Intravital 현미경 Monocyte 유도 및 주변 동맥 질병의 Murine 모델에서 종양 관련 신생의

요약

Monocytes는 주변 동맥 질병의 맥락에서 arteriogenesis의 중요 한 중개자. 지하실 막 같은 매트릭스 및 intravital 현미경 검사 법을 사용 하 여,이 프로토콜 대 퇴 동맥 결 찰 murine 모델에 monocyte 주입 후 monocyte 유도 및 종양 관련 신생을 조사 합니다.

초록

주변 동맥 질환과 허 혈 성 심장 질환에 대 한 치료 목표 hemodynamic 협 착 증으로 인 한 허 혈 성 영역에 혈액 흐름을 증가 하는. 혈관 수술은 가능한 옵션을 선택한 경우에만 통증, 중요 한 사지 허 혈, 또는 생활에 주요 중단 휴식 또는 작업 진행 등 수술을 위한 표시 없이 환자에 대 한, 그들의 질병을 완화 하기 위해 몇 가지 가능성이 있다. 부수적인 형성의 자극을 통해 관류 monocyte 강화 통해 세포 치료 비-침략 적 몇 가지 옵션 중 하나입니다.

우리의 그룹 hindlimb 허 혈 모델을 사용 하 여 마우스에 monocyte 이식 후 arteriogenesis을 검사 합니다. 이전에 우리 hindlimb 관류 syngeneic monocyte 파상풍 자극이 식을 사용 하 여 향상을 증명 하고있다. 부수적인 형성에 효과 뿐만 아니라 종양의 성장 뿐만 아니라이 치료에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 이러한 효과 조사, 우리 후 대 퇴 동맥의 폐색, 마우스의 측면에 Engelbreth-Holm-떼 육의 기질을 주입 하 여 지하실 막 같은 매트릭스 마우스 모델을 사용 합니다.

인공 종양 연구 후 우리를 vivo에서 종양-신생 및 부수적인 동맥 내에서 귀환 하는 monocyte intravital 현미경 검사 법을 사용. 이전 연구는 사후 아티팩트에 후속 분석을 전제로 동물 모델의 조직학 검사를 설명 했습니다. 우리의 접근 지역 실시간으로 시퀀스에서 담보의 monocyte 유도 시각화, 수행, 쉽게 arteriogenesis 및 종양 혈관 신생 비보의 과정을 조사 하 고.

서문

심혈 관 질환, 관상 동맥 심장 질환 또는 말 초 동맥 질환을 포함 하 여 죽음의 가장 일반적인 원인은 세계적으로¹. 세포 치료 외과 중재를 받을 수 없는 사람들을 위해 특히 심혈 관 질환을 치료 하는 유망한 접근 이다. 치료 도구^2,3는 관류를 개선 하 고 허 혈 성 및 underperfused 조직의 기능을 유지 하는 전반적인 목표와 셀 또는 그들의 secreted를 사용 하 여 여러 접근이 있다. 이 목표를 달성 하기 위해 한 시도 arteriogenesis, 부수적인 동맥의 개발을 향상을 향상 시킬 것입니다. Monocytes는 담보와 관련 한 중요 한 세포 유형입니다. 우리의 그룹 허 혈 및 후속 염증⁶유도 hindlimb 허 혈 모델을 사용 하 여 특히 염증^4,5의 분야에서 monocytes의 효과 연구에 집중 했다. Monocytes 염증의 지역를 담보⁷의 개발을 이끌어 내는 복잡 한 조직 반응 일으킬 합니다.

Intravital 현미경 검사 법의 사용, 우리는 이러한 세포에 vivo에서 의 동작을 연구 하 고 염증의 지역에 주입된 monocytes의 추적 관찰 수 있습니다. 대부분의 이전 연구는만 사후 분석, 조직학 아티팩트 및 준비에 필요한 동물의 많은 수의 소개를 포함 하 여 단점을 보유 하 고 있는 설명 합니다. 우리의 접근, 우리 면역 프로세스를 조사할 수와 여러 시간 점에서 통해 부수적인 형성 라이브 이미징.

부수적인 동맥 허 혈 성 지역에서의 개발 이외 monocytes는 또한 종양의 성장 영향. 이러한 프로세스를 조사, 우리 Engelbreth-Holm-떼 마우스 육 종, 종양 세포 외 기질 단백질⁸, 풍부한에서 추출한 지하실 막 같은 매트릭스를 주사 하 고 intravital 현미경 검사 법을 사용 하 여 분석. 이 행렬은 내 피 세포 네트워크 형성 또는 신생 억제;을 통해 항 암 치료에 대 한 스크린 테스트 분자에 사용 이 경우에, 우리는 세포 치료^9,,1011monocytes의 종양 신생 잠재력을 평가할 것입니다.

이 프로토콜의 목표는 vivo에서 모델에서 허 혈에 의해 발생 하는 면역 과정을 공부 하는 간단 하 고 효율적인 방법을 보여 줍니다. 우리는 사후 근육 조직의 조직학 검사 결과에 비해 더 현실적인 테스트 환경을 생성할 수 있습니다.

프로토콜

우리의 연구 동물 보호에 대 한 독일 법의 섹션 8에 따라 작센-안할트, Landesverwaltungsamt 할리 상태의 권한으로 수행 되었다. (§ 8, 18.05.2016-BGBI에서에서 동물 보호에 대 한 독일 법의 단락 1. 나 S. 1206, 1313, 13.08.2013에서 § 31 TierSchVersV).

참고: 여기 실험에 대 한 8 12 주 오래 된 남성 BALB/c 마우스 사용 되었다, 및 혈액 기증자 로부터 인간 monocytes intravital 현미경 검사 법을 통해 monocytes의 시각화를 위해 사용 되었다.

1. 셀 준비

참고: monocytes의 격리를 참조 하십시오 우리의 이전 게시 된 비디오 정돈에 지침에 대 한: " 절연 및 정 맥 주입의 Murine 골 파생 Monocytes " 바그너 외. 여 ⁴

참고: 때 셀 모든 단계 작업 것이 오염을 피하기 위하여 살 균 되어야 합니다.

1. 셀 3, 3으로 얼룩 '-Dioctadecyloxacarbocyanine 과염소산염
   1. Resuspend 1 x 10 ⁶ 셀/mL의 농도와 혈 청 무료 문화 매체에 셀.
      참고:만 혈 청 자유로운 매체 수는 효율적인 얼룩, 닥터지 염료 이미 혈 청의 질 성 구성 요소에 의해 캡처 그렇지 않으면 것 때문.
   2. 1 m m 3, 3의 추가 5 µ L '-Dioctadecyloxacarbocyanine 과염소산염 dimethylformamide 셀 서 스 펜 션의 1 ml에 신중 하 게 resuspend와.
   3. 품 20 분 동안 37 ° C에서 셀 솔루션
   4. 37 ° C에서 5 분에 대 한 500 x g 세포를 원심
   5. 는 상쾌한을 꺼내 려 하 고 37 ° C 따뜻한 태아 종 아리 보충 하는 혈 청 매체와 셀 resuspend.
   6. 1.1.4와 1.1.5 단계를 반복 하 여 두 번.
   7. 수식 가진 셀의 개수:
      
   8. 150 µ L 살 균 0.9 %NaCl 용액으로 세포를 resuspend.
   9. 꼬리 정 맥에 주입 셀.

2. 마 취

1. 흡입 마 취
   1. isoflurane 화학 안전 후드 닫힌된 빈에 5%의 농도 사용 하 여 기화 기의 도움으로 증발.
   2. 마우스를 신중 하 게 처리 하 고 빈에 넣어.
   3. 이동 중지 되었습니다 후 후부 목의 피부에 의해 동물 처리.
2. 복 마 취
   참고: 사용 isoflurane 마 취, 단계 2.1, 복 주사를 수행 하려면 아래 설명 된. 빠른 복구와 isoflurane 마 취의 짧은 연기 마약 효과, 마우스를 처리 하 여 복 마 취 주사 쉽습니다.
   1. 2.4 mL 마 취 제 (10%), 0.8 mL Xylazine (2%), 및 6.8 mL NaCl (0.9%)의 솔루션을 사용 하 여 복 주입을 위해.
   2. 무게 동물 마 취 제를 적용 하기 전에.
      참고: 마 취에 대 한 공식 이다:
      
   3. 30g 바늘 1 mL 인슐린 주사기를 사용 하 여 왼쪽된 하복 부에 주입 솔루션.
   4. 마우스의 장에 놓고 마약 효과 기다립니다.
      참고: 마약 효과 일반적으로 나타납니다 5 분 이내 주사 된 경우. 마 취의 정확한 깊이 뚜껑 반사 또는 발가락을 꼬집어, 반응 없는 호흡의 일반, 제어 속도 의해 결정 수 있습니다.

3. 지하실 막 같은 매트릭스의 주입

참고:이 메서드는 monocyte 주입 후 종양 혈관 신생 연구 우리의 그룹에 의해 사용 됩니다. 실험에 따라 성장 요인 지하실 막 같은 매트릭스를 추가할 수 있습니다. 우리는 마우스의 측면에서 종양을 주입 하기 전에 대 퇴 동맥 결 찰을 수행. 매트릭스는 주입을 위해 4 ° C의 온도가지고 있어야 합니다. 이 온도에, 행렬은 액체; 젤은 체온 (37 ° C)에 고체를 견고 하 게. 피하 매트릭스의 더 나은 시정을 위한 플러그, 사출 사이트에서 마우스의 피부를 면도.

참고: 옵션: 추가 100 ng 기본적인 섬유 아 세포 성장 인자, 300 ng 혈관 내 피 성장 인자, 및 지하실 막 같은 매트릭스를 무 균 조건 하에서 26 I.U. 덤플링을.

1. 30 G 인슐린 주사기를 얼음에 저장소 사용까지 매트릭스의 1 mL 로드.
2. 동물 테이블에 누워 누르고 있으면 마우스의 피부 측면에 주사 부 옆.
3. 지하실 막 같은 매트릭스의 500 µ L를 피하 주사.
   주: 실제적인 이유를 위해 그것은 피하 분산을 피하기 위해 한 위치에서 조밀 하 게 지하실 막 같은 매트릭스를 삽입 하는 데 필요한. 실험의 끝에 마우스를 희생 후 조직에서 인공 종양을 꺼내 려 하는 것이 쉬울 것 이다.

4. 정 맥 주입 꼬리

참고: 꼬리 정 맥 주입 실험 하기 전에 시험 동물에 NaCl 솔루션 연습. Monocytes는 적절 하 게 꼬리 정 맥에 주입 수 없습니다, 아무 조직의 효과 담보에 있을 것입니다. 이 프로토콜에서 2.5 백만 monocytes 주입 하 고. Bodyweight의 더 이상 5 µ L/g를 주사 하려고.

1. 준비 단계 1.1.8 2.5 백만 monocytes를 포함 하는 monocyte 솔루션을 사용 하 여.
2. 30g 바늘과 1 mL 인슐린 주사기를 사용 하 여 주입을 위해.
3. 신중 하 게 마우스를 처리, restrainer에서 동물을 제 지 하 고 마우스 감염 되지 및 호흡에 대 한 충분 한 공간이 있는지 확인 하십시오.
4. 꼬리 접시에 게 연락할 수 있도록 난방 패드는 restrainer 넣어.
5. 꼬리 정 맥, 꼬리의 측면에 있는 식별.
6. 90 °, 꼬리 꼬리 정 맥 꼬리의 위 부분에 나타나도록 설정.
7. 주입 사이드는 monocytes를 주입 하기 전에 소독.
8. 세를 직면 하는 바늘의 경사와 평면 각도에 monocyte 솔루션을 주입 하려고
   참고: 중지 주사 물집이 나타나면 이것이 실패 한 주입의 징조. 절차를 다시 시도 더 proximally.
9. 주사 사이트에서 약 60에 대 한 꼬리에 부드러운 압력을 적용 하 여 출혈을 멈추게.
10. 을 조직의 부작용에 대 한 모니터링 마우스 그것의 감 금에 있는 동물에는 완 치 후 30 분 동안 동물 관찰.

5. Intravital 현미경

1. 준비
   1. 접착 테이프를 가진 일정 한 온도 유지 하 고 자리에는 발을 해결을 열 패드 (37 ° C)에 마 취 마우스를 놓습니다.
   2. 다리 또는 현미경에 사용 되는 측면의 사이트에서 피부를 소독.
   3. 머리 간섭을 유발 하지 않도록 더 나은 처리에 대 한 관심의 영역을 면도.
   4. 삭제할 살 균 메스와 0.5 x 0.5 cm의 사각형 영역에 미세 집게 피부.
      참고: 그것은 촉촉한; 관심 영역을 유지 하는 것이 중요 그렇지 않으면, 이미지와 조직의 품질 손상 될 것 이다. NaCl 솔루션 영역을 축 축 하 게 사용할 수 있습니다.
   5. 두 조정 가능한 우표 사이 다리를 놓고 우표 위에 커버 글라스를 위치.
   6. 조직과 젖어 유리 접촉 확인.
   7. Inj혈관의 더 나은 시정을 위한 정 맥 체계로 요법 50 µ L rhodamine dextran retrobulbar.
   8. 현미경 검사 법을 시작 하 고 필요한 경우 다리의 위치를 조정.
2. Intravital 현미경 설정
   1. 현미경, 컴퓨터, 전자 인터페이스와 레이저.
   2. 보육 실의 난방 단위 설정 또는 난방 (플레이트/패드), 무대 설정 온도 37 ° c.
   3. 수집 소프트웨어를 시작합니다. 현미경 공명 스캐너를 갖춘 경우이 빠른 스캐닝 모드 선택.
   4. 온도가 일정 수준 (35-37 ° C) 도달할 때까지 기다렸다가
      참고: 안정 온도 대 한 중요 하다: (a) 마우스, 마 취의 밑에 그것의 온도, 및 (b) 피하 또는 적어도 최소화 초점 드리프트를 제어할 수 없습니다. 이 주변 조건 (예를 들어, 에어컨 시스템 및 사람들을 포함 한 방에 열원 수)에 따라 몇 시간 1 시간을 걸릴 수 있습니다. 침수 목적 사용 하는 경우 렌즈와 커버 유리 (또는 조직) 사이의 접촉 영역 불안정의 전형적인 소스입니다. 렌즈는 객관적인 히터 난방 도움이 될 수 있습니다; 또는, 자동 초점 시스템 현미경 좋습니다.
   5. 실험의 확인 요구 사항을 충족 높은 숫자 조리개와 확대 렌즈 선택 (이 섹션의 끝에 참고).
   6. 이득, 채널 설정, 검사 속도, 픽셀 해상도, 깊이 볼륨, 스텝 크기 및 단계에 실험 동물을 배치 하기 전에 평균 현미경 설정을 최적화.
   7. 수집 시간을 줄이기 위해 양방향으로 스캔.
   8. 현미경에는 안정적인 상태에 도달 했습니다 및 설정을 dummy의 도움으로 테스트 후 마 취 마우스 prewarmed 현미경 스테이지에 배치.
   9. 관심 영역 지하실 막 같은 매트릭스 내의 초점으로 밝은 빛 조명 사용 하 여 가져오고 간단히 적용된 fluorophores에 대 한 적절 한 필터 설정으로 자외선에 의해 모 세관 검사.
   10. 스캐닝 모드; 전환 낮은 해상도 256 x 256 모드에서 검색을 시작 하 고 이득을 강화 하 고 레이저 출력 신호 모니터에 관찰 때까지.
   11. 관심의 구조에 초점입니다. 모든 세부 사항을 볼 수 있습니다 때까지 확대.
   12. 정의 " 시작 " 및 " 끝 " 축 방향에 위치.
   13. 검색 중지.
   14. 스테핑 크기 (예를 들어, 0.5 µ m) 및 초점 비행기 (예를 들어, 10-20)의 수 정의.
   15. 스위치 이동 subcellular 구조 또는 셀 선택 검사의 속도 따라 최종 픽셀 해상도 (512 x 512 또는 1024 x 1024) 속도 (스캔 주파수) 움직임에 가장 맞는. 스택의 인수를 고정 권장 양방향 검색.
       참고: 충분 한 이미지 품질을 제공 하는 검색의 높은 스캔 속도 선택 합니다. 전형적인 포인트 스캐너 400 Hz 및 1.4 kHz 사이 속도 제공합니다. 공 진 스캐너 추가 8 kHz 또는 12 kHz를 제공합니다. Y-방향으로 줄 수를 줄이면, 스캔 속도 증가 될 수 있다 추가 (일반적인 값은 512 x 512, 512 x 256 또는 512 x 200 픽셀 해상도). 신호 대 잡음 비율에 따라 하나 2와 4 사이 평균 라인을 추가 하 여 이미지 품질을 개선 하기 위해 시도할 수 있습니다. 일반적으로, 8 KHz 공명 스캐너; 양방향 모드에서 18 ms의 인수 시간/프레임에 결과 없이 평균 512 x 200의 설정 512 x 200과 x 평균 4 프레임 당 56 ms 아래로 느려집니다.

결과

Intravital 현미경 종양 성장과 부수적인 선박 monocytes에 의해 실행의 시험에 대 한 종양 혈관 신생 및 arteriogenesis의 분자 메커니즘에 새로운 측면을 보여줄 수 있습니다. 셀 준비 되어야 하 고 신중 하 게 프로토콜의 단계를 사용 하 여 주입. 차이 단일 실험 사이 변이 발생할 수 있습니다. 정 맥 시스템 (그림 1) 조직의 효과 유지 하 고 주입 동맥 시스템에...

토론

여기 설명 하는 방법을 부수적인 동맥의 개발이이 선박에 monocytes의 동작 및 arteriogenesis의 과정에 빛이 나. 이 프로토콜을 적용 하기 위한 단계는 쉽게 학습과 과학의 다른 분야에서 사용 될 수 있습니다. 이러한 장점에도 불구 하 고 몇 가지 단점이 있다. 예를 들어, 현미경 장비 설명된 기법을 실행 해야 합니다. 한 실험에 대 한 장비를 얻는 하는 것은 장치를 공유 하는 다른 기관과 협력 하는 것이...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% fetal calf serum (FCS)	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
1% penicillin/streptomycin	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
1mL Omnifix -F insuline syringe	B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany
50 ml syringe	Fresenius Kabi AG, Bad Homburg, Germany		Injectomat- syringe 50 ml with canule
6-well-ultra-low-attachement-plates	Corning Incorporated, NY, USA
8- 12 week old, male, C57BL/6, BalbC mice	Charles River, Sulzfeld, Germany
Adhesive tape	TESA SE, Hamburg, Germany
Acquisition Software	Leica, Wetzlar, Deutschland		Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF); Version: 2.7.3.9723
Canules	B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany		29G, 30G
Cell culture dish	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany
Cell culture medium	Manufactured by our group with single components		Medium199, 10% Fetal calf serum, 1% Antibiotic (penicillin/streptomycin)
Centrifuge	Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany		Allegra X-15R centrifuge
Depilatory cream	Veet, Mannheim, Germany
DiO	Invitrogen Eugene, Oregon, USA
Disinfection agent	Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany
Disposable scalpel No.10	Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan
EDTA	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Erlenmeyer flask	GVB, Herzogenrath, Germany
Ethanol 70%	Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany
Fetal Calf Serum	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Fine Forceps	Rubis, Stabio, Switzerland
Flurophor/Rhodamindextran	Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA	Katalognummer: D-1819
Gloves	Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany
Heating pad	Labotect GmbH, Göttingen, Germany		Hot Plate 062
Human macrophage-colony stimulating factor	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany	SRP3110
Humane leucocyte filters	Blood preservation
Incubator	Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany
Isoflurane	Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany
Ketamine (10%)	Ketavet, Pfizer Deutschland GmbH, Berlin , Germany
Leukocyte separation tubes (tubes with filter)	Bio one GmbH, Frickenhausen, Germany
Light microscope	Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany		Axiovert 40 C
Lymphocyte separation medium LSM1077	GE Healthcare, Pasching, Austria
Matrigel	Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA
Medium M199	PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria
Microbiological work bench	Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany		Hera safe
Microscope slide	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	Art. Nr. 1879
Microscope stand with incubator and heating unit	Leica DMI 6000, Pecon, Germany
Monocyte wash buffer	Manufactured by our group with single components		PBS, 0,5% BSA, 2mM EDTA
Mouse restrainer	Various
Multi-photon microscope	Leica, Wetzlar, Deutschland		Leica SP5 Confocal microscope, Cameleon, Coherent
NaCl (0,9%)	Berlin Chemie AG, Berlin, Germany
Neubauer counting chamber	Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany
Objective	Leica, Wetzlar, Deutschland		Leica HC PL APO 10x/0.4 CS
PBS	Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany		ph 7,4 sterile
Penicillin/Streptomycin	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Percoll	Manufactured by our group with single components		90 % Percoll, 10% 1,5M NaCl, ρ= 1,064 g cm-3
Percoll solution	GE Healthcare, Bio-Science AB, Uppsala, Sweden
Pipettes	Eppendorf AG, Hamburg, Germany		10µL/100µL/200µL/1000µL
Pipettes serological	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		Cellstar2ml, 5ml, 10ml
Pipetting heads	Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Pipetus	Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Polystyrol tube	Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany
Scissor	Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA
Scale	Mettler PM4800 Delta Range, Mettler-Toledo GmbH, Gießen, Germany
Suction unit	Integra bioscience, Fernwald, Germany		Vacusafe comfort
Surgical scissors	Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA
Trypan blue solution 0,4 %	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Tubes with cap	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		15ml, 50ml Cellstar
Xylazine (2 %)	Ceva Tiergesundheit GmbH, Düsseldorf, Germany