Прижизненной микроскопии Моноцит самонаведения и связанных с опухоли ангиогенеза в мышиных модели болезнь периферических артерий

Резюме

Моноциты являются важными посредниками arteriogenesis в контексте болезнь периферических артерий. С помощью базальной мембраны как матрица и прижизненной микроскопии, этот протокол расследует Моноцит самонаведения и связанных с ними опухоли ангиогенеза после инъекции Моноцит в бедренной артерии лигирование мышиных модели.

Аннотация

Терапевтические цель для периферической артериальной болезни и ишемической болезни сердца является увеличить приток крови к ишемической районах, вызванные гемодинамики стенозом. Сосудистая хирургия является жизнеспособным вариантом в отдельных случаях, но для пациентов без показания для операции, такие как прогрессии для отдыха боль, ишемии нижних конечностей или крупных срывов для жизни и работы, существует несколько возможностей для смягчения их болезни. Клеточная терапия через Моноцит повышенной перфузии путем стимулирования обеспечения формирования является одним из нескольких неинвазивные вариантов.

Наша группа рассматривает arteriogenesis после трансплантации Моноцит в мышей, с использованием модели ишемии задних конечностей. Ранее мы продемонстрировали улучшение перфузии задних конечностей с использованием столбняка стимулирует сингенных Моноцит трансплантации. Помимо последствий для обеспечения формирования роста опухоли могут быть затронуты этой терапии. Расследовать эти эффекты, мы используем базальной мембраны как матричная модель мыши путем впрыскивать внеклеточного матрикса саркомы Engelbreth-холм-Рой в бочку мыши, после окклюзии бедренной артерии.

После исследования искусственных опухоли мы используем прижизненной микроскопии для изучения в vivo опухоли ангиогенеза и Моноцит самонаведения в залог артерий. Предыдущие исследования описал гистологическом Животные модели, которая предполагает последующий анализ в посмертный артефактов. Наш подход визуализирует Моноцит самонаведения районы обеспечение в режиме реального времени последовательностей, легко выполнить и исследует процесс arteriogenesis и опухоли ангиогенеза в естественных условиях.

Введение

Сердечно-сосудистые заболевания, в том числе ишемической болезни сердца или болезнь периферических артерий, являются наиболее распространенными причинами смерти во всем мире¹. Клеточная терапия-это перспективный подход для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, особенно для людей, которые не могут пройти хирургических вмешательств. Существует несколько подходов для использования ячеек или их выделяется веществ как терапевтическое средство^2,3, с учетом общей цели улучшения перфузии и поддерживать функции ишемического и underperfused ткани. Одна попытка достичь этой цели – улучшить arteriogenesis, который стимулирует развитие залога артерий. Моноциты являются важным ячейки тип, связанный с обеспечение. Наша группа была сосредоточена на изучение последствий моноцитов в области воспаления^4,5, в частности с помощью модели ишемии задних конечностей вызывают ишемию и последующего воспаление⁶. Моноциты дома в области воспаления и вызвать сложные системные ответы, которые приводят к развитию обеспечение⁷.

С использованием прижизненной микроскопии мы можем изучить поведение этих клеток в естественных условиях и наблюдать самонаведения вводят моноцитов в области воспаления. Большинство бывших исследования только описывают посмертное анализов, которые держат недостатки, включая введение гистологические артефакты и большое количество животных, необходимых для подготовки. С нашим подходом мы можем исследовать иммунологических процессов и обеспечения формирования через жить изображений в нескольких точках времени.

Помимо разработки сопутствующего артерий в ишемических зонах моноцитов также влияют на рост опухоли. Для расследования этих процессов, мы придать базальной мембраны как матрица, извлеченные из Engelbreth-холм-Рой мыши саркомы, опухоли богаты белков внеклеточного матрикса⁸и анализировать с помощью прижизненной микроскопии. Эта матрица используется для экрана теста молекул для формирования сети эндотелиальных клеток или противораковых терапий путем ингибирования ангиогенных; в этом случае мы будем оценивать потенциал ангиогенных опухоли моноцитов клетки терапии^9,10,11.

Цель настоящего Протокола заключается в демонстрации простой и эффективный способ изучения иммунологических процессов, вызванных ишемии в модели в естественных условиях . Мы можем создавать более реалистичные тестовой среде по сравнению с гистологическим реакционной посмертное мышечной ткани.

протокол

наше исследование проводилось с разрешения государства, Landesverwaltungsamt Галле, Саксония-Анхальт согласно разделу 8 немецкого закона о защите животных. (§ 8, пункте 1 немецкого права для защиты животных от 18.05.2016 - BGBI. I S. 1206, 1313, § 31 TierSchVersV от 13.08.2013).

Примечание: для экспериментов здесь, были использованы 8-12 недельных самцов мышей BALB/c, и человека моноцитов крови доноров были использованы для визуализации моноциты через прижизненной микроскопии.

1. Подготовка клетки

Примечание: для изоляции моноцитов, смотрите наши предыдущие опубликованных видео на JoVE инструкции: " изоляции и внутривенных инъекций мышиных производные костного мозга Моноциты ", Вагнер и др. ⁴

Примечание: при работе с клетками все шаги должны быть стерильные, чтобы избежать загрязнения.

1. Окрашивания клеток с 3,3 '-перхлорат Dioctadecyloxacarbocyanine
   1. Ресуспензируйте клеток в сыворотке крови бесплатно питательной среды с плотностью 1 х 10 ⁶ клеток/мл.
      Примечание: Только сыворотка бесплатно среднего позволяет эффективно окрашивание, поскольку липофильных краситель бы в противном случае уже захвачен липофильных компонентов сыворотки.
   2. Добавить 5 мкл 1 мм 3,3 '-Dioctadecyloxacarbocyanine перхлората в диметилформамиде до 1 мл суспензии клеток и Ресуспензируйте тщательно.
   3. Инкубировать решение клеток при 37 ° C 20 мин
   4. Центрифуга клетки при 37 ° C и 500 g x 5 мин
   5. Выбить супернатант и Ресуспензируйте клетки с 37 ° C теплой плода теленка сыворотки дополнены среднего.
   6. Дважды повторить шаги 1.1.4 и 1.1.5.
   7. Подсчитать ячейки с формулой:
      
   8. Ресуспензируйте клетки с 150 мкл стерильного 0,9% раствор NaCl.
   9. Вставки ячейки в Вену хвост.

2. Анестезия

1. Ингаляционной анестезии
   1. изофлюрановая с помощью испарителем, используя 5% концентрации в закрытых бен под капотом химической безопасности испаряться.
   2. Осторожно мышь и положил его в мусорное ведро.
   3. Обрабатывать животного кожу задняя шеи после того, как она перестала двигаться.
2. Внутрибрюшинного анестезии
   Примечание: использование изофлюрановая анестезии, описанные в разделе Шаг 2.1, для выполнения внутрибрюшинной инъекции. С быстрого восстановления и короткого действия наркотического эффекта изофлюрановая анестезии это проще для обработки мыши и придать внутрибрюшинного анестезии.
   1. Использовать раствор 2.4 кетамин (10%), 0,8 мл Ксилазина (2%) до 6,8 мл NaCl (0.9%) для внутрибрюшинной инъекции.
   2. Вес животного до применения анестезии.
      Примечание: Формула для анестезии является:
      
   3. использовать инсулин шприц 1 мл с иглой 30 G для вставки решение в левой подбрюшье.
   4. Место мыши в его клетке и ждать наркотического эффекта.
      Примечание: Наркотического эффекта обычно появляется в течение 5 мин, если инъекции был успешным. Правильной глубины анестезии может определяться отсутствие крышки рефлекс или реакция на мыс пинча, а также регулярные, контролируемых скорость дыхания.

3. Имплантация базальной мембраны как матрицы

Примечание: Этот метод используется нашей группой для изучения после инъекции Моноцит ангиогенез опухоли. В зависимости от экспериментов факторы роста могут добавляться к матрице базальной мембраны как. Мы исполняли бедренной артерии лигирование перед инъекцией опухоль на фланге мыши. Матрицы должны иметь температуре 4 ° C для инъекций. На этой температуре матрица является жидкость; гель затвердевает в тело при температуре тела (37 ° C). Для лучшей видимости подкожной матрицы вилка, брить кожу мыши в месте инъекции.

Примечание: необязательно: добавить 100 нг основные фибробластический фактор роста, 300 нг Сосудистый эндотелиальный фактор роста и 26 И.Ю гепарина в стерильных условиях к базальной мембраны как матрица.

1. Загрузить 1 мл матрицы в 30 G инсулина шприц и магазин на льду до использования.
2. Положите животное на стол и держать кожу мыши рядом с инъекции на фланге.
3. Придать 500 мкл базальной мембраны как матрицы подкожно.
   Примечание: По практическим соображениям необходимо придать базальной мембраны как матрица компактно в одном месте, чтобы избежать подкожной дисперсии. Это будет проще выбить искусственного опухоль из ткани после принесения в жертву мыши в конце эксперимента.

4. Хвост вен инъекций

Примечание: практика инъекции Вену хвост с раствором NaCl на подопытных животных до экспериментов. Если моноциты нельзя адекватно вводят в Вену хвост, будет существовать не системный эффект на обеспечение. В этом протоколе мы вводили 2,5 миллионов моноцитов. Попробуйте вводить не более чем 5 мкл/г веса.

1. Использовать решение Моноцит, подготовленный под шаг 1.1.8, содержащие 2,5 миллионов моноцитов.
2. Использовать иглой 30 G и шприц 1мл инсулин для инъекций.
3. Тщательно обрабатывают мыши, удержать животное в фиксатор и убедитесь, что мышь не повредило и имеет достаточное пространство для дыхания.
4. Поместить фиксатор на грелку, чтобы хвост можно связаться пластину.
5. Идентифицировать хвост вен, которые расположены на боковой стороне хвоста.
6. Превратить хвост 90 °, поэтому хвост вен появляется на верхней стороне хвоста.
7. Лечить стороне инъекции перед инъекцией моноцитов.
8. Пытаются придать Моноцит решение в плоский угол с скос иглы перед макияж
   Примечание: Остановите инъекции, если появляется волдырь, поскольку это является признаком неудачных инъекций. Попытка снова процедура более проксимально.
9. Остановить кровотечение в месте инъекции, применяя мягкое давление на хвост для около 60-х.
10. Наблюдать животных для 30 мин для мониторинга системных побочных эффектов и поместите курсор мыши в своей клетке, после того, как животное полностью выздоровел.

5. Прижизненной микроскопии

1. Подготовка
   1. место наркотизированных мыши на грелку (37 ° C) для поддержания постоянной температуры и исправить лапы на месте с помощью скотча.
   2. Дезинфекции кожи в месте ноги или бочку, которая используется для микроскопии.
   3. Бритья региона интерес для лучшей управляемости и во избежание помех с волосами.
   4. Акциз кожу стерильным скальпель и тонкой щипцами в площадь 0,5 х 0,5 см.
      Примечание: Важно сохранить региона интерес влажной; в противном случае будут подорваны качество изображений и ткани. Раствор NaCl может использоваться для смочите области.
   5. Поместить ноги между двумя регулируемыми марок и положение покровным стеклом на вершине марки.
   6. Ткани мокрый и контактирует с стекло.
   7. InjECT 50 мкл родамин декстрана ретробульбарная в венозной системы для лучшей видимости судов.
   8. Начать микроскопии и отрегулировать положение ноги при необходимости.
2. Прижизненной микроскопии параметры
   1. включите Микроскоп, компьютеров, электронных интерфейсов и лазеров.
   2. Включения обогрева инкубационного палаты и/или Отопление этап (плита/pad) и установите температуру до 37 ° C.
   3. Начать приобретение программного обеспечения. Если микроскоп оснащен резонансный сканер, выберите этот быстрый режим сканирования.
   4. Ждать до тех пор, пока температура достигает постоянного уровня (35-37 ° C)
      Примечание: Стабильная температура имеет важное значение для: (a) мышь, которая под наркозом не может контролировать свою температуру тела и (b) избежать или по крайней мере минимизировать фокуса дрейфа. Это может занять 1 h до нескольких часов, в зависимости от окружающих условий (например, системы кондиционирования воздуха и количество источников тепла в комнате, в том числе людей). Если используются цели погружения, контактной зоны между объективом и Стекло покровное (или ткани) является типичным источником нестабильности. Отопление объектив с объективной нагреватель может помочь; Кроме того, настоятельно рекомендуется микроскопа с системой автофокусировки.
   5. Выберите увеличение объектива с высокой цифрой диафрагмы, которая отвечает требованиям резолюции эксперимента (см. Примечание в конце этого раздела).
   6. Оптимизировать параметры микроскопа относительно усиления, настройки каналов, скорость сканирования, пикселей, глубина объем, размер шага и усреднения до размещения экспериментальных животных на сцене.
   7. Сканирования двунаправленно уменьшить время аэросъёмки.
   8. Место наркотизированных мышь на подогретую микроскопа, после того, как Микроскоп достиг стабильных условий и параметров были протестированы с помощью манекена.
   9. Принести региона интерес в матрице базальной мембраны как в фокус с помощью яркого света освещения и инспектировать кратко капилляров ультрафиолетового света с надлежащей фильтрации параметров для прикладной флуорофоров.
   10. Переключиться на режим; сканирования начать сканирование в режиме низкого разрешения 256 x 256 и повысить прибыль и мощность лазера до тех пор, пока сигнал наблюдается на мониторе.
   11. Внимание на структуре интерес. Увеличение до тех пор, пока все детали видны.
   12. Определить " начать " и " конец " позиции в осевом направлении.
   13. Остановить сканирование.
   14. Определить степпинг размер (например, 0,5 мкм) и количество фокальной плоскости (например, 10-20).
   15. Переключатель для окончательного пикселей резолюции (512 x 512 или 1024 x 1024) в зависимости от скорости движущихся внутриклеточных структур или клеток и выберите Проверка скорость (частота сканирования), который подходит лучше для движений. Двунаправленного сканирования рекомендуется ускорить приобретение стеков.
       Примечание: Выберите самый высокий показатель сканирования сканирования, что дает достаточное качество изображения. Типичные точки сканеры обеспечивают скорости между 400 Гц и 1.4 кГц. Резонансные сканеры обеспечивают дополнительный 8 кГц или 12 кГц. Уменьшая количество линий в y направлении, можно увеличить скорость сканирования (типичные значения — 512 x 512, 512 x 256 или 512 x 200 пикселей резолюции). В зависимости от соотношения сигнал шум можно попытаться улучшить качество изображения путем добавления строки в среднем между 2 и 4. Как правило параметр 512 x 200 без усреднения результатов в приобретение/сроки 18 ms в двунаправленном режиме с 8 кГц резонансный сканер; с 512 x 200 и 4 x усреднения, он замедляет вплоть до 56 ms за кадр.

Результаты

Прижизненной микроскопии для изучения опухоли и залога судов роста, вызванного моноцитов может помочь выявить новые аспекты в молекулярных механизмах по ангиогенез опухоли и arteriogenesis. Клетки должны быть подготовлены и вводили, тщательно с использованием действия про...

Обсуждение

Метод, описанный здесь проливает свет на развитие залога артерий, поведение моноцитов в этих судов и процесс arteriogenesis. Шаги для применения этого протокола, легко учиться и может использоваться в других областях науки. Несмотря на эти преимущества есть некоторые недостатки. К примеру мик...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% fetal calf serum (FCS)	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
1% penicillin/streptomycin	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
1mL Omnifix -F insuline syringe	B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany
50 ml syringe	Fresenius Kabi AG, Bad Homburg, Germany		Injectomat- syringe 50 ml with canule
6-well-ultra-low-attachement-plates	Corning Incorporated, NY, USA
8- 12 week old, male, C57BL/6, BalbC mice	Charles River, Sulzfeld, Germany
Adhesive tape	TESA SE, Hamburg, Germany
Acquisition Software	Leica, Wetzlar, Deutschland		Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF); Version: 2.7.3.9723
Canules	B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany		29G, 30G
Cell culture dish	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany
Cell culture medium	Manufactured by our group with single components		Medium199, 10% Fetal calf serum, 1% Antibiotic (penicillin/streptomycin)
Centrifuge	Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany		Allegra X-15R centrifuge
Depilatory cream	Veet, Mannheim, Germany
DiO	Invitrogen Eugene, Oregon, USA
Disinfection agent	Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany
Disposable scalpel No.10	Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan
EDTA	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Erlenmeyer flask	GVB, Herzogenrath, Germany
Ethanol 70%	Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany
Fetal Calf Serum	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Fine Forceps	Rubis, Stabio, Switzerland
Flurophor/Rhodamindextran	Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA	Katalognummer: D-1819
Gloves	Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany
Heating pad	Labotect GmbH, Göttingen, Germany		Hot Plate 062
Human macrophage-colony stimulating factor	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany	SRP3110
Humane leucocyte filters	Blood preservation
Incubator	Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany
Isoflurane	Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany
Ketamine (10%)	Ketavet, Pfizer Deutschland GmbH, Berlin , Germany
Leukocyte separation tubes (tubes with filter)	Bio one GmbH, Frickenhausen, Germany
Light microscope	Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany		Axiovert 40 C
Lymphocyte separation medium LSM1077	GE Healthcare, Pasching, Austria
Matrigel	Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA
Medium M199	PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria
Microbiological work bench	Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany		Hera safe
Microscope slide	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	Art. Nr. 1879
Microscope stand with incubator and heating unit	Leica DMI 6000, Pecon, Germany
Monocyte wash buffer	Manufactured by our group with single components		PBS, 0,5% BSA, 2mM EDTA
Mouse restrainer	Various
Multi-photon microscope	Leica, Wetzlar, Deutschland		Leica SP5 Confocal microscope, Cameleon, Coherent
NaCl (0,9%)	Berlin Chemie AG, Berlin, Germany
Neubauer counting chamber	Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany
Objective	Leica, Wetzlar, Deutschland		Leica HC PL APO 10x/0.4 CS
PBS	Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany		ph 7,4 sterile
Penicillin/Streptomycin	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Percoll	Manufactured by our group with single components		90 % Percoll, 10% 1,5M NaCl, ρ= 1,064 g cm-3
Percoll solution	GE Healthcare, Bio-Science AB, Uppsala, Sweden
Pipettes	Eppendorf AG, Hamburg, Germany		10µL/100µL/200µL/1000µL
Pipettes serological	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		Cellstar2ml, 5ml, 10ml
Pipetting heads	Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Pipetus	Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Polystyrol tube	Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany
Scissor	Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA
Scale	Mettler PM4800 Delta Range, Mettler-Toledo GmbH, Gießen, Germany
Suction unit	Integra bioscience, Fernwald, Germany		Vacusafe comfort
Surgical scissors	Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA
Trypan blue solution 0,4 %	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Tubes with cap	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		15ml, 50ml Cellstar
Xylazine (2 %)	Ceva Tiergesundheit GmbH, Düsseldorf, Germany