Microscopie intravitale de Monocyte Homing et axés sur la tumeur de l’angiogenèse dans un modèle murin de la maladie artérielle périphérique

Résumé

Les monocytes sont des médiateurs importants d’arteriogenesis dans le contexte de la maladie artérielle périphérique. En utilisant une matrice de type membrane basale et la microscopie intravitale, ce protocole étudie monocyte autoguidage et axés sur la tumeur de l’angiogenèse après injection de monocytes dans le modèle murin de la ligature de l’artère fémorale.

Résumé

L’objectif thérapeutique pour la maladie artérielle périphérique et cardiopathie ischémique est d’augmenter le flux sanguin vers les zones ischémiques causées par une sténose hémodynamique. Chirurgie vasculaire est une option viable dans certains cas précis, mais pour les patients sans indication d’une intervention chirurgicale comme la progression de repos la douleur, une ischémie des membres critiques ou des perturbations majeures à la vie ou de travail, il y a peu de possibilités pour atténuer leur maladie. La thérapie cellulaire par perfusion de monocyte améliorée grâce à la stimulation de la formation collatérale est l’un des quelques options non invasives.

Notre groupe examine arteriogenesis après greffe de monocyte sur des souris en utilisant le modèle d’ischémie du membre postérieur. Auparavant, nous avons démontré amélioration de la perfusion du membre postérieur à l’aide de transplantation de monocyte syngénique stimulée par le tétanos. Outre les effets sur la formation de collatéraux, croissance tumorale pourrait être affectée par cette thérapie ainsi. Afin d’examiner ces effets, nous utilisons un modèle de souris de membrane basale comme matrice en injectant de la matrice extracellulaire de la sarcome Engelbreth-Holm-essaim dans le flanc de la souris, après l’occlusion de l’artère fémorale.

Après les études de tumeur artificiel, nous utilisons la microscopie intravitale pour étudier in vivo -angiogenèse tumorale et monocytes homing dans les artères collatérales. Des études antérieures ont décrit l’examen histologique des modèles animaux, ce qui suppose l’analyse post mortem d’artefacts. Notre approche visualise homing monocyte aux zones de nantissement en temps réel de séquences, est facile à réaliser et étudie le processus d’arteriogenesis et tumeur angiogenèse in vivo.

Introduction

Les maladies cardiovasculaires, y compris les maladies coronariennes ou la maladie artérielle périphérique, sont les causes les plus fréquentes de décès dans le monde¹. La thérapie cellulaire est une approche prometteuse pour traiter les maladies cardiovasculaires, en particulier pour les personnes qui ne sont pas capable de subir des interventions chirurgicales. Il existe plusieurs approches à utiliser des cellules ou leurs substances sécrétées comme un outil thérapeutique^2,3, dans le but d’améliorer la perfusion et de maintenir la fonction du tissu ischémique et y. Une tentative pour atteindre cet objectif est d’améliorer les arteriogenesis, qui favorise le développement des artères collatérales. Les monocytes sont un type de cellules importantes associé de nantissement. Notre groupe a mis l’accent sur la recherche sur les effets des monocytes dans les zones d’inflammation^4,5, en particulier en utilisant le modèle d’ischémie du membre postérieur pour induire une ischémie et inflammation subséquente⁶. Monocytes abritent des zones d’inflammation et causent des réactions systémiques complexes qui conduisent à l’élaboration de collatéralisation⁷.

Avec l’utilisation de la microscopie intravitale, nous pouvons étudier le comportement de ces cellules en vivo et observer le homing des monocytes injectées aux zones d’inflammation. La plupart des études anciennes décrivent seulement les analyses post-mortem , qui détiennent les inconvénients, y compris une introduction d’artefacts histologiques et un grand nombre d’animaux requis pour les préparations. Grâce à notre approche, nous pouvons étudier les processus immunologiques et collatérale formation via live d’imagerie à plusieurs points dans le temps.

Outre le développement des artères collatérales en zones ischémiques, monocytes influencent également la croissance tumorale. Pour étudier ces processus, nous injecter une matrice de type membrane basale extraite du sarcome de souris Engelbreth-Holm-Swarm, une tumeur riche en protéines de la matrice extracellulaire⁸et d’analyser à l’aide de la microscopie intravitale. Cette matrice est utilisée pour des molécules de test de l’écran pour formation de réseau cellulaire endothéliale ou anticancéreux par inhibition angiogénique ; dans ce cas, nous évaluerons le potentiel angiogénique de tumeur des monocytes pour cell therapy^9,10,11.

Ce protocole vise à démontrer de manière simple et efficace pour étudier les processus immunologiques causées par une ischémie dans un modèle in vivo . Nous pouvons générer un environnement de test plus réaliste par rapport au bilan histologique des post-mortem des tissus musculaires.

Protocole

notre étude a été réalisée avec l’autorisation de l’Etat de Saxe-Anhalt, Landesverwaltungsamt Halle, conformément à l’article 8 de la loi allemande de protection des animaux. (§ 8, paragraphe 1 de la loi allemande de protection des animaux de 18.05.2016 - BGBI. I s. 1206, 1313, § 31 TierSchVersV de 13.08.2013).

Remarque : pour les expériences ici, 8 à 12 semaine vieux BALB/c les souris mâles ont été utilisés, et des monocytes humains provenant de donneurs de sang ont été utilisés pour la visualisation des monocytes par microscopie intravitale.

1. préparation de cellules

Remarque : pour l’isolement des monocytes, veuillez consulter notre précédente vidéo publié sur JoVE pour obtenir des instructions : " isolement et Injection intraveineuse de murin moelle osseuse dérivés Monocytes " par Wagner et al. ⁴

Remarque : quand travailler avec les cellules de toutes les mesures doit être stérile pour éviter toute contamination.

1. Cellule coloration avec 3,3 '-Perchlorate de Dioctadecyloxacarbocyanine
   1. remettre en suspension les cellules dans le milieu de culture sans sérum avec une densité de 1 x 10 ⁶ cellules/mL.
      NOTE : Seulement un milieu sans sérum permet une coloration efficace, car le colorant lipophile serait par ailleurs déjà saisis par les composants lipophiles du sérum.
   2. Ajouter 5 µL de 1 mM 3,3 '-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate dans le diméthylformamide à 1 mL de la suspension cellulaire et resuspendre soigneusement.
   3. Incuber la solution de cellules à 37 ° C pendant 20 min.
   4. Centrifuger les cellules à 37 ° C et 500 g pendant 5 min.
   5. Déloger le surnageant et remettre en suspension les cellules avec milieu de complétée de sérum foetal de veau tiède 37 ° C.
   6. Répéter deux fois les mesures 1.1.4 et 1.1.5.
   7. Compter les cellules avec la formule :
      
   8. remettre en suspension les cellules avec la solution de NaCl 0,9 % stérile 150 µL.
   9. Les cellules d’injecter dans la veine caudale.

2. Anesthésie

1. de l' Anesthésie par Inhalation
   1. vaporiser isoflurane avec l’aide d’un vaporisateur utilisant une concentration de 5 % dans un bac fermé sous une hotte de sécurité chimique.
   2. Manipuler la souris avec précaution et placez-le dans le bac.
   3. Gérer l’animal par la peau du cou postérieur après qu’il a cessé de se déplaçant.
2. Anesthésie intrapéritonéale
   Remarque : l’anesthésie isoflurane utilisation, décrit dans l’étape 2.1, pour réaliser une injection intrapéritonéale. Avec la récupération rapide et de courte durée d’action effet narcotique de l’anesthésie à l’isoflurane, il est plus facile à manipuler la souris et injecter l’anesthésie intrapéritonéale.
   1. Utiliser une solution de 2,4 mL kétamine (10 %), 0,8 mL Xylazine (2 %) et 6,8 mL NaCl (0,9 %) pour l’injection intrapéritonéale.
   2. Peser l’animal avant d’appliquer l’anesthésique.
      Remarque : La formule de l’anesthésique est :
      
   3. utiliser une seringue à insuline 1 mL avec une aiguille de 30 G pour injecter la solution dans le ventre gauche.
   4. Placer la souris dans sa cage et attendre pour effet narcotique.
      NOTE : L’effet narcotique apparaît normalement dans 5 min si l’injection a été un succès. La profondeur de l’anesthésie peut être déterminée en l’absence du réflexe de couvercle ou réaction au pincement de l’orteil, ainsi qu’un taux régulier et contrôlé de la respiration.

3. Implantation de Membrane basale comme matrice

Remarque : cette méthode est utilisée par notre groupe pour étudier l’angiogenèse tumorale après injection de monocytes. Selon les expériences, facteurs de croissance peut être ajoutés à la matrice de la membrane basale-like. Nous avons effectué la ligature de l’artère fémorale avant d’injecter la tumeur dans le flanc de la souris. La matrice doit avoir une température de 4 ° C pendant l’injection. À cette température, la matrice est fluide ; le gel durcit en solide à la température corporelle (37 ° C). Pour une meilleure visibilité de la matrice sous-cutanée de bougie, raser la peau de la souris au point d’injection.

Remarque : facultatif : ajouter 100 ng facteur de croissance basique des fibroblastes, facteur de croissance endothélial vasculaire ng 300 et 26 UI héparine, dans des conditions stériles à la matrice de la membrane basale comme.

1. Charger 1 mL de matrice dans une seringue à insuline 30 G et un magasin sur la glace jusqu'à utilisation.
2. Mettre l’animal sur la table et maintenir la peau de la souris à côté du site d’injection sur le flanc.
3. Injecter par voie sous-cutanée de 500 µL de la matrice de la membrane basale-comme.
   Remarque : Pour des raisons pratiques, il est nécessaire d’injecter la matrice comme membrane basale compacte en un seul endroit pour éviter la dispersion sous-cutanée. Il sera plus facile de déloger la tumeur artificielle du tissu après avoir sacrifié la souris à la fin de l’expérience.

4. Injection de la veine de queue

Remarque : pratiquer l’injection dans la veine queue avec une solution de NaCl sur animaux de laboratoire avant l’expérimentation. Si les monocytes ne peuvent pas être adéquatement injectés dans la veine caudale, il n’y aura aucun effet systémique sur le nantissement. Dans ce protocole, nous avons injecté 2,5 millions des monocytes. Essayez d’injecter pas plus de 5 µL/g de poids corporel.

1. Utiliser la solution de monocyte préparée sous étape 1.1.8 contenant 2,5 millions de monocytes.
2. Utiliser une aiguille de 30 G et une seringue de 1 mL insuline pour l’injection.
3. Soigneusement gérer la souris, immobiliser l’animal dans la drisse et assurez-vous que la souris n’est pas mal et a suffisamment d’espace pour respirer.
4. a la drisse sur le coussin chauffant afin que la queue peut communiquer avec la plaque.
5. Identifier les veines de la queue, qui sont situés sur le côté latéral de la queue.
6. Tourner la queue de 90 °, jusqu'à ce que la veine caudale apparaît sur la face supérieure de la queue.
7. Désinfecter la partie injection avant d’injecter les monocytes.
8. Essayer d’injecter la solution de monocytes dans un angle plat avec le biseau de l’aiguille face vers le haut
   NOTE : Si une cloque apparaît, arrêter l’injection puisqu’il s’agit d’un signe d’une injection défaillant. Essayez la procédure encore plus proximalement.
9. Arrêter le saignement au site d’injection en appliquant une légère pression sur la queue pendant environ 60 s.
10. Observer l’animal pendant 30 min à surveiller les effets secondaires systémiques et placer la souris dans sa cage après que l’animal a entièrement récupéré.

5. La microscopie intravitale

1. préparation
   1. Placer la souris anesthésiée sur le pad de la chaleur (37 ° C) pour garder une température constante et fixer les pattes en place avec du ruban adhésif.
   2. Désinfecter la peau à l’endroit de la jambe ou le flanc qui est utilisé pour la microscopie.
   3. Raser la région d’intérêt pour une meilleure manipulation et pour éviter toute interférence avec les cheveux.
   4. Exciser la peau avec un scalpel stérile et des pinces fines dans une zone carrée de 0,5 x 0,5 cm.
      Remarque : Il est important de garder la région d’intérêt humide ; dans le cas contraire, la qualité des images et des tissus sera compromise. Solution NaCl peut être utilisée pour humidifier le domaine.
   5. Placer la jambe entre deux timbres réglables et un couvercle en verre sur le dessus de ces timbres.
   6. S’assurer que le tissu est humide et en contact avec le verre.
   7. Inject 50 µL rhodamine dextran rétrooculaire dans le système veineux pour améliorer la visibilité des vaisseaux.
   8. Commencer la microscopie et ajustez la position de la jambe si nécessaire.
2. Paramètres de microscopie intravitale
   1. tourner sur le microscope, ordinateur, interfaces électroniques et les lasers.
   2. Allumez l’unité de chauffage de la chambre d’incubation et/ou chauffage étape (tampon) et régler la température à 37 ° C.
   3. Démarrer le logiciel d’acquisition. Si le microscope est équipé d’un scanner à résonant, sélectionnez ce mode de balayage rapide.
   4. Attendre jusqu'à ce que la température atteigne un niveau constant (35-37 ° C)
      Remarque : Une température stable est importante pour : (a) la souris, qui, sous anesthésie, ne peut pas contrôler sa température corporelle et dérive de focale (b) d’éviter ou au moins réduire. Cela peut prendre 1 h à plusieurs heures, selon les conditions ambiantes (p. ex., système d’air conditionné et le nombre de sources de chaleur dans la pièce, y compris les personnes). Si l'on utilise des objectifs à immersion, la zone de contact entre la lentille et couvercle en verre (ou tissu) est une source typique de l’instabilité. L’objectif de chauffage avec un radiateur objectif peut aider ; par ailleurs, un microscope avec un système de mise au point automatique est fortement recommandé.
   5. Sélectionner une lentille de grossissement avec une grande ouverture numérique qui satisfont aux exigences de la résolution de l’expérience (voir la note à la fin de cette section).
   6. Optimisation des réglages du microscope en ce qui concerne le gain, arrangements de la manche, vitesse de balayage, pixels, volume de profondeur, taille du pas et en moyenne avant de placer l’animal expérimental sur la scène.
   7. Scan pour réduire le temps d’acquisition de manière bidirectionnelle.
   8. Placer la souris anesthésiée sur la platine du microscope préchauffées après le microscope a atteint des conditions stables et les paramètres ont été testés à l’aide d’un mannequin.
   9. Donner la région d’intérêt au sein de la matrice de la membrane basale-comme le focus à l’aide de lumière éclairage et inspecter brièvement les capillaires par rayons ultraviolets avec des paramètres de filtre adéquat pour les fluorophores appliquées.
   10. Passer au mode ; balayage lancer la numérisation en mode basse résolution 256 x 256 et améliorer le gain et puissance de laser jusqu'à ce qu’un signal est observé sur le moniteur.
   11. Focus sur la structure d’intérêt. Effectuez un zoom avant jusqu'à ce que tous les détails sont visibles.
   12. Définir " lancer " et " fin " positions dans le sens axial.
   13. Arrêter le balayage.
   14. Définir pas à pas (par exemple, 0,5 µm) et nombre de plans focaux (p. ex., 10-20).
   15. Commutateur au pixel final de résolution (512 x 512 ou 1 024 x 1 024) selon la vitesse de déplacement des structures subcellulaires ou cellules et sélectionnez l’analyse vitesse (fréquence de balayage) qui correspond mieux aux mouvements. Bidirectionnelle à balayage est recommandé pour fixer l’acquisition de cheminées.
       Remarque : Sélectionnez le plus haut taux de balayage de balayage qui donne une qualité d’image suffisante. Point typique scanners offrent des vitesses comprises entre 400 Hz et 1,4 kHz. Résonance scanners offrent une supplémentaire 8 ou 12 kHz. En réduisant le nombre de lignes dans la direction y, la vitesse de balayage peut être encore augmentée (valeurs typiques sont de 512 x 512, 512 x 256 ou 512 x 200 pixels de résolution). Selon le rapport signal-bruit, on peut tenter d’améliorer la qualité de l’image en ajoutant la ligne en moyenne entre 2 et 4. En général, un cadre de 512 x 200 sans aucun résultat de calcul de la moyenne dans un laps de temps/acquisition de 18 ms en mode bidirectionnel avec un scanner résonance 8 KHz ; avec 512 x 200 et 4 x en moyenne, il ralentit jusqu'à 56 ms par frame.

Résultats

La microscopie intravitale pour l’examen de la tumeur et la croissance des vaisseaux collatéraux déclenchée par les monocytes peut aider à révéler de nouveaux aspects dans les mécanismes moléculaires de l’angiogenèse tumorale et arteriogenesis. Les cellules doivent être préparés et injecté avec soin en suivant les étapes du protocole. Différences peuvent conduire à des variations entre les expériences simples. Les monocytes doivent être injectés dans le système vei...

Discussion

La méthode décrite ici met en lumière le développement des artères collatérales, le comportement des monocytes dans ces vaisseaux et le processus d’arteriogenesis. Les mesures d’application du présent protocole sont faciles à apprendre et peut être utilisé dans d’autres domaines de la science. Malgré ces avantages, il y a quelques inconvénients. Par exemple, équipement microscopique est tenu d’exécuter les techniques décrites. Obtention de matériel pour une expérience n’est pas viable, il est d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% fetal calf serum (FCS)	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
1% penicillin/streptomycin	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
1mL Omnifix -F insuline syringe	B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany
50 ml syringe	Fresenius Kabi AG, Bad Homburg, Germany		Injectomat- syringe 50 ml with canule
6-well-ultra-low-attachement-plates	Corning Incorporated, NY, USA
8- 12 week old, male, C57BL/6, BalbC mice	Charles River, Sulzfeld, Germany
Adhesive tape	TESA SE, Hamburg, Germany
Acquisition Software	Leica, Wetzlar, Deutschland		Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF); Version: 2.7.3.9723
Canules	B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany		29G, 30G
Cell culture dish	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany
Cell culture medium	Manufactured by our group with single components		Medium199, 10% Fetal calf serum, 1% Antibiotic (penicillin/streptomycin)
Centrifuge	Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany		Allegra X-15R centrifuge
Depilatory cream	Veet, Mannheim, Germany
DiO	Invitrogen Eugene, Oregon, USA
Disinfection agent	Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany
Disposable scalpel No.10	Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan
EDTA	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Erlenmeyer flask	GVB, Herzogenrath, Germany
Ethanol 70%	Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany
Fetal Calf Serum	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Fine Forceps	Rubis, Stabio, Switzerland
Flurophor/Rhodamindextran	Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA	Katalognummer: D-1819
Gloves	Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany
Heating pad	Labotect GmbH, Göttingen, Germany		Hot Plate 062
Human macrophage-colony stimulating factor	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany	SRP3110
Humane leucocyte filters	Blood preservation
Incubator	Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany
Isoflurane	Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany
Ketamine (10%)	Ketavet, Pfizer Deutschland GmbH, Berlin , Germany
Leukocyte separation tubes (tubes with filter)	Bio one GmbH, Frickenhausen, Germany
Light microscope	Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany		Axiovert 40 C
Lymphocyte separation medium LSM1077	GE Healthcare, Pasching, Austria
Matrigel	Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA
Medium M199	PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria
Microbiological work bench	Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany		Hera safe
Microscope slide	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	Art. Nr. 1879
Microscope stand with incubator and heating unit	Leica DMI 6000, Pecon, Germany
Monocyte wash buffer	Manufactured by our group with single components		PBS, 0,5% BSA, 2mM EDTA
Mouse restrainer	Various
Multi-photon microscope	Leica, Wetzlar, Deutschland		Leica SP5 Confocal microscope, Cameleon, Coherent
NaCl (0,9%)	Berlin Chemie AG, Berlin, Germany
Neubauer counting chamber	Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany
Objective	Leica, Wetzlar, Deutschland		Leica HC PL APO 10x/0.4 CS
PBS	Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany		ph 7,4 sterile
Penicillin/Streptomycin	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Percoll	Manufactured by our group with single components		90 % Percoll, 10% 1,5M NaCl, ρ= 1,064 g cm-3
Percoll solution	GE Healthcare, Bio-Science AB, Uppsala, Sweden
Pipettes	Eppendorf AG, Hamburg, Germany		10µL/100µL/200µL/1000µL
Pipettes serological	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		Cellstar2ml, 5ml, 10ml
Pipetting heads	Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Pipetus	Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Polystyrol tube	Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany
Scissor	Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA
Scale	Mettler PM4800 Delta Range, Mettler-Toledo GmbH, Gießen, Germany
Suction unit	Integra bioscience, Fernwald, Germany		Vacusafe comfort
Surgical scissors	Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA
Trypan blue solution 0,4 %	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Tubes with cap	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		15ml, 50ml Cellstar
Xylazine (2 %)	Ceva Tiergesundheit GmbH, Düsseldorf, Germany