Microscopia intravital del monocito Homing e l'angiogenesi tumore-relativa in un modello murino della malattia arteriosa periferica

Riepilogo

I monociti sono mediatori importanti di arteriogenesi nel contesto della malattia arteriosa periferica. Utilizzando una matrice del tipo di membrana basale e la microscopia intravital, questo protocollo indaga l'angiogenesi di homing e tumore-relativa del monocito dopo l'iniezione del monocito nel modello murino di legatura dell'arteria femorale.

Abstract

L'obiettivo terapeutico per la malattia arteriosa periferica e malattia cardiaca ischemica è quello di aumentare il flusso di sangue al aree ischemiche causata da stenosi emodinamica. Chirurgia vascolare è un'opzione praticabile in casi selezionati, ma per i pazienti senza indicazioni per la chirurgia come progressione di lavorare o riposare dolore, ischemia critica degli arti o gravi perturbazioni alla vita, ci sono poche possibilità per mitigare la loro malattia. Terapia cellulare tramite aspersione del monocito-aumentato attraverso la stimolazione della formazione collaterale è una delle poche opzioni non invasive.

Il nostro gruppo esamina arteriogenesi dopo trapianto del monocito in topi utilizzando il modello di ischemia del hindlimb. Precedentemente, abbiamo dimostrato miglioramento nell'arto posteriore aspersione mediante trapianto di tetano-stimolata syngeneic del monocito. Oltre agli effetti sulla formazione collaterale, la crescita del tumore potrebbe risentire anche questa terapia. Per studiare questi effetti, utilizziamo un modello di topo scantinato membrana-come matrice iniettando la matrice extracellulare del sarcoma Engelbreth-Holm-sciame nel fianco del mouse, dopo l'occlusione dell'arteria femorale.

Dopo gli studi di tumore artificiale, utilizziamo la microscopia intravital per studiare in vivo angiogenesi del tumore e del monocito homing all'interno delle arterie collaterali. Precedenti studi hanno descritto l'esame istologico dei modelli animali, che presuppone l'analisi successiva agli artefatti post mortem . Il nostro approccio Visualizza homing monocito al aree di collateralization in sequenze di tempo reale, è facile da eseguire e indaga il processo di angiogenesi del tumore e arteriogenesi in vivo.

Introduzione

Malattie cardiovascolari, tra cui malattia coronarica o malattia arteriosa periferica, sono le più comuni cause di morte a livello globale¹. La terapia cellulare è un promettente approccio per curare le malattie cardiovascolari, in particolare per le persone che non sono in grado di sottoporsi a interventi chirurgici. Ci sono diversi approcci per utilizzare cellule o loro sostanze secrete come strumento terapeutico^2,3, con l'obiettivo generale di migliorare la perfusione e mantenere la funzione del tessuto ischemico e underperfused. Un tentativo di raggiungere questo obiettivo è migliorare arteriogenesi, che favorisce lo sviluppo delle arterie collaterali. I monociti sono un tipo di cellula importante connesso con collateralization. Il nostro gruppo si è concentrata sulla ricerca degli effetti dei monociti nelle aree di infiammazione^4,5, in particolare utilizzando il modello di ischemia del hindlimb per indurre ischemia e conseguente infiammazione⁶. Monociti sede di aree di infiammazione e provocare risposte sistemiche complesse che portano allo sviluppo di collateralization⁷.

Con l'uso di microscopia intravital, possiamo studiare il comportamento di queste cellule in vivo e osservare l'homing dei monociti iniettati ad aree di infiammazione. Maggior parte degli studi ex descrivono solo post-mortem analisi, che tengono gli svantaggi tra cui l'introduzione di artefatti istologici e gran numero di animali necessari per le preparazioni. Con il nostro approccio, possiamo analizzare processi immunologici e formazione collaterale via live imaging più intervalli di tempo.

Oltre allo sviluppo delle arterie collaterali in aree ischemiche, monociti anche influenzano la crescita del tumore. Per studiare questi processi, abbiamo iniettare una matrice del tipo di membrana dello scantinato estratta dal sarcoma di topo Engelbreth-Holm-Swarm, un tumore ricco di matrice extracellulare proteine⁸e analizzare utilizzando la microscopia intravital. Questa matrice è utilizzata per molecole di screen test per formazione di rete delle cellule endoteliali o terapie anti-cancro attraverso inibizione angiogenica; in questo caso, si valuterà il potenziale di angiogenesi del tumore dei monociti per cella terapia^9,10,11.

L'obiettivo di questo protocollo è quello di dimostrare un modo facile ed efficiente per lo studio dei processi immunologici causati da ischemia in un modello in vivo . Possiamo generare un ambiente di test più realistico rispetto ad un workup istologico post-mortem del tessuto del muscolo.

Protocollo

il nostro studio è stato svolto con il permesso dello stato della Sassonia-Anhalt, Landesverwaltungsamt Halle, ai sensi dell'articolo 8 della legge tedesca per la protezione degli animali. (§ 8, comma 1 della legge tedesca per la protezione degli animali da 18.05.2016 - BGBl. I s. 1206, 1313, TierSchVersV § 31 da 13.08.2013).

Nota: per gli esperimenti qui, sono stati usati 8 a 12 topi BALB/c maschili a settimana vecchio e monociti umani da donatori di sangue sono stati utilizzati per la visualizzazione dei monociti tramite microscopia intravital.

1. preparazione delle cellule

Nota: per l'isolamento dei monociti, nostro precedente pubblicato un video su Giove per istruzioni, vedere: " isolamento e iniezione endovenosa di murino del midollo osseo derivato Monociti " di Wagner et al. ⁴

Nota: quando lavorano con le cellule di tutti i passaggi devono essere sterile per evitare la contaminazione.

1. Macchiatura delle cellule con 3,3 '-perclorato di Dioctadecyloxacarbocyanine
   1. risospendere le cellule in terreno di coltura libera del siero con una densità di 1 x 10 ⁶ cellule/mL.
      Nota: Solo mezzo libero del siero permette una colorazione efficiente, poiché il colorante lipofilico altrimenti sarebbe già essere catturato dai componenti lipofilici del siero.
   2. Aggiungere 5 µ l di 1 mM 3,3 '-Dioctadecyloxacarbocyanine perclorato in dimetilformammide a 1 mL di sospensione cellulare e Risospendere accuratamente.
   3. Incubare la soluzione di cella a 37 ° C per 20 min.
   4. Centrifugare le cellule a 37 ° C e 500 x g per 5 min.
   5. Sloggiare il supernatante e risospendere le cellule con il mezzo di 37 ° C caldo fetale di vitello siero completato.
   6. Ripetere due volte i passaggi 1.1.4 e 1.1.5.
   7. Contare le celle con la formula:
      
   8. risospendere le cellule con soluzione sterile 0,9% NaCl 150 µ l.
   9. Iniettare le cellule nella vena caudale.

2. Anestesia

1. Anestesia inalazione
   1. vaporizzare isoflurane con l'aiuto di un vaporizzatore usando una concentrazione del 5% in un contenitore chiuso sotto una cappa di sicurezza chimica.
   2. Gestire il mouse con attenzione e metterlo nel Cestino.
   3. Gestire l'animale dalla pelle del collo posteriore, dopo che ha smesso di muoversi.
2. Intraperitoneale anestesia
   Nota: anestesia di uso isoflurano, descritto al punto 2.1, per eseguire un'iniezione intraperitoneale. Con il recupero veloce e breve durata d'azione effetto narcotico dell'anestesia isoflurano, è più facile gestire il mouse e iniettare anestesia intraperitoneale.
   1. Utilizzare una soluzione di 2,4 mL ketamina (10%), 0,8 mL xilazina (2%) e 6,8 mL di NaCl (0,9%) per l'iniezione intraperitoneale.
   2. Pesare l'animale prima di applicare anestetico.
      Nota: La formula per l'anestetico è:
      
   3. utilizzare una siringa da insulina 1 mL con ago 30g per iniettare la soluzione nel ventre sinistro.
   4. Posizionare il mouse nella sua gabbia e attendere per effetto narcotico.
      Nota: L'effetto narcotico appare normalmente entro 5 min se l'iniezione è stata completata. La corretta profondità dell'anestesia può essere determinata da assenza di riflesso coperchio o reazione al pizzico di punta, così come un tasso normale, controllato di respirazione.

3. L'impianto della membrana dello scantinato-come matrice

Nota: questo metodo è utilizzato dal nostro gruppo per studiare l'angiogenesi del tumore dopo l'iniezione del monocito. A seconda degli esperimenti, fattori di crescita possono essere aggiunti alla matrice della membrana dello scantinato-come. Abbiamo effettuato la legatura dell'arteria femorale prima di iniettare il tumore nel fianco del mouse. La matrice deve avere una temperatura di 4 ° C per l'iniezione. A questa temperatura, la matrice è fluido; il gel si indurisce in un solido a temperatura corporea (37 ° C). Per una migliore visibilità della matrice sottocutanea spina, radere la pelle del mouse al sito di iniezione.

Nota: opzionale: 26 U.I. eparina in condizioni sterili alla matrice della membrana dello scantinato-come fattore di crescita del fibroblasto base di aggiungere 100 ng e 300 fattore di crescita endoteliale vascolare ng.

1. Caricare 1 mL di matrice in una siringa da insulina 30G e conservare il ghiaccio fino all'uso.
2. Gettare l'animale sul tavolo e tenere la pelle del mouse accanto al sito di iniezione sul fianco.
3. Iniettare per via sottocutanea 500 µ l della matrice della membrana dello scantinato-come.
   Nota: Per motivi pratici, è necessario immettere la matrice del tipo di membrana dello scantinato in modo compatto in un'unica sede per evitare la dispersione sottocutaneo. Sarà più facile rimuovere il tumore dal tessuto artificiale dopo sacrificare il mouse alla fine dell'esperimento.

4. Iniezione della vena della coda

Nota: praticare l'iniezione della vena della coda con soluzione di NaCl su animali da esperimento prima sperimentazione. Se i monociti non possono essere adeguatamente iniettati nella vena caudale, non ci sarà nessun effetto sistemico sul collateralization. In questo protocollo, abbiamo iniettato monociti 2,5 milioni. Tenta di iniettare non più di 5 µ l/g di peso corporeo.

1. Utilizzare la soluzione di monocito preparata sotto passo 1.1.8 contenente 2,5 milioni monociti.
2. Utilizzare un ago 30g e una siringa da insulina 1 mL per l'iniezione.
3. Con attenzione maneggiare il mouse, trattenere l'animale nel dispositivo di ritenuta e assicurarsi che il mouse non è danneggiato e ha spazio sufficiente per la respirazione.
4. Mettere il dispositivo di ritenuta sul riscaldamento pad in modo che la coda può contattare la piastra.
5. Identificare le vene di coda, che si trovano sulla parte laterale della coda.
6. Girare la coda 90 °, così vena caudale appare sul lato superiore della coda.
7. Disinfettare il lato di iniezione prima di iniettare i monociti.
8. Tenta di iniettare la soluzione del monocito in un angolo piatto con la smussatura dell'ago rivolto verso up.
   Nota: Interrompere l'iniezione se viene visualizzata la finestra di un blister, come questo è un segno di un'iniezione non riuscita. Tentare la procedura ancora più prossimalmente.
9. Fermare emorragia al sito di iniezione applicando leggera pressione sulla coda per circa 60 anni.
10. Osservare l'animale per 30 min monitorare gli effetti collaterali sistemici e posizionare il mouse nella sua gabbia dopo l'animale ha pienamente recuperato.

5. La microscopia intravital

1. preparazione
   1. posizionare il mouse anestetizzato il termoforo (37 ° C) per mantenere una temperatura costante e fissare le zampe in posizione con nastro adesivo.
   2. Disinfettare la pelle presso il sito della gamba o del fianco che viene utilizzato per la microscopia.
   3. La regione di interesse per una migliore maneggevolezza e per evitare interferenze con i capelli la barba.
   4. Asportare la pelle con un bisturi sterile e una pinzetta in un'area quadrata di 0,5 x 0,5 cm.
      Nota: È importante mantenere l'area di interesse umido; in caso contrario, sarà compromessa la qualità delle immagini e dei tessuti. Soluzione di NaCl può essere utilizzata per inumidire l'area.
   5. Collocare la gamba tra due francobolli regolabile e posizionare una copertura vetrata in cima i francobolli.
   6. Garantire il tessuto è bagnato ed è in contatto con il vetro.
   7. Inject 50 µ l rodamina destrano retrobulbar nel sistema venoso per una migliore visibilità dei vasi.
   8. Avviare la microscopia e regolare la posizione della gamba, se necessario.
2. Impostazioni di microscopia intravital
   1. accendere il microscopio, computer, interfacce elettroniche e laser.
   2. Accendere il riscaldamento della camera di incubazione e/o riscaldamento tappa (piastra/pad) e impostare la temperatura a 37 ° C.
   3. Avviare il software di acquisizione. Se il microscopio è dotato di uno scanner di risonanza, selezionare questa modalità di scansione veloce.
   4. Aspettare fino a quando la temperatura raggiunge un livello costante (35-37 ° C)
      Nota: Una temperatura stabile è importante per: (a) il mouse, che nell'ambito dell'anestesia non può controllarne la temperatura corporea e (b) evitando o almeno minimizzare drift focale. Questo potrebbe richiedere 1 h a diverse ore, a seconda delle condizioni circostanti (ad es., sistema di aria condizionata e il numero di fonti di calore in camera, incluse le persone). Se si utilizzano obiettivi di immersione, la zona di contatto tra l'obiettivo e copertura in vetro (o tessuto) è una tipica fonte di instabilità. Riscaldamento la lente con un riscaldatore oggettivo può aiutare; in alternativa, un microscopio con un sistema di autofocus è altamente raccomandato.
   5. Selezionare una lente di ingrandimento con un apertura numeral elevata che soddisfa i requisiti di risoluzione dell'esperimento (Vedi nota alla fine di questa sezione).
   6. Ottimizzare le impostazioni di microscopio rispetto al guadagno, impostazioni del canale, velocità di scansione, pixel di risoluzione, profondità volume, dimensione di passaggio e in media prima di mettere l'animale da laboratorio sul palco.
   7. Scan in entrambe le direzioni per ridurre i tempi di acquisizione.
   8. Posizionare il mouse anestetizzato sul palco preriscaldati microscopio dopo il microscopio ha raggiunto condizioni stabili e le impostazioni sono state testate con l'aiuto di un manichino.
   9. Mettere la regione di interesse all'interno della matrice della membrana dello scantinato-come a fuoco utilizzando l'illuminazione a luce brillante ed esaminare brevemente i capillari da luce ultravioletta con le impostazioni del filtro adeguato per i fluorophores applicata.
   10. Passare alla modalità; scansione avviare la scansione in modalità a bassa risoluzione 256x256 e migliorare guadagno e potere del laser fino a quando un segnale è osservato sul monitor.
   11. Focus sulla struttura di interesse. Ingrandire fino a quando tutti i dettagli sono visibili.
   12. Definire " avviare " e " fine " posizioni in direzione assiale.
   13. Interrompere la scansione.
   14. Definire dimensioni passo-passo (ad esempio, 0,5 µm) e il numero di piani focali (ad es., 10-20).
   Velocità di
   15. switch per la risoluzione di pixel finale (512 x 512 o 1.024 x 1.024) a seconda della velocità del movimento strutture subcellulari o celle e selezionare la scansione (scansione frequenza) che si adatta meglio ai movimenti. Bidirezionale di scansione è consigliata per fissare l'acquisizione degli stack.
       Nota: Selezionare il più alto tasso di scansione di scansione che dà sufficiente qualità d'immagine. Punto tipico scanner forniscono velocità comprese tra 400 Hz e 1,4 kHz. Risonante scanner forniscono un ulteriore 8 o 12 kHz. Riducendo il numero di linee in direzione y, il tasso di scansione può essere ulteriormente aumentato (i valori tipici sono 512 x 512, 512 x 256 o 512 x 200 pixel di risoluzione). In base al rapporto segnale-rumore, si può tentare di migliorare la qualità dell'immagine aggiungendo la riga che si aggirano tra 2 e 4. In genere, l'impostazione di 512 x 200 con nessun risultato in media in un periodo di acquisizione di 18 ms in modalità bidirezionale con uno scanner di risonanza di 8 KHz; con 512 x 200 e 4 x una media, rallenta fino a 56 ms per ogni frame.

Risultati

La microscopia intravital per l'esame del tumore e la crescita dei vasi collaterali innescato dai monociti può aiutare a rivelare nuovi aspetti in meccanismi molecolari di angiogenesi del tumore e arteriogenesi. Le cellule devono essere preparate e iniettato con cura utilizzando la procedura del protocollo. Differenze possono portare a variazioni tra singoli esperimenti. I monociti devono essere iniettati nel sistema venoso (Figura 1) per mantenere gli effet...

Discussione

Il metodo qui descritto mette in luce lo sviluppo delle arterie collaterali, il comportamento dei monociti in questi vasi e il processo di arteriogenesi. I passaggi per l'applicazione del presente protocollo sono facili da imparare e può essere utilizzato in altri campi della scienza. Nonostante questi vantaggi, ci sono alcuni svantaggi. Per esempio, apparecchiature microscopica sono necessaria per eseguire le tecniche descritte. Come ottenere attrezzature per un esperimento è insostenibile, quindi è importante collab...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% fetal calf serum (FCS)	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
1% penicillin/streptomycin	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
1mL Omnifix -F insuline syringe	B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany
50 ml syringe	Fresenius Kabi AG, Bad Homburg, Germany		Injectomat- syringe 50 ml with canule
6-well-ultra-low-attachement-plates	Corning Incorporated, NY, USA
8- 12 week old, male, C57BL/6, BalbC mice	Charles River, Sulzfeld, Germany
Adhesive tape	TESA SE, Hamburg, Germany
Acquisition Software	Leica, Wetzlar, Deutschland		Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF); Version: 2.7.3.9723
Canules	B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany		29G, 30G
Cell culture dish	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany
Cell culture medium	Manufactured by our group with single components		Medium199, 10% Fetal calf serum, 1% Antibiotic (penicillin/streptomycin)
Centrifuge	Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany		Allegra X-15R centrifuge
Depilatory cream	Veet, Mannheim, Germany
DiO	Invitrogen Eugene, Oregon, USA
Disinfection agent	Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany
Disposable scalpel No.10	Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan
EDTA	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Erlenmeyer flask	GVB, Herzogenrath, Germany
Ethanol 70%	Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany
Fetal Calf Serum	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Fine Forceps	Rubis, Stabio, Switzerland
Flurophor/Rhodamindextran	Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA	Katalognummer: D-1819
Gloves	Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany
Heating pad	Labotect GmbH, Göttingen, Germany		Hot Plate 062
Human macrophage-colony stimulating factor	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany	SRP3110
Humane leucocyte filters	Blood preservation
Incubator	Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany
Isoflurane	Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany
Ketamine (10%)	Ketavet, Pfizer Deutschland GmbH, Berlin , Germany
Leukocyte separation tubes (tubes with filter)	Bio one GmbH, Frickenhausen, Germany
Light microscope	Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany		Axiovert 40 C
Lymphocyte separation medium LSM1077	GE Healthcare, Pasching, Austria
Matrigel	Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA
Medium M199	PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria
Microbiological work bench	Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany		Hera safe
Microscope slide	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	Art. Nr. 1879
Microscope stand with incubator and heating unit	Leica DMI 6000, Pecon, Germany
Monocyte wash buffer	Manufactured by our group with single components		PBS, 0,5% BSA, 2mM EDTA
Mouse restrainer	Various
Multi-photon microscope	Leica, Wetzlar, Deutschland		Leica SP5 Confocal microscope, Cameleon, Coherent
NaCl (0,9%)	Berlin Chemie AG, Berlin, Germany
Neubauer counting chamber	Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany
Objective	Leica, Wetzlar, Deutschland		Leica HC PL APO 10x/0.4 CS
PBS	Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany		ph 7,4 sterile
Penicillin/Streptomycin	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Percoll	Manufactured by our group with single components		90 % Percoll, 10% 1,5M NaCl, ρ= 1,064 g cm-3
Percoll solution	GE Healthcare, Bio-Science AB, Uppsala, Sweden
Pipettes	Eppendorf AG, Hamburg, Germany		10µL/100µL/200µL/1000µL
Pipettes serological	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		Cellstar2ml, 5ml, 10ml
Pipetting heads	Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Pipetus	Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Polystyrol tube	Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany
Scissor	Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA
Scale	Mettler PM4800 Delta Range, Mettler-Toledo GmbH, Gießen, Germany
Suction unit	Integra bioscience, Fernwald, Germany		Vacusafe comfort
Surgical scissors	Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA
Trypan blue solution 0,4 %	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Tubes with cap	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		15ml, 50ml Cellstar
Xylazine (2 %)	Ceva Tiergesundheit GmbH, Düsseldorf, Germany