מיקרוסקופ intravital של יונת מונוציט, הקשורות הגידול אנגיוגנזה במודל מאתר של מחלת עורקים היקפית

Summary

ומונוציטים הם מתווכים חשובים של arteriogenesis בהקשר של מחלת עורקים היקפית. פרוטוקול זה באמצעות מטריקס קרום המרתף דמוי מיקרוסקופ intravital, חוקר אנגיוגנזה ביות ו הקשורות הגידול מונוציט לאחר ההזרקה מונוציט במודל מאתר מצדו בעורק הירך.

Abstract

המטרה הטיפולית של מחלת עורקים היקפית, מחלת לב איסכמית היא להגביר את זרימת הדם לאזורים איסכמי הנגרמת על ידי היצרות בגרימת. כירורגיית כלי דם היא אפשרות מעשית במקרים נבחרים, אך עבור חולים ללא אינדיקציות לניתוח כמו התקדמות לנוח כאב, איסכמיה איבר חיוני או השיבושים הגדולים החיים או לעבוד, יש כמה אפשרויות להקלת המחלה שלהם. טיפול בתאי דרך משופרת מונוציט זלוף באמצעות הגירוי של משני צורה היא אחת מתוך כמה אפשרויות לא פולשנית.

הקבוצה שלנו בוחן את arteriogenesis לאחר ההשתלה מונוציט לתוך עכברים באמצעות מודל איסכמיה hindlimb. בעבר, הראו שיפור זלוף hindlimb באמצעות השתלת מגורה-טטנוס מונוציט syngeneic. בנוסף, את ההשפעות על היווצרות משני הגידול יכולה להיות מושפעת גם טיפול זה. כדי לחקור תופעות אלה, אנו משתמשים דגם העכבר כמו קרום המרתף מטריקס באמצעות הזרקה של מטריצה חוץ-תאית סרקומה Engelbreth-הולם-נחיל לתוך האגף של העכבר, לאחר חסימה של עורק הירך.

לאחר הלימודים גידול מלאכותיים, אנו משתמשים במיקרוסקופ intravital ללמוד ויוו -אנגיוגנזה ו מונוציט ביות בתוך העורקים משני. מחקרים קודמים תיארו בחינה היסטולוגית של מודלים בבעלי חיים, אשר מובנית כבר חשפה לחפצים פוסט-מורטם . הגישה שלנו מדמיין מונוציט יונת לאזורים של collateralization רצפים בזמן אמת, קל לביצוע, והוא חוקר את התהליך של אנגיוגנזה arteriogenesis ואת הגידול בתוך vivo.

Introduction

מחלות לב וכלי דם, כולל מחלת לב כלילית או מחלת עורקים היקפית, הם הסיבות הנפוצות ביותר של מוות ברחבי העולם¹. טיפול בתאי היא גישה מבטיחה לטיפול במחלות לב וכלי דם, במיוחד עבור אנשים שאינם יכולים לעבור התערבויות כירורגיות. ישנן מספר גישות לשימוש תאים או חומרים מופרשים שלהם הכלי הטיפולי^2,3, עם המטרה הכוללת לשפר את זלוף ולשמור על תפקוד לרקמות איסכמי, underperfused. ניסיון אחד כדי להשיג מטרה זו היא לשפר את arteriogenesis, אשר משפר את התפתחות משני העורקים. ומונוציטים הן סוג של תא חשובים הקשורים collateralization. הקבוצה שלנו התמקדה חוקרת את ההשפעות של monocytes באזורים של דלקת^4,5, במיוחד באמצעות מודל איסכמיה hindlimb לזירוז איסכמיה ושלאחר דלקת⁶. ומונוציטים הביתה לאזורים של דלקת וגורמים תגובות מורכבות מערכתית להוביל להתפתחות של collateralization⁷.

עם השימוש של מיקרוסקופ intravital, אנחנו יכולים ללמוד את אופן הפעולה של אלה תאים ויוו ולבחון את יונת של monocytes שהוחדר לאזורים של דלקת. רוב המחקרים לשעבר לתאר רק אחרי המוות ניתוחים, המחזיקים חסרונות כולל הקדמה של חפצים היסטולוגית ומספרים גדולים של בעלי חיים נדרש על ההכנות. בגישה שלנו, אנחנו יכולים לחקור תהליכים אימונולוגי ולחיות משני צורה באמצעות הדמיה בנקודות זמן מרובים.

בנוסף התפתחות עורקים משני התחומים איסכמי, ומונוציטים גם להשפיע על הגידול. לחקור תהליכים אלו, אנו מזריקים מטריצה כמו קרום המרתף מופק סרקומה של העכבר Engelbreth-הולם-נחיל, גידול עשיר במטריצה חוץ-תאית חלבונים⁸, לנתח באמצעות מיקרוסקופ intravital. מטריצה זו משמשת ממבחן מולקולות או היווצרות רשת תא אנדותל או טיפולים אנטי סרטניים באמצעות עיכוב האנגיוגנזה; במקרה זה, ואנו נעריך את הפוטנציאל האנגיוגנזה הגידול של monocytes תא טיפול^9,10,11.

המטרה של פרוטוקול זה היא להפגין דרך קלה ויעילה ללמוד תהליכים אימונולוגי הנגרמת על ידי איסכמיה במודל ויוו . אנחנו יכולים ליצור סביבת בדיקה מציאותית יותר בהשוואה workup היסטולוגית של רקמת השריר לאחר המוות .

Protocol

המחקר שלנו בוצעה באישור מדינת סקסוניה-אנהלט, האלי Landesverwaltungsamt, על פי סעיף 8 לחוק הגרמני להגנת בעלי חיים. (§ 8, פסקה 1 של החוק הגרמני להגנת בעלי חיים מן 18.05.2016 - BGBI. אני S. רכבת 1206, 1313, § 31 TierSchVersV מ- 13.08.2013).

הערה: בשביל הניסויים כאן, שימשו 8-12 שבוע זכר BALB/c עכברים, ומונוציטים האנושי מתורמים דם שימשו את החזיית ומונוציטים באמצעות מיקרוסקופ intravital.

1. הכנה תא

הערה: לקבלת בידודו של monocytes, בבקשה ראה וידאו שפורסם הקודם שלנו על יופיטר לקבלת הוראות: " בידוד, תוך ורידי הזרקה של מאתר מח עצם נגזר ומונוציטים " על ידי. וגנר et al. ⁴

הערה: כאשר עובד עם התאים כל השלבים חייב להיות סטרילי כדי למנוע זיהום.

1. תא מכתים עם 3,3 '-פרכלורט Dioctadecyloxacarbocyanine
   1. Resuspend התאים במדיום תרבות חופשית סרום, עם צפיפות של עונה 1 פרק 10 ⁶ תאים למ"ל.
      הערה: רק בינוני חינם הנסיוב מאפשר יעיל מכתים, מאז לצבוע lipophilic אחרת כבר ייתפס על ידי מרכיבי הסרום lipophilic.
   2. 5 להוסיף µL של 1 מ מ 3,3 '-Dioctadecyloxacarbocyanine פרכלורט ב dimethylformamide מ ל 1 של התליה תא, resuspend בזהירות.
   3. Incubate הפתרון תא ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דק.
   4. Centrifuge התאים ב 37 ° C ו- g x 500 עבור 5 דק.
   5. לסלק את תגובת שיקוע, resuspend את התאים 37 ° C עגל עוברית חמים סרום שיושלם בינונית.
   6. חזור על השלבים 1.1.4 ו 1.1.5 פעמיים.
   7. לספור את התאים בנוסחה:
      
   8. resuspend התאים עם 150 µL 0.9% NaCl פתרון סטרילי.
   9. להזריק את התאים לתוך הווריד זנב של.

2. הרדמה

1. באינהלציה הרדמה
   1. לאדות איזופלוריין בסיוע מכשיר אידוי באמצעות בריכוז 5% בתוך סל סגור תחת ברדס בטיחות כימית.
   2. להתמודד עם העכבר בזהירות ושים אותו לפח.
   3. להתמודד עם החיה בעור הצוואר האחורי, לאחר שהפסיק לנוע.
2. הרדמה בקרום הבטן
   הערה: שימוש איזופלוריין הרדמה, המתוארים תחת שלב 2.1, לבצע זריקה בקרום הבטן. עם שחזור מהיר, קצרת השפעה נרקוטית של ההרדמה איזופלוריין, קל יותר להתמודד עם העכבר, להזריק הרדמה בקרום הבטן.
   1. להשתמש פתרון של 2.4 מ ל קטמין (10%), 0.8 מ ל חריגות השירותים הווטרינריים (2%) ו- mL 6.8 NaCl (0.9%) עבור הזריקה בקרום הבטן.
   2. שוקל את החיה לפני החלת הרדמה.
      הערה: הנוסחה ההרדמה היא:
      
   3. להשתמש מזרק אינסולין 1 מ"ל עם מחט 30 G כדי להזריק את הפתרון לתוך הבטן הרכה שמאלה.
   4. למקם העכבר בכלוב ולחכות השפעה נרקוטית.
      הערה: השפעה נרקוטית בדרך כלל מופיע בתוך 5 דקות אם הזריקה הייתה מוצלחת. עומק ההרדמה הנכון יכול להיקבע על ידי העדר רפלקס המכסה או תגובה קמצוץ הבוהן, כמו גם קצב קבוע, מבוקר של נשימה.

3. השרשה של קרום המרתף כמו מטריקס

הערה: בשיטה זו משתמשים על-ידי הקבוצה שלנו ללמוד אנגיוגנזה לאחר ההזרקה מונוציט. בהתאם הניסויים, גורמי גדילה יכולים להתווסף אל המטריקס כמו קרום המרתף. ביצענו מצדו עורק הירך לפני הזרקת הגידול באגפים של העכבר. המטריקס חייב להיות לטמפרטורה של 4 ° C עבור ההזרקה. בטמפרטורה זו, המטריקס היא נוזל; הג'ל מחזק למצב מוצק בטמפרטורת הגוף (37 מעלות צלזיוס). עבור ניראות טובה יותר של המטריקס תת עורית פלאג, לגלח את העור של העכבר באתר הזרקת.

הערה: אופציונלי: להוסיף 100 ng בסיסי פיברובלסט גורם הגדילה 300 ng כלי הדם צמיחה אנדותל, הפארין 26 I.U. בתנאים סטריליים למטריקס כמו קרום המרתף.

1. לטעון 1 מ"ל של מטריקס לתוך מזרק אינסולין 30 G ואת החנות על הקרח עד שימוש.
2. שכב החיה על השולחן והחזק את העור של העכבר ליד ההזרקה לאגף.
3. להזריק µL 500 של המטריקס, כמו קרום המרתף subcutaneously.
   הערה: מטעמים פרקטיים, יש צורך להזריק את המטריקס, כמו קרום המרתף ברוחבו במיקום אחד כדי למנוע פיזור תת עורית. זה יהיה קל יותר מכך הגידול מלאכותי של הרקמות לאחר הקרבת את העכבר בסוף הניסוי.

4. זנב הווריד הזרקת

הערה: לתרגל את הזריקה וריד הזנב עם פתרון NaCl על מבעלי החיים לפני ניסויים. אם ומונוציטים לא יכול להיות מוזרק במידה מספקת את תקחי את הזנב, תהיה השפעה מערכתית על collateralization. ב פרוטוקול זה, היינו מזריקים גם ומונוציטים 2.5 מיליון. נסה להחדיר µL לא יותר מ 5/g של bodyweight.

1. להשתמש הפתרון מונוציט מוכן תחת שלב 1.1.8 המכילה 2.5 מיליון ומונוציטים.
2. השתמש מחט 30 G ומזרק אינסולין 1 מ"ל על הזריקה.
3. בקפידה להתמודד עם העכבר לרסן את החיה restrainer, ודא העכבר אינו נפגע, יש מרחב הולם עבור הנשימה.
4. לשים את restrainer על כרית החימום כך הזנב יכולים לפנות את הצלחת.
5. לזהות את הוורידים הזנב, אשר ממוקמים על הצד הלטראלי של הזנב.
6. להפוך את הזנב 90 מעלות, כך הווריד הזנב מופיע בחלק העליון של הזנב.
7. לחטא את הצד הזרקה לפני הזרקת את ומונוציטים.
8. לנסות להזריק את הפתרון מונוציט ב זווית שטוחה עם שפוע של המחט פונה למעלה
   הערה: לעצור את הזריקה אם שלפוחית מופיע, כמו זה סימן של זריקת שנכשלו. ניסיון ההליך שוב הציר הקרוב יותר.
9. להפסיק הדימום באתר הזרקת על ידי הפעלת לחץ עדין על הזנב בשביל בערך בשנות ה-60.
10. להתבונן החיה למשך 30 דקות לפקח על תופעות לוואי מערכתית ומקם את העכבר בכלוב שלו אחרי החיה הוא החלים לחלוטין.

5. מיקרוסקופ intravital

1. הכנת
   1. למקם העכבר anesthetized על כרית החימום (37 מעלות צלזיוס) כדי לשמור על טמפרטורת חום קבועה ולתקן את כפות רגליו במקום עם דבק.
   2. לחטא את העור באתר של הרגל או האגף המשמשת עבור מיקרוסקופ.
   3. לגלח את האזור עניין טיפול טוב יותר, כדי למנוע הפרעה עם שיער.
   4. לסלק את העור עם האזמל סטרילי, מלקחיים בסדר באזור הכיכר של 0.5 x 0.5 ס מ.
      הערה: חשוב לשמור על האזור עניין לח; אחרת, איכות התמונות ואת הרקמה יפגע NaCl פתרון יכול לשמש כדי להרטיב את האזור.
   5. למקם את הרגל בין שתי בולים מתכווננת ומקם זכוכית מכסה על גבי הבולים.
   6. להבטיח הרקמה רטוב והוא במגע עם הכוס.
   7. הפצוע למרכז הרect 50 µL rhodamine retrobulbar לתוספי לתוך מערכת ורידים עבור ניראות טובה יותר של כלי.
   8. להתאים את המיקום של הרגל במידת הצורך ומתחילים מיקרוסקופ.
2. הגדרות מיקרוסקופ intravital
   1. הפעלת מיקרוסקופ, במחשב, ממשקים אלקטרוניים, וכן לייזרים.
   2. להפעיל יחידת החימום של דגירה קאמרית ו/או חימום שלב (צלחת/מקלדת) והגדר את הטמפרטורה 37 מעלות צלזיוס.
   3. להתחיל את רכישת התוכנה. אם המיקרוסקופ הינו מצויד עם סורק תהודה, בחר במצב סריקה מהירה זה.
   4. לחכות עד שהטמפרטורה מגיע רמה קבועה (35-37 מעלות צלזיוס)
      הערה: טמפרטורה יציבה חשוב עבור: (א) את העכבר, אשר תחת הרדמה לא יכול לשלוט טמפרטורת הגוף שלה, ואת הסחף מוקד (ב) הימנעות או לפחות למזער. זה יכול לקחת 1 h מספר שעות, בהתאם לתנאי הסביבה (למשל, מערכת מיזוג אוויר ואת מספר מקורות חום בחדר, כולל אנשים). אם מטרות טבילה משמשים, אזור קשר בין העדשה ואת כיסוי זכוכית (או רקמות) הוא מקור טיפוסי של חוסר יציבות. חימום העדשה עם חימום אובייקטיבית עשויה לעזור; לחלופין, מיקרוסקופ עם מערכת פוקוס אוטומטי ומומלץ-
   5. בחר עדשה הגדלה עם צוהר ספרתיות גבוהות שתספק את הדרישות ברזולוציה של הניסוי (ראו הערה בסוף סעיף זה).
   6. למטב את הגדרות מיקרוסקופ ביחס לרווח, הגדרות הערוצים, מהירות סריקה, פיקסל ברזולוציה, נפח עומק, שלב בגודל בממוצע לפני הצבת החיה ניסיוני על הבמה.
   7. סרוק ההכפלה כדי לצמצם את זמן רכישת.
   8. למקם את העכבר anesthetized על הבמה מיקרוסקופ prewarmed אחרי המיקרוסקופ הגיעה תנאים יציבים, ההגדרות נבדקו בעזרת בובה.
   9. להביא את האזור של עניין בתוך המטריצה כמו קרום המרתף להתמקד באמצעות תאורה אור בהיר ולבדוק בקצרה הנימים באור אולטרה סגול עם הגדרות המסנן נאותה אפלייד fluorophores.
   10. לעבור סריקה מצב; להפעיל סריקה ברזולוציה נמוכה 256 x 256 ב"מוד ולא רווח ולשפר לייזר כוח עד אות נצפית על המסך.
   11. פוקוס על המבנה של ריבית. תקריב עד כל הפרטים גלויים.
   12. הגדר " להתחיל " ו- " סיום " עמדות לכיוון צירית.
   13. לעצור את הסריקה.
   14. הגדרת הגודל דריכה (למשל, 0.5 מיקרומטר) ומספר מטוסים נקודתית (למשל, 10-20).
   מהירות
   15. מתג עד רזולוציה פיקסל הסופי (512 x 512 או 1,024 x 1,024) בהתאם למהירות של מבנים subcellular נע או תאים, בחר הסריקה (תדירות סריקה) שמתאים כמיטב יכולתה התנועות. דו-כיווני סריקה מומלצת, כדי להדק את הרכישה של ערימות.
       הערה: בחר את קצב הסריקה הגבוהה ביותר של סריקת שנותן מספקת איכות תמונה. נקודת טיפוסי סורקים לספק מהירויות בין 400 Hz-1.4 kHz. סורקים תהודה מספקים של 8 kHz או 12 kHz נוספים. על-ידי הפחתת מספר השורות בכיוון-y, קצב הסריקה יכול להיות גדל עוד יותר (ערכים אופייניים הם 512 x 512, 512 x 256 או 512 x 200 פיקסלים ברזולוציה). בהתאם יחס אות לרעש, אפשר לנסות לשפר את איכות התמונה על ידי הוספת קו ממוצע של בין 2 ל-4. בדרך כלל, הגדרה של 512 x 200 ללא תוצאות חישוב ממוצע רגיל רכישה/מסגרת זמן של ms 18 במצב דו-כיוונית עם סורק תהודה 8 קילו-הרץ; עם 512 x 200 ו- 4 x בממוצע, מאט ל ms 56 לכל מסגרת.

תוצאות

Intravital מיקרוסקופ לבדיקה של גידול וצמיחה משני כלי המופעלות על-ידי ומונוציטים יכול לעזור לגלות אספקטים חדשים בהמנגנון המולקולרי של אנגיוגנזה, arteriogenesis. התאים חייב להיות מוכן, מוזרק בזהירות באמצעות השלבים של הפרוטוקול. ההבדלים יכול להוביל וריאציות בין ניסויים יחיד. ומונוצי?...

Discussion

השיטה המתוארת כאן שופך אור על התפתחות משני העורקים, את אופן הפעולה של monocytes בכלי האלה, ואת התהליך של arteriogenesis. השלבים על יישום פרוטוקול זה הם קל ללמוד והוא יכול לשמש גם בתחומים אחרים של המדע. למרות היתרונות הללו, ישנם כמה חסרונות. למשל, מיקרוסקופיים ציוד נדרש לבצע את הטכניקות המתואר. קבלת ציוד...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% fetal calf serum (FCS)	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
1% penicillin/streptomycin	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
1mL Omnifix -F insuline syringe	B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany
50 ml syringe	Fresenius Kabi AG, Bad Homburg, Germany		Injectomat- syringe 50 ml with canule
6-well-ultra-low-attachement-plates	Corning Incorporated, NY, USA
8- 12 week old, male, C57BL/6, BalbC mice	Charles River, Sulzfeld, Germany
Adhesive tape	TESA SE, Hamburg, Germany
Acquisition Software	Leica, Wetzlar, Deutschland		Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF); Version: 2.7.3.9723
Canules	B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany		29G, 30G
Cell culture dish	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany
Cell culture medium	Manufactured by our group with single components		Medium199, 10% Fetal calf serum, 1% Antibiotic (penicillin/streptomycin)
Centrifuge	Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany		Allegra X-15R centrifuge
Depilatory cream	Veet, Mannheim, Germany
DiO	Invitrogen Eugene, Oregon, USA
Disinfection agent	Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany
Disposable scalpel No.10	Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan
EDTA	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Erlenmeyer flask	GVB, Herzogenrath, Germany
Ethanol 70%	Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany
Fetal Calf Serum	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Fine Forceps	Rubis, Stabio, Switzerland
Flurophor/Rhodamindextran	Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA	Katalognummer: D-1819
Gloves	Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany
Heating pad	Labotect GmbH, Göttingen, Germany		Hot Plate 062
Human macrophage-colony stimulating factor	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany	SRP3110
Humane leucocyte filters	Blood preservation
Incubator	Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany
Isoflurane	Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany
Ketamine (10%)	Ketavet, Pfizer Deutschland GmbH, Berlin , Germany
Leukocyte separation tubes (tubes with filter)	Bio one GmbH, Frickenhausen, Germany
Light microscope	Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany		Axiovert 40 C
Lymphocyte separation medium LSM1077	GE Healthcare, Pasching, Austria
Matrigel	Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA
Medium M199	PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria
Microbiological work bench	Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany		Hera safe
Microscope slide	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	Art. Nr. 1879
Microscope stand with incubator and heating unit	Leica DMI 6000, Pecon, Germany
Monocyte wash buffer	Manufactured by our group with single components		PBS, 0,5% BSA, 2mM EDTA
Mouse restrainer	Various
Multi-photon microscope	Leica, Wetzlar, Deutschland		Leica SP5 Confocal microscope, Cameleon, Coherent
NaCl (0,9%)	Berlin Chemie AG, Berlin, Germany
Neubauer counting chamber	Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany
Objective	Leica, Wetzlar, Deutschland		Leica HC PL APO 10x/0.4 CS
PBS	Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany		ph 7,4 sterile
Penicillin/Streptomycin	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Percoll	Manufactured by our group with single components		90 % Percoll, 10% 1,5M NaCl, ρ= 1,064 g cm-3
Percoll solution	GE Healthcare, Bio-Science AB, Uppsala, Sweden
Pipettes	Eppendorf AG, Hamburg, Germany		10µL/100µL/200µL/1000µL
Pipettes serological	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		Cellstar2ml, 5ml, 10ml
Pipetting heads	Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Pipetus	Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Polystyrol tube	Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany
Scissor	Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA
Scale	Mettler PM4800 Delta Range, Mettler-Toledo GmbH, Gießen, Germany
Suction unit	Integra bioscience, Fernwald, Germany		Vacusafe comfort
Surgical scissors	Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA
Trypan blue solution 0,4 %	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Tubes with cap	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		15ml, 50ml Cellstar
Xylazine (2 %)	Ceva Tiergesundheit GmbH, Düsseldorf, Germany