Microscopia intravital de monócitos Homing e angiogênese relacionados ao Tumor em um modelo murino de Doença Arterial periférica

Resumo

Os monócitos são importantes mediadores de arteriogenesis no contexto da doença arterial periférica. Usando uma membrana basal, como matriz e microscopia intravital, este protocolo investiga monócito homing e relacionados ao tumor angiogênese após injeção de monócitos no modelo murino de ligadura de artéria femoral.

Resumo

O objetivo terapêutico para a doença arterial periférica e doença isquêmica do coração é aumentar o fluxo sanguíneo em áreas isquêmicas causada por estenose hemodinâmica. Cirurgia vascular é uma opção viável em casos selecionados, mas para os pacientes sem indicações para cirurgia como progressão descansar a dor, isquémia crítica dos membros ou grandes perturbações à vida ou trabalho, há poucas possibilidades de mitigação de sua doença. Terapia celular através de perfusão monócito aprimorado através da estimulação da formação de colaterais é uma das algumas opções não-invasiva.

Nosso grupo examina arteriogenesis após transplante de monócitos em camundongos, usando o modelo de isquemia do membro posterior. Anteriormente, temos demonstrado melhora na perfusão do membro posterior usando o transplante de monócitos syngeneic tétano-estimulado. Além dos efeitos sobre a formação de colaterais, o crescimento do tumor poderá ser afectado por esta terapia também. Para investigar esses efeitos, utilizamos um modelo do rato de membrana basal, como matriz injetando a matriz extracelular do sarcoma Engelbreth-Holm-enxame no flanco do mouse, após a oclusão da artéria femoral.

Após os estudos de tumor artificial, usamos a microscopia intravital para estudar na vivo -vasculogênese e monócitos orientação dentro das artérias colaterais. Estudos anteriores descreveram o exame histológico de modelos animais, o que pressupõe análise subsequente para post-mortem artefatos. Nossa abordagem visualiza hospedagens de monócitos para áreas de collateralization em sequências de tempo real, é fácil de executar e investiga o processo de arteriogenesis e tumor angiogênese in vivo.

Introdução

Doenças cardiovasculares, incluindo doença coronariana ou doença arterial periférica, são as causas mais comuns de morte globalmente¹. Terapia celular é uma abordagem promissora para tratar a doença cardiovascular, especialmente para pessoas que não são capazes de se submeter a intervenções cirúrgicas. Há várias abordagens para usar células ou as suas substâncias secretadas como uma ferramenta terapêutica^2,3, com o objetivo geral de melhorar a perfusão e manter a função do tecido isquêmico e underperfused. Uma tentativa de atingir este objetivo é melhorar a arteriogenesis, o que aumenta o desenvolvimento das artérias colaterais. Os monócitos são um tipo de célula importante associado com collateralization. Nosso grupo centrou-se em Pesquisar os efeitos de monócitos em áreas de inflamação^4,5, em particular, usando o modelo de isquemia do membro posterior para induzir isquemia e inflamação subsequentes⁶. Os monócitos lar de áreas de inflamação e causam respostas sistêmicas complexas que levam ao desenvolvimento de collateralization⁷.

Com o uso da microscopia intravital, podemos estudar o comportamento dessas células na vivo e observar a orientação de monócitos injetados para as áreas de inflamação. A maioria dos estudos anteriores descrevem apenas post-mortem de análises, que possuem desvantagens, incluindo uma introdução de artefatos histológicos e um grande número de animais necessários para preparações. Com nossa abordagem, podemos investigar processos imunológicos e formação colateral através de viver de imagem em múltiplos pontos de tempo.

Além do desenvolvimento das artérias colaterais em áreas isquêmicas, monócitos também influenciam o crescimento do tumor. Para investigar estes processos, injetamos uma matriz de membrana basal, como extraído do sarcoma de rato Engelbreth-Holm-enxame, um tumor rico em proteínas de matriz extracelular⁸e analisar usando microscopia intravital. Esta matriz é usada para teste de tela moléculas para formação de rede de células endoteliais ou terapias contra o cancro através da inibição angiogênico; Neste caso, vamos avaliar o potencial angiogênico de tumor de monócitos para celular terapia^9,10,11.

O objectivo do presente protocolo é demonstrar uma maneira fácil e eficiente de estudar processos imunológicos causados por isquemia em um modelo in vivo . Podemos gerar um ambiente de teste mais realista em relação ao exame histológico do post-mortem o tecido muscular.

Protocolo

nosso estudo foi realizado com a permissão do estado de Saxônia-Anhalt, Landesverwaltungsamt Halle, de acordo com a seção 8 da lei alemã de proteção animal. (§ 8, n. º 1 da lei alemã de proteção animal de 18.05.2016 - BGBI. Eu s. 1206, 1313, § 31 de TierSchVersV de 13.08.2013).

Nota: para os experimentos aqui, 8 a 12 camundongos BALB/c machos de semana foram utilizados, e monócitos humanos de doadores de sangue foram utilizados para a visualização de monócitos através de microscopia intravital.

1. preparação da célula

Nota: para o isolamento de monócitos, por favor, veja nosso vídeo anterior publicado na JoVE para instruções: " isolamento e endovenosa injeção de murino medula óssea derivada Os monócitos " por Wagner et al. ⁴

Nota: quando trabalhar com as células de todas as etapas deve ser esterilizado para evitar a contaminação.

1. Coloracao celular com 3,3 '-perclorato de Dioctadecyloxacarbocyanine
   1. Ressuspender as células em meio de cultura livre de soro com uma densidade de 1 x 10 ⁶ células/mL.
      Nota: Apenas meio livre de soro permite uma coloração eficiente, uma vez que o corante lipofílico já caso contrário iria ser capturado pelos componentes lipofílicos do soro.
   2. Adicionar 5 µ l de 1mm 3,3 '-Dioctadecyloxacarbocyanine perclorato em dimetilformamida a 1 mL de suspensão de célula e ressuspender cuidadosamente.
   3. Incubar a solução de célula a 37 ° C por 20 min.
   4. Centrifugar as células a 37 ° C e 500 x g, durante 5 min.
   5. Desalojar o sobrenadante e ressuspender as células com o meio de soro suplementado quente vitela fetal 37 ° C.
   6. Repetir as etapas 1.1.4 e 1.1.5 duas vezes.
   7. Contar as células com a fórmula:
      
   8. Ressuspender as células com 150 solução de NaCl 0,9% estéril µ l.
   9. Injetar as células a veia da cauda.

2. Anestesia

1. Anestesia por inalação
   1. vaporizar isoflurano com a ajuda de um vaporizador usando uma concentração de 5% em um escaninho fechado sob uma capa de segurança química.
   2. Cuidado com o mouse e colocá-lo para o lixo.
   3. Lidar com o animal pela pele do pescoço posterior, depois que parou de se mover.
2. Anestesia intraperitoneal
   Nota: anestesia de uso isoflurano, descrita no passo 2.1, para realizar uma injeção intraperitoneal. Com a recuperação rápida e de curta duração efeito narcótico da anestesia isoflurano, é mais fácil lidar com o mouse e injetar a anestesia intraperitoneal.
   1. Use uma solução de 2,4 mL cetamina (10%), 0,8 mL xilazina (2%) e 6,8 mL NaCl (0,9%) para a injeção intraperitoneal.
   2. Pesar o animal antes de aplicar o anestésico.
      Nota: A fórmula para o anestésico é:
      
   3. usar uma seringa de insulina 1 mL com agulha 30 G para injectar a solução para o baixo-ventre esquerdo.
   4. Coloque o mouse em sua gaiola e esperar pelo efeito narcótico.
      Nota: O efeito narcótico normalmente aparece dentro de 5 min se a injeção foi bem sucedida. A correta profundidade da anestesia pode ser determinada pela ausência de reflexo de tampa ou reação a pitada do dedo do pé, bem como uma taxa de respiração regular, controlada.

3. Implantação da membrana basal, como Matrix

Nota: Este método é usado pelo nosso grupo para estudar a angiogênese do tumor após a injeção de monócitos. Dependendo das experiências, fatores de crescimento pode ser adicionados à matriz da membrana basal-like. Realizamos a ligadura da artéria femoral antes de injetar o tumor no flanco do mouse. A matriz deve ter uma temperatura de 4 ° C para a injeção. A esta temperatura, a matriz é fluido; o gel endurece em um sólido à temperatura corporal (37 ° C). Para melhor visibilidade da matriz subcutânea plug, raspar a pele do rato no local da injeção.

Nota: opcional: Adicione 100 ng fator de crescimento fibroblástico básico, 300 ng vascular fator de crescimento endotelial e 26 UI heparina sob condições estéreis para a matriz de membrana basal-like.

1. Carregar 1 mL de matriz em uma seringa de insulina 30g e loja no gelo até o uso.
2. Colocar o animal na mesa e mantenha a pele do rato ao lado do local da injeção, no flanco.
3. 500 µ l da membrana basal, como matriz de injectar por via subcutânea.
   Nota: Por razões práticas, é necessário injetar a membrana basal, como matriz compacta em um único local para evitar dispersão subcutâneo. Será mais fácil desalojar o artificial tumor do tecido após sacrificar o mouse no final do experimento.

4. Injeção da veia da cauda

Nota: praticar a injeção de veia de cauda com solução de NaCl em animais de teste antes de experimentação. Se os monócitos não podem adequadamente ser injetados na veia do rabo, não haverá nenhum efeito sistêmico sobre o collateralization. Neste protocolo, injetamos monócitos 2,5 milhões. Tentar injetar não mais do que 5 µ l/g de peso corporal.

1. Use a solução de monócitos preparada sob passo 1.1.8 contendo 2,5 milhões monócitos.
2. Usar uma agulha de 30g e uma seringa de insulina 1 mL para a injeção.
3. Cuidadosamente lidar com o mouse, conter o animal a retenção e verifique se o mouse não é prejudicado e tem espaço adequado para a respiração.
4. Fazer a retenção sobre a almofada de aquecimento para que a cauda pode entrar em contato com a placa.
5. Identificar as veias de cauda, que estão localizadas no lado lateral da cauda.
6. Fugissem a 90 °, então a veia da cauda aparece na parte superior da cauda.
7. Desinfectar o lado de injeção antes de injetar os monócitos.
8. Tentar injectar a solução de monócitos em um ângulo plana com o bisel da agulha virado para cima
   Nota: Pare a injeção se aparecer uma bolha, como este é um sinal de uma injeção de falha. Tente o procedimento novamente mais proximalmente.
9. Parar o sangramento no local da injeção, aplicando uma pressão suave na cauda para cerca de 60 anos.
10. Observar o animal durante 30 min monitorar para efeitos colaterais sistêmicos e posicione o mouse em sua jaula, depois que o animal se recuperou totalmente.

5. A microscopia intravital

1. preparação
   1. Coloque o mouse anestesiado sobre a almofada de aquecimento (37 ° C) para manter uma temperatura constante e corrigir as patas no lugar com fita adesiva.
   2. Desinfectar a pele no local da perna ou flanco que é usado para a microscopia.
   3. Raspar a região de interesse para melhor manuseio e para evitar a interferência com cabelo.
   4. Excisar a pele com um bisturi estéril e pinça fina em uma área quadrada de 0,5 x 0,5 cm.
      Nota: É importante manter a região de interesse húmidas; caso contrário, a qualidade das imagens e tecido ficará comprometida. Solução de NaCl pode ser usada para umedecer a área.
   5. Coloque a perna entre dois selos ajustáveis e coloque um vidro de tampa em cima os selos.
   6. Garantir que o tecido é molhado e está em contacto com o vidro.
   7. Inject 50 µ l rodamina dextrano retrobulbar no sistema venoso para melhor visibilidade dos vasos.
   8. Começar a microscopia e ajuste a posição da perna, se necessário.
2. Configurações de microscopia intravital
   1. ligar o microscópio, computador, interfaces eletrônicas e lasers.
   2. Ligar a unidade de aquecimento da câmara de incubação e/ou aquecimento fase (placa/almofada) e definir a temperatura a 37 ° C.
   3. Iniciar o software de aquisição. Se o microscópio é equipado com um scanner de ressonância, selecione esse modo de digitalização rápido.
   4. Esperar até que a temperatura atinja um nível constante (35-37 ° C)
      Nota: Uma temperatura estável é importante para: (a) o mouse, o que sob anestesia não pode controlar sua temperatura corporal e (b) evitar ou pelo menos minimizando deriva focal. Isto pode demorar 1h para várias horas, dependendo das condições do ambiente (por exemplo, sistema de ar condicionado e o número de fontes de calor na sala, incluindo as pessoas). Se os objectivos de imersão são usados, zona de contato entre a lente e tampa de vidro (ou tecido) é uma fonte típica de instabilidade. Aquecimento a lente com um aquecedor objetivo pode ajudar; Alternativamente, um microscópio com um sistema de autofoco é altamente recomendado.
   5. Selecionar uma lente de ampliação com uma alta abertura numeral que preenche os requisitos da resolução do experimento (ver nota no final desta seção).
   6. Otimizar as configurações de microscópio em relação ao ganho, ajustes da canaleta, velocidade de digitalização, pixels de resolução, profundidade volume, tamanho de etapa e em média antes de colocar o animal experimental no palco.
   7. Scan bidirecionalmente para reduzir o tempo de aquisição.
   8. Coloque o mouse anestesiado no palco escaldadas microscópio após o microscópio atingiu condições estáveis e as configurações foram testadas com a ajuda de um boneco.
   9. Trazer a região de interesse dentro da matriz da membrana basal, como em foco usando iluminação luz brilhante e inspecionar brevemente os capilares por luz ultravioleta com configurações de filtro adequado para o fluorophores aplicada.
   10. Alternar para digitalização modo; iniciar a digitalização no modo de baixa resolução de 256 x 256 e aumentar o ganho e poder do laser até um sinal é observado no monitor.
   11. Foco na estrutura de interesse. Zoom até que todos os detalhes são visíveis.
   12. Define " começar a " e " final " posições na direção axial.
   13. Parar a varredura.
   14. Definir piso tamanho (por exemplo, 0,5 µm) e o número de aviões focais (por exemplo, 10-20).
   15. Interruptor para a resolução de pixel final (512 x 512 ou 1.024 x 1.024) dependendo da velocidade do movimento estruturas subcelulares ou células e selecione o scan velocidade (frequência de varredura) que se encaixa melhor aos movimentos. Bidirecional de digitalização é recomendada para fixar a aquisição de pilhas.
       Nota: Selecione a maior taxa de varredura de digitalização que oferece qualidade de imagem suficiente. Verificadores de ponto típico oferecem velocidades entre 400 Hz e 1,4 kHz. Scanners de ressonância fornecem um adicional de 8 kHz ou 12 kHz. Reduzindo o número de linhas na direção y, a taxa de varredura pode ser aumentada (valores típicos são 512 x 512, 512 x 256 ou 512 x 200 pixels de resolução). Dependendo da relação sinal-ruído, um pode tentar melhorar a qualidade de imagem, adicionando a linha média entre 2 e 4. Normalmente, uma configuração de 512 x 200, com uma média de não resulta em um tempo de aquisição/quadro de 18 ms no modo bidirecional com um scanner de ressonância de 8 KHz; com 512 x 200 e 4 x em média, retarda para baixo para 56 ms por quadro.

Resultados

A microscopia intravital para o exame do tumor e o crescimento de vasos colaterais desencadeada por monócitos pode ajudar a revelar novos aspectos nos mecanismos moleculares de vasculogênese e arteriogenesis. As células devem ser preparadas e injetado cuidadosamente usando as etapas do protocolo. Diferenças podem levar a variações entre experiências simples. Os monócitos devem ser injetados no sistema venoso (Figura 1) para manter efeitos sistêmicos ...

Discussão

O método descrito aqui lança luz sobre o desenvolvimento das artérias colaterais, o comportamento de monócitos destes vasos e o processo de arteriogenesis. As etapas de aplicação do presente protocolo são fáceis de aprender e pode ser usado em outros campos da ciência. Apesar dessas vantagens, existem algumas desvantagens. Por exemplo, equipamento microscópico é necessário para executar as técnicas descritas. Obtenção de equipamento para um experimento é insustentável, por isso é importante colaborar co...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% fetal calf serum (FCS)	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
1% penicillin/streptomycin	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
1mL Omnifix -F insuline syringe	B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany
50 ml syringe	Fresenius Kabi AG, Bad Homburg, Germany		Injectomat- syringe 50 ml with canule
6-well-ultra-low-attachement-plates	Corning Incorporated, NY, USA
8- 12 week old, male, C57BL/6, BalbC mice	Charles River, Sulzfeld, Germany
Adhesive tape	TESA SE, Hamburg, Germany
Acquisition Software	Leica, Wetzlar, Deutschland		Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF); Version: 2.7.3.9723
Canules	B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany		29G, 30G
Cell culture dish	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany
Cell culture medium	Manufactured by our group with single components		Medium199, 10% Fetal calf serum, 1% Antibiotic (penicillin/streptomycin)
Centrifuge	Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany		Allegra X-15R centrifuge
Depilatory cream	Veet, Mannheim, Germany
DiO	Invitrogen Eugene, Oregon, USA
Disinfection agent	Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany
Disposable scalpel No.10	Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan
EDTA	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Erlenmeyer flask	GVB, Herzogenrath, Germany
Ethanol 70%	Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany
Fetal Calf Serum	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Fine Forceps	Rubis, Stabio, Switzerland
Flurophor/Rhodamindextran	Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA	Katalognummer: D-1819
Gloves	Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany
Heating pad	Labotect GmbH, Göttingen, Germany		Hot Plate 062
Human macrophage-colony stimulating factor	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany	SRP3110
Humane leucocyte filters	Blood preservation
Incubator	Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany
Isoflurane	Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany
Ketamine (10%)	Ketavet, Pfizer Deutschland GmbH, Berlin , Germany
Leukocyte separation tubes (tubes with filter)	Bio one GmbH, Frickenhausen, Germany
Light microscope	Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany		Axiovert 40 C
Lymphocyte separation medium LSM1077	GE Healthcare, Pasching, Austria
Matrigel	Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA
Medium M199	PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria
Microbiological work bench	Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany		Hera safe
Microscope slide	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	Art. Nr. 1879
Microscope stand with incubator and heating unit	Leica DMI 6000, Pecon, Germany
Monocyte wash buffer	Manufactured by our group with single components		PBS, 0,5% BSA, 2mM EDTA
Mouse restrainer	Various
Multi-photon microscope	Leica, Wetzlar, Deutschland		Leica SP5 Confocal microscope, Cameleon, Coherent
NaCl (0,9%)	Berlin Chemie AG, Berlin, Germany
Neubauer counting chamber	Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany
Objective	Leica, Wetzlar, Deutschland		Leica HC PL APO 10x/0.4 CS
PBS	Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany		ph 7,4 sterile
Penicillin/Streptomycin	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Percoll	Manufactured by our group with single components		90 % Percoll, 10% 1,5M NaCl, ρ= 1,064 g cm-3
Percoll solution	GE Healthcare, Bio-Science AB, Uppsala, Sweden
Pipettes	Eppendorf AG, Hamburg, Germany		10µL/100µL/200µL/1000µL
Pipettes serological	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		Cellstar2ml, 5ml, 10ml
Pipetting heads	Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Pipetus	Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Polystyrol tube	Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany
Scissor	Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA
Scale	Mettler PM4800 Delta Range, Mettler-Toledo GmbH, Gießen, Germany
Suction unit	Integra bioscience, Fernwald, Germany		Vacusafe comfort
Surgical scissors	Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA
Trypan blue solution 0,4 %	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Tubes with cap	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		15ml, 50ml Cellstar
Xylazine (2 %)	Ceva Tiergesundheit GmbH, Düsseldorf, Germany