. تحميل 1 مل مصفوفة إلى حقنه الأنسولين 30 جرام ومخزن على الجليد حتى استخدام.
2. وضع الحيوان على الطاولة وعقد جلد الماوس بجانب موقع الحقن في الجناح.
حقن
3. 500 ميليلتر من المصفوفة مثل الغشاء تحت الجلد.
   ملاحظة: لأسباب عملية، من الضروري إدخال مصفوفة مثل الغشاء متقاربة في مكان واحد لتجنب تشتت تحت الجلد. سوف يكون من الأسهل لإزاحة الورم الاصطناعي من الأنسجة بعد التضحية بالماوس في نهاية التجربة-

4. ذيل "حقن الوريد"

ملاحظة: ممارسة حقن الوريد الذيل مع محلول كلوريد الصوديوم في اختبار الحيوانات قبل التجريب. إذا لا يمكن حقن وحيدات على نحو كاف في السياق الذيل، لن يكون هناك لا تأثير المنهجية على الضمانات الاحتياطية. وفي هذا البروتوكول، ونحن حقن وحيدات 2.5 مليون. في محاولة لحقن لا يزيد عن 5 ميليلتر/غرام من وزن الجسم.

1. استخدام الحل الوحيدات أعدت في إطار خطوة 1.1.8 تحتوي على 2.5 مليون وحيدات.
2. استخدام إبرة 30 جرام وحقنه الأنسولين 1 مل للحقن-
3. بعناية التعامل مع الماوس، وكبح جماح هذا الحيوان في ريسترينير، وتأكد من الماوس هو لم يصب بأذى، ويحتوي على مساحة كافية للتنفس.
4. وضع في ريسترينير على لوحة تدفئة حتى الذيل ويمكن الاتصال باللوحة-
5. تحديد الأوردة الذيل، التي تقع على الجانب الوحشي من الذيل.
6. تشغيل ذيل 90 °، حيث يظهر السياق ذيل على الجانب العلوي من الذيل.
7. تطهير الجانب حقن قبل الحقن وحيدات.
8. محاولة لحقن الحل الوحيدات في زاوية مسطحة بشطبه الإبرة التي تواجه المكياج.
   ملاحظة: إيقاف الحقن إذا ظهر نفطة، هذا هو علامة حقن الفاشلة. محاولة هذا الإجراء مرة أخرى أكثر بروكسيمالي.
9. وقف النزيف في موقع الحقن بتطبيق ضغط لطيف على الذيل لحوالي 60s.
10. مراقبة الحيوانات لمدة 30 دقيقة لرصد الآثار الجانبية الجهازية ووضع الماوس في قفصة بعد الحيوان وتعافي تماما.

5. مجهر إينترافيتال

1. إعداد
   1. ضع الماوس أنيسثيتيزيد على لوحة تدفئة (37 درجة مئوية) للحفاظ على درجة حرارة ثابتة وإصلاح الكفوف في المكان مع شريط لاصق.
   2. تطهير الجلد في موقع المحطة أو الجناح الذي يتم استخدامه للفحص المجهري.
   3. حلق منطقة الاهتمام لمعالجة أفضل وتجنب التدخل في الشعر.
   4. المكوس الجلد بدون مشرط معقم والملقط الجميلة في منطقة مربعة من 0.5 × 0.5 سم.
      ملاحظة: من المهم أن تبقى منطقة الاهتمام رطبة؛ وبخلاف ذلك، سوف يتعرض للخطر نوعية الصور والأنسجة. يمكن استخدام محلول كلوريد الصوديوم لترطيب المنطقة.
   5. وضع ساقه بين طابعين قابل للتعديل ووضع تغطية زجاج على رأس هذه الطوابع.
   6. ضمان النسيج الرطب وهو على اتصال بالزجاج-
   اينج
   7. إلخ 50 ميليلتر والرودامين ديكستران خلف المقلة في نظام وريدي لرؤية أفضل للسفن-
   8. بدء تشغيل الفحص المجهري وضبط موضع الساق إذا لزم الأمر-
2. إعدادات الفحص المجهري إينترافيتال
   1. بدوره على المجهر، والكمبيوتر، والواجهات الإلكترونية، وأشعة الليزر-
   2. تشغيل وحدة تدفئة غرفة الحضانة و/أو التدفئة المرحلة (لوحة/لوحة)، وتعيين درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية.
   3. ابدأ شراء البرمجيات. إذا المجهر مجهز بماسح ضوئي رنانة، حدد هذا وضع المسح السريع-
   4. انتظر حتى تصل درجة الحرارة إلى مستوى ثابت (35-37 درجة مئوية)
      ملاحظة: درجة حرارة مستقرة مهم عن: (أ) الماوس، والتي لا يمكن التحكم في درجة حرارة الجسم، والانجراف المحورية (ب) تجنب أو التقليل إلى أدنى حد على الأقل تحت التخدير. يمكن أن يستغرق هذا ح 1 لعدة ساعات، تبعاً للظروف المحيطة بها (مثلاً، نظام تكييف الهواء والعدد من مصادر الحرارة في الغرفة، بما في ذلك الشعب). إذا استخدمت الأهداف الغمر، منطقة الاتصال بين العدسة وتغطية الزجاج (أو الأنسجة) مصدر عدم استقرار نموذجية. قد يساعد في تدفئة العدسة مع سخان موضوعية؛ وبدلاً من ذلك، ينصح مجهر مع نظام ضبط تلقائي.
   5. حدد عدسة تكبير مع فتحه الأرقام عالية التي يفي بمتطلبات القرار التجربة (انظر الملاحظة في نهاية هذا القسم)-
   6. تحسين إعدادات المجهر فيما يتعلق بكسب إعدادات قناة، سرعة المسح الضوئي، بكسل، حجم العمق، خطوة والحجم المتوسط قبل أن يضع الحيوان التجريبي في المرحلة-
   7. مسح bidirectionally لتقليل وقت الامتلاك.
   8. ضع الماوس أنيسثيتيزيد على المسرح مجهر بريوارميد بعد المجهر وصلت إلى أوضاع مستقرة وقد تم اختبار الإعدادات بمساعدة دمية.
   9. تجلب منطقة الاهتمام داخل المصفوفة مثل الغشاء في التركيز باستخدام إضاءة الضوء الساطع وتفتيشها بإيجاز الشعيرات الدموية بالأشعة فوق البنفسجية مع إعدادات عامل التصفية المناسبة ل fluorophores التطبيقية.
   10. قم بالتبديل إلى وضع؛ المسح بدء المسح الضوئي في وضع منخفض الدقة 256 × 256 وتعزيز المكاسب والليزر السلطة حتى يتم ملاحظة إشارة على الشاشة-
   11. التركيز على الهيكل للفائدة. تكبير حتى جميع تفاصيل مرئية.
   12. تعريف " ابدأ " و " نهاية " المواقف في اتجاه محوري.
   13. إيقاف المسح الضوئي-
   14. تحديد حجم التنقل (مثلاً، 0.5 ميكرومتر) وعدد الطائرات المحورية (مثلاً، 10-20)-
   15. التبديل إلى القرار النهائي بكسل (512 × 512 أو 1,024 x 1,024) تبعاً لسرعة نقل الهياكل سوبسيلولار أو الخلايا وحدد المسح السرعة (تردد المسح) الذي يناسب بشكل أفضل للحركات. مسح ثنائي الاتجاه المستحسن أن يثبت الحصول على مكدسات.
       ملاحظة: حدد أعلى معدل المسح الضوئي المسح الضوئي الذي يعطي جودة الصورة كافية. الماسحات الضوئية نقطة نموذجية توفر سرعات بين 400 هرتز و 1.4 كيلو هرتز. الماسحات الضوئية الرنانة توفير إضافية 8 كيلو هرتز أو 12 كيلو هرتز. يمكن بتقليل عدد الأسطر في الاتجاه-ص، زيادة معدل المسح كذلك (القيم النموذجية 512 × 512 أو 256 512 × 512 × 200 بكسل). اعتماداً على نسبة الإشارة إلى الضجيج، واحد يمكن محاولة تحسين جودة الصورة عن طريق إضافة خط متوسط بين 2 و 4. بشكل عام، إعداد 512 × 200 مع أية نتائج المتوسط في اكتساب وقت/إطار من 18 مرض التصلب العصبي المتعدد في وضع ثنائية الاتجاه مع الماسح ضوئي مدوية 8 كيلوهرتز؛ 512 × 200 و 4 × المتوسط، فإنه يبطئ وصولاً إلى 56 مرض التصلب العصبي المتعدد لكل إطار.

النتائج

يمكن أن يساعد الفحص المجهري إينترافيتال لفحص الأورام والنمو السفينة الجانبية الناجمة عن وحيدات تكشف عن جوانب جديدة في الآليات الجزيئية لورم الأوعية وأرتيريوجينيسيس. يجب أن يكون مستعدا الخلايا وحقنها بعناية باستخدام خطوات البروتوكول. الاختلافات يمكن أن تؤدي إلى اختلاف...

Discussion

الأسلوب الموصوفة هنا يلقي الضوء على وضع الشرايين الجانبية، سلوك وحيدات في هذه السفن، وعملية أرتيريوجينيسيس. الخطوات اللازمة لتطبيق هذا البروتوكول سهلة التعلم ويمكن استخدامها في مجالات أخرى من العلوم. وعلى الرغم من هذه المزايا، هناك بعض العيوب. على سبيل المثال، مطلوب معدات مجهرية لتنفيذ ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% fetal calf serum (FCS)	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
1% penicillin/streptomycin	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
1mL Omnifix -F insuline syringe	B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany
50 ml syringe	Fresenius Kabi AG, Bad Homburg, Germany		Injectomat- syringe 50 ml with canule
6-well-ultra-low-attachement-plates	Corning Incorporated, NY, USA
8- 12 week old, male, C57BL/6, BalbC mice	Charles River, Sulzfeld, Germany
Adhesive tape	TESA SE, Hamburg, Germany
Acquisition Software	Leica, Wetzlar, Deutschland		Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF); Version: 2.7.3.9723
Canules	B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany		29G, 30G
Cell culture dish	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany
Cell culture medium	Manufactured by our group with single components		Medium199, 10% Fetal calf serum, 1% Antibiotic (penicillin/streptomycin)
Centrifuge	Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany		Allegra X-15R centrifuge
Depilatory cream	Veet, Mannheim, Germany
DiO	Invitrogen Eugene, Oregon, USA
Disinfection agent	Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany
Disposable scalpel No.10	Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan
EDTA	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Erlenmeyer flask	GVB, Herzogenrath, Germany
Ethanol 70%	Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany
Fetal Calf Serum	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Fine Forceps	Rubis, Stabio, Switzerland
Flurophor/Rhodamindextran	Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA	Katalognummer: D-1819
Gloves	Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany
Heating pad	Labotect GmbH, Göttingen, Germany		Hot Plate 062
Human macrophage-colony stimulating factor	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany	SRP3110
Humane leucocyte filters	Blood preservation
Incubator	Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany
Isoflurane	Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany
Ketamine (10%)	Ketavet, Pfizer Deutschland GmbH, Berlin , Germany
Leukocyte separation tubes (tubes with filter)	Bio one GmbH, Frickenhausen, Germany
Light microscope	Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany		Axiovert 40 C
Lymphocyte separation medium LSM1077	GE Healthcare, Pasching, Austria
Matrigel	Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA
Medium M199	PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria
Microbiological work bench	Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany		Hera safe
Microscope slide	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	Art. Nr. 1879
Microscope stand with incubator and heating unit	Leica DMI 6000, Pecon, Germany
Monocyte wash buffer	Manufactured by our group with single components		PBS, 0,5% BSA, 2mM EDTA
Mouse restrainer	Various
Multi-photon microscope	Leica, Wetzlar, Deutschland		Leica SP5 Confocal microscope, Cameleon, Coherent
NaCl (0,9%)	Berlin Chemie AG, Berlin, Germany
Neubauer counting chamber	Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany
Objective	Leica, Wetzlar, Deutschland		Leica HC PL APO 10x/0.4 CS
PBS	Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany		ph 7,4 sterile
Penicillin/Streptomycin	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Percoll	Manufactured by our group with single components		90 % Percoll, 10% 1,5M NaCl, ρ= 1,064 g cm-3
Percoll solution	GE Healthcare, Bio-Science AB, Uppsala, Sweden
Pipettes	Eppendorf AG, Hamburg, Germany		10µL/100µL/200µL/1000µL
Pipettes serological	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		Cellstar2ml, 5ml, 10ml
Pipetting heads	Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Pipetus	Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Polystyrol tube	Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany
Scissor	Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA
Scale	Mettler PM4800 Delta Range, Mettler-Toledo GmbH, Gießen, Germany
Suction unit	Integra bioscience, Fernwald, Germany		Vacusafe comfort
Surgical scissors	Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA
Trypan blue solution 0,4 %	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Tubes with cap	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		15ml, 50ml Cellstar
Xylazine (2 %)	Ceva Tiergesundheit GmbH, Düsseldorf, Germany