Intravitalen Mikroskopie Monocyte Homing und Tumor-bezogene Angiogenese in einem Mausmodell der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit

Zusammenfassung

Monozyten sind wichtige Vermittler des Arteriogenesis im Rahmen der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit. Mit einem Basalmembran-wie Matrix und intravitalen Mikroskopie, untersucht dieses Protokoll Monocyte homing und im Zusammenhang mit Tumor-Angiogenese nach Monocyte-Injektion in die Femoral Arterie Ligatur Mausmodell.

Zusammenfassung

Das therapeutische Ziel für periphere arterielle Verschlusskrankheit und ischämischen Herzkrankheiten soll Blutfluss auf ischämische Bereiche durch hämodynamische Stenose verursacht zu erhöhen. Gefäßchirurgie ist ein gangbarer Weg in ausgewählten Fällen, sondern für Patienten ohne Indikation für eine Operation wie Fortschreiten zum Ausruhen, Schmerzen, kritische Extremität Ischämie oder größeren Störungen zum Leben oder arbeiten, gibt es nur wenige Möglichkeiten zur Linderung ihrer Krankheit. Zelltherapie über Monocyte-verbesserte Durchblutung durch die Stimulierung der Sicherheiten Bildung ist eine der wenigen nicht-invasive Optionen.

Unsere Gruppe untersucht Arteriogenesis nach der Monocyte Transplantation in Mäuse mit dem Megalosauridae Ischämie-Modell. Wir haben zuvor, Verbesserung der Megalosauridae Perfusion mit Tetanus-stimulierten Phänomen Monocyte Transplantation gezeigt. Neben den Effekten auf die Sicherheiten Bildung könnte diese Therapie sowie Tumorwachstum betroffen sein. Um diese Effekte zu untersuchen, verwenden wir eine Basalmembran-wie Matrix-Maus-Modell durch die Injektion der extrazellulären Matrix von Engelbreth-Holm-Schwarm-Sarkom in der Flanke der Maus, nach Okklusion der Femoral Arterie.

Nach dem Studium der künstlichen Tumor wir verwenden intravitalen Mikroskopie in Vivo Tumor-Angiogenese und Monocyte homing in Sicherheiten Arterien zu studieren. Frühere Studien haben die histologische Untersuchung von Tiermodellen, beschrieben die anschließende Analyse zu Post-Mortem- Artefakten voraussetzt. Unser Ansatz Monocyte Homing auf Bereiche der Besicherung in Echtzeit Sequenzen visualisiert, ist einfach durchzuführen, und den Prozess der Arteriogenesis und Tumor Angiogenesis in Vivountersucht.

Einleitung

Herz-Kreislauf-Krankheiten, einschließlich koronarer Herzkrankheit oder periphere arterielle Verschlusskrankheit, sind die häufigsten Todesursachen weltweit¹. Zelltherapie ist ein vielversprechender Ansatz zur Behandlung von Herz-und Kreislauferkrankungen, insbesondere für Menschen, die nicht in der Lage, chirurgische Eingriffe zu unterziehen sind. Es gibt mehrere Ansätze, Zellen oder ihre sekretierten Stoffe als therapeutisches Werkzeug^2,3, mit dem übergeordneten Ziel, verbessern die Durchblutung und Funktion des ischämischen und underperfused Gewebe zu verwenden. Ein Versuch, dieses Ziel zu erreichen ist, Arteriogenesis, zu verbessern, die die Entwicklung von Sicherheiten Arterien erhöht. Monozyten sind ein wichtiger Zelltyp Besicherung zugeordnet. Unsere Gruppe konzentrierte sich auf die Erforschung der Wirkung von Monozyten in Bereichen der Entzündung^4,5, insbesondere mit dem Megalosauridae Ischämie Modell induzieren Ischämie und anschließende Entzündung⁶. Monozyten nach Hause zu Bereichen der Entzündung und führen komplexe systemische Reaktionen, die zur Entwicklung der Besicherung⁷führen.

Mit dem Einsatz der intravitalen Mikroskopie wir untersuchen das Verhalten von diesen Zellen in Vivo und der Homing von injizierten Monozyten zu Bereichen der Entzündung zu beobachten. Die meisten frühere Studien beschreiben nur post-mortem Analysen, die Nachteile einschließlich einer Einführung der histologische Artefakte und eine große Zahl des Tieres für Vorbereitungen erforderlich halten. Mit unserem Ansatz können wir untersuchen, immunologische Prozesse und Sicherheiten Bildung über live imaging zu mehreren Zeitpunkten.

Neben der Entwicklung von Sicherheiten Arterien in ischämische Bereiche beeinflussen Monozyten auch Tumorwachstum. Um diese Prozesse zu untersuchen, wir Spritzen eine Basalmembran-ähnliche Matrix aus Engelbreth-Holm-Schwarm Maus Sarkom, ein Tumor reiche extrazelluläre Matrix Proteine⁸, extrahiert und analysieren mit intravitalen Mikroskopie. Diese Matrix wird für Endothelzellen Netzwerkbildung oder Anti-Krebs-Therapien durch Hemmung der Angiogenese zu Probeaufnahmen Moleküle verwendet; in diesem Fall werden wir das Tumor angiogenen Potenzial von Monozyten für Zelle Therapie^9,10,11bewerten.

Dieses Protokoll soll eine einfache und effiziente Möglichkeit, immunologische Prozesse verursacht durch Ischämie in einem in Vivo Modell zu studieren nachgewiesen werden. Wir erzeugen eine realistische Testumgebung im Vergleich zur histologischen Aufarbeitung von post-mortem Muskelgewebe.

Protokoll

unserer Studie wurde durchgeführt mit freundlicher Genehmigung des Landes Sachsen-Anhalt, Landesverwaltungsamt Halle gemäß § 8 des deutschen Rechts für den Tierschutz. (§ 8 Abs. 1 des deutschen Gesetzes für den Tierschutz aus 18.05.2016 - BGBI. BGBl. I S. 1206, 1313, § 31 TierSchVersV aus 13.08.2013).

Hinweis: für die Experimente hier 8 bis 12 Wochen alten männlichen BALB/c Mäuse waren und menschlichen Monozyten von Blutspendern wurden verwendet für die Visualisierung von Monozyten über intravitalen Mikroskopie.

1. Zelle Vorbereitung

Hinweis: für die Isolierung von Monozyten, finden Sie in unserem früheren veröffentlichten Video zu Jupiter Anweisungen: " Isolation und intravenöse Injektion von murinen Knochenmark abgeleitet Monozyten " von Wagner Et Al. ⁴

Hinweis: Wenn alle Arbeitsschritte mit den Zellen zur Vermeidung von Kontaminationen steril sein muss.

1. Zelle färben mit 3,3 '-Perchlorat Dioctadecyloxacarbocyanine
   1. Aufschwemmen der Zellen im Serum freien Kulturmedium mit einer Dichte von 1 x 10 ⁶ Zellen/mL.
      Hinweis: Nur Serum freie Medium ermöglicht eine effiziente Färbung, da der lipophile Farbstoff von lipophilen Komponenten des Serums sonst bereits erfasst werden würde.
   2. Hinzufügen 5 µL 1 mM 3,3 '-Dioctadecyloxacarbocyanine Perchlorat in Dimethylformamid, 1 mL Zellsuspension und sorgfältig Aufschwemmen.
   3. Inkubation der Zelle-Lösung bei 37 ° C für 20 min.
   4. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 37 ° C und 500 X g für 5 min.
   5. Den Überstand zu verdrängen und die Zellen mit 37 ° C warmen fetalen Kalb Serum ergänzt Medium Aufschwemmen.
   6. Wiederholen Sie die Schritte 1.1.4 und 1.1.5 zweimal.
   7. Zählen die Zellen mit der Formel:
      
   8. die Zellen mit 150 µL steriler 0,9 % NaCl-Lösung Aufschwemmen.
   9. Der Zellen in die Rute Vene injizieren.

2. Narkose

1. Inhalation Narkose
   1. verdampfen Isofluran mit Hilfe eines Vaporizers mit einer Konzentration von 5 % in einen geschlossenen Behälter unter einer Haube Chemikaliensicherheit.
   2. Die Maus vorsichtig handhaben und steckte ihn in den Papierkorb.
   3. Das Tier durch die Haut des Halses posterior zu behandeln, nachdem es aufgehört hat sich zu bewegen.
2. Intraperitoneal Anästhesie
   Hinweis: Verwendung Isoflurane Narkose, beschrieben unter Schritt 2.1, eine intraperitoneale Injektion durchführen. Mit der schnellen Erholung und kurzwirksamen narkotische Wirkung der Isoflurane Narkose ist es einfacher zu handhaben die Maus und intraperitoneale Anästhesie zu injizieren.
   1. Eine Lösung von 2,4 mL Ketamin (10 %), 0,8 mL Xylazin (2 %) und 6,8 mL NaCl (0,9 %) für die intraperitoneale Injektion verwenden.
   2. Wiegen das Tier vor der Narkose Anwendung.
      Hinweis: Die Formel für die Narkose ist:
      
   3. eine 1 mL Spritze mit Insulin mit einer 30 G-Nadel, um die Lösung in den linken Unterbauch zu injizieren verwenden.
   4. Platzieren Sie den Mauszeiger in seinem Käfig und narkotische Wirkung warten.
      Hinweis: Die narkotische Wirkung erscheint normalerweise innerhalb von 5 min wenn die Injektion erfolgreich war. Die richtige Tiefe der Narkose kann durch das Fehlen der Deckel Reflex oder Reaktion auf Zehe Prise sowie einer regelmäßigen, kontrollierten Rate der Atmung bestimmt werden.

3. Implantation von Basalmembran-ähnliche Matrix

Hinweis: Diese Methode wird verwendet von unserer Fraktion, um Tumor-Angiogenese nach Monocyte Injektion zu studieren. Je nach den Experimenten können die Basalmembran-ähnliche Matrix Wachstumsfaktoren hinzugefügt werden. Wir führten Femoral Arterie Ligatur vor der Injektion des Tumors in der Flanke der Maus. Die Matrix muss eine Temperatur von 4 ° C für die Injektion. Bei dieser Temperatur ist die Matrix Flüssigkeit; das Gel härtet zu einem festen bei Körpertemperatur (37 ° C). Zur besseren Sichtbarkeit der subkutane Matrix stecken, rasieren, die Haut der Maus an der Injektionsstelle.

Hinweis: Optional: Fügen Sie 100 ng grundlegende Fibroblasten-Wachstumsfaktor, 300 ng vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor und 26 IE Heparin unter sterilen Bedingungen der Basalmembran-ähnliche Matrix.

1. 1 mL der Matrix in einer 30 G Insulin Spritze und speichern auf Eis bis zum Gebrauch laden.
2. Das Tier auf den Tisch legen und halten Sie die Haut der Maus neben der Einstichstelle an der Flanke.
3. Injizieren 500 µL der Basalmembran-ähnliche Matrix subkutan.
   Hinweis: Aus praktischen Gründen ist es notwendig, die Basalmembran-ähnliche Matrix kompakt an einem Ort, subkutane Streuung zu vermeiden zu injizieren. Es wird leichter sein, die künstliche Tumor aus dem Gewebe zu entfernen, nach Opfern der Maus am Ende des Experiments.

4. Vene Injektion Tail

Hinweis: üben Sie die Rute Vene Injektion mit NaCl-Lösung auf Versuchstiere vor Experimenten. Wenn die Monozyten können nicht ausreichend in die Rute Vene injiziert werden, werden keine systemische Wirkung auf die Besicherung. In diesem Protokoll injiziert wir 2,5 Millionen Monozyten. Versuchen Sie, nicht mehr als 5 µL/g Körpergewicht Spritzen.

1. Die Monocyte-Lösung unter Schritt 1.1.8 mit 2,5 Millionen Monozyten vorbereitet.
2. 30 G Nadel und eine 1 mL Insulin Spritze für die Injektion verwenden.
3. Sorgfältig behandeln die Maus, das Tier in die Restrainer zurückhalten und sicherstellen, dass die Maus nicht geschädigt und hat ausreichend Platz zum Atmen.
4. Das Heizkissen die Restrainer aufsetzen, so dass das Heck die Platte kontaktieren kann.
5. Identifizieren die Rute Venen, die an der lateralen Seite des Hecks befinden.
6. Das Heck 90 ° drehen, so die Rute Vene auf der Oberseite der Rute erscheint.
7. Desinfizieren der Spritzseite vor der Injektion der Monozyten.
8. Versuchen, die schräge der Nadel mit Blick auf die Monocyte-Lösung in einem flachen Winkel spritzen
   Hinweis: Stoppen der Injektion, erscheint eine Blase, da dies ein Zeichen für eine fehlerhafte Injektion. Versuchen Sie erneut, das Verfahren mehr proximal.
9. Blutungen an der Injektionsstelle durch sanften Druck auf die Rute für ca. 60 s.
10. Beobachten das Tier für 30 min für systemische Nebenwirkungen überwachen und platzieren Sie den Mauszeiger in seinem Käfig, nachdem das Tier vollständig erholt hat.

5. Intravitalen Mikroskopie

1. Vorbereitung
   1. die narkotisierten Maus auf das Heizkissen (37 ° C) zu halten eine konstante Temperatur und fixieren Sie die Pfoten mit Klebeband zu platzieren.
   2. Desinfizieren Sie die Haut an der Stelle des am Bein oder Flanke, die für die Mikroskopie verwendet wird.
   3. Die Region von Interesse für ein besseres Handling und zur Vermeidung von Interferenzen mit Haare zu rasieren.
   4. Verbrauchsteuern die Haut mit einem sterilen Skalpell und feine Pinzette in eine quadratische Fläche von 0,5 x 0,5 cm.
      Hinweis: Es ist wichtig, die Region von Interesse feucht zu halten; Andernfalls wird die Qualität der Bilder und Gewebe beeinträchtigt. NaCl-Lösung kann verwendet werden, um das Gebiet befeuchten.
   5. Das Bein zwischen zwei verstellbaren Stempel platzieren und positionieren Sie ein Deckglas auf den Briefmarken.
   6. Sicherzustellen, dass das Gewebe nass und steht in Kontakt mit dem Glas.
   7. Inject 50 µL Rhodamin Dextran retrobulbären in das venöse System für bessere Sichtbarkeit der Schiffe.
   8. Mikroskopie zu starten und passen Sie die Position des Beines, wenn nötig.
2. Intravitalen Mikroskopie Einstellungen
   1. schalten Sie das Mikroskop, Computer, elektronische Schnittstellen und Laser.
   2. Schalten Sie die Heizeinheit Inkubation Kammer und/oder Heizung (Platte/Pad) zu inszenieren, und stellen Sie die Temperatur auf 37 ° c
   3. Starten Sie die Software zur Datenerfassung. Wenn das Mikroskop mit einem Resonanz-Scanner ausgestattet ist, wählen Sie diesen schnellen Scan Modus.
   4. Warten, bis die Temperatur konstant (35-37 ° C) erreicht
      Hinweis: Eine stabile Temperatur ist wichtig, dass: (a) die Maus, die Narkose seine Körpertemperatur und (b) vermeiden oder zumindest minimieren fokale Drift nicht kontrollieren kann. Dies kann bis zu mehreren Stunden, je nach den Umgebungsbedingungen (z.B., Klimaanlage und die Anzahl der Wärmequellen im Raum, einschließlich Menschen) 1 h dauern. Wenn eintauchen Ziele verwendet werden, ist die Kontaktzone zwischen Objektiv und Deckglas (oder Gewebe) eine typische Ursache für Instabilität. Das Objektiv mit einer objektiven Heizung Heizung kann helfen; Alternativ ein Mikroskop mit einem Autofokus-System ist sehr zu empfehlen.
   5. Wählen Sie eine Vergrößerung Objektiv mit einer hohen Zahl Blende das erfüllt die Anforderungen der Auflösung des Experiments (siehe Hinweis am Ende dieses Abschnitts).
   6. Die Mikroskop-Einstellungen in Bezug auf Gewinn, Kanaleinstellungen, Scan-Geschwindigkeit, Pixelauflösung, Tiefe Volumen, Schrittgröße und bevor man das Versuchstier auf der Bühne mit durchschnittlich optimieren.
   7. Scannen bidirektional Erfassungszeit reduzieren.
   8. Die narkotisierten Maus auf die vorgewärmte Mikroskoptisch zu platzieren, nachdem das Mikroskop stabile Verhältnisse erreicht hat und die Einstellungen wurden mit Hilfe von einem Dummy getestet.
   9. Bringen die Region von Interesse innerhalb der Basalmembran-ähnliche Matrix in den Fokus, indem helle Beleuchtung und überprüfen Sie kurz die Kapillaren durch UV-Licht mit angemessenen Filtereinstellungen für die angewandte Fluorophore.
   10. Schalten Sie den Scan-Modus; starten Sie den Scanvorgang bei niedriger Auflösung 256 x 256 Mode und Gewinn steigern und Laserleistung, bis ein Signal auf dem Monitor beobachtet wird.
   11. Fokus auf die Struktur von Interesse. Vergrößern Sie, bis alle Details sichtbar sind.
   12. Definieren " start " und " Ende " Positionen in Axialrichtung.
   13. Suchlauf.
   14. Definieren stepping Größe (z. B. 0,5 µm) und Anzahl der fokalen Flächen (z.B. 10-20).
   15. Schalter auf die endgültige Pixelauflösung (512 x 512 oder 1.024 x 1.024) abhängig von der Geschwindigkeit der bewegten subzellulären Strukturen oder Zellen und wählen Sie die Scan-Geschwindigkeit (Abtastrate), die am besten zu den Sätzen. Bidirektionale Scannen wird empfohlen, den Erwerb von Stacks befestigen.
       Hinweis: Wählen Sie die höchste Scan-Rate von Scannen, die ausreichende Bildqualität gibt. Typischen Point Scanner bieten Geschwindigkeiten von 400 Hz bis 1,4 kHz. Resonanz-Scanner bieten eine zusätzliche 8 kHz oder 12 kHz. Durch die Reduzierung der Anzahl der Zeilen in y-Richtung, die Abtastrate kann weiter erhöht werden (typische Werte sind 512 x 512, 512 x 256 oder 512 x 200 Pixelauflösung). Je nach Signal-Rausch-Verhältnis kann man versuchen, die Bildqualität zu verbessern, indem Sie Zeile durchschnittlich zwischen 2 und 4. In der Regel eine Einstellung von 512 x 200 ohne Mittelung Ergebnisse in einem Erwerb/Zeitrahmen von 18 ms im bidirektionalen Modus mit einem 8 KHz Resonanz-Scanner; mit 512 x 200 und 4 x durchschnittlich, es verlangsamt bis 56 ms pro Bild.

Ergebnisse

Intravitalen Mikroskopie zur Untersuchung von Tumor und Sicherheiten Behälterwachstum ausgelöst durch Monozyten kann helfen, neue Aspekte in die molekularen Mechanismen der Tumor-Angiogenese und Arteriogenesis zeigen. Zellen müssen vorbereitet sein und sorgfältig mit den Schritten des Protokolls injiziert. Unterschiede führen zu Abweichungen zwischen den einzelnen Experimente. Die Monozyten müssen injiziert werden, in das venöse System (Abbildung 1), s...

Diskussion

Die hier beschriebene Methode wirft Licht auf die Entwicklung von Sicherheiten Arterien, das Verhalten von Monozyten in diesen Gefäßen und den Prozess der Arteriogenesis. Die Schritte für die Anwendung dieses Protokolls sind leicht zu erlernen und kann verwendet werden, in anderen Bereichen der Wissenschaft. Trotz dieser Vorteile gibt es einige Nachteile. Zum Beispiel ist mikroskopische Ausrüstung erforderlich, um die beschriebenen Techniken ausführen. Beschaffung von Ausrüstung für ein Experiment ist unhaltbar, s...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% fetal calf serum (FCS)	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
1% penicillin/streptomycin	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
1mL Omnifix -F insuline syringe	B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany
50 ml syringe	Fresenius Kabi AG, Bad Homburg, Germany		Injectomat- syringe 50 ml with canule
6-well-ultra-low-attachement-plates	Corning Incorporated, NY, USA
8- 12 week old, male, C57BL/6, BalbC mice	Charles River, Sulzfeld, Germany
Adhesive tape	TESA SE, Hamburg, Germany
Acquisition Software	Leica, Wetzlar, Deutschland		Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF); Version: 2.7.3.9723
Canules	B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany		29G, 30G
Cell culture dish	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany
Cell culture medium	Manufactured by our group with single components		Medium199, 10% Fetal calf serum, 1% Antibiotic (penicillin/streptomycin)
Centrifuge	Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany		Allegra X-15R centrifuge
Depilatory cream	Veet, Mannheim, Germany
DiO	Invitrogen Eugene, Oregon, USA
Disinfection agent	Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany
Disposable scalpel No.10	Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan
EDTA	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Erlenmeyer flask	GVB, Herzogenrath, Germany
Ethanol 70%	Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany
Fetal Calf Serum	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Fine Forceps	Rubis, Stabio, Switzerland
Flurophor/Rhodamindextran	Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA	Katalognummer: D-1819
Gloves	Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany
Heating pad	Labotect GmbH, Göttingen, Germany		Hot Plate 062
Human macrophage-colony stimulating factor	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany	SRP3110
Humane leucocyte filters	Blood preservation
Incubator	Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany
Isoflurane	Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany
Ketamine (10%)	Ketavet, Pfizer Deutschland GmbH, Berlin , Germany
Leukocyte separation tubes (tubes with filter)	Bio one GmbH, Frickenhausen, Germany
Light microscope	Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany		Axiovert 40 C
Lymphocyte separation medium LSM1077	GE Healthcare, Pasching, Austria
Matrigel	Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA
Medium M199	PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria
Microbiological work bench	Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany		Hera safe
Microscope slide	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	Art. Nr. 1879
Microscope stand with incubator and heating unit	Leica DMI 6000, Pecon, Germany
Monocyte wash buffer	Manufactured by our group with single components		PBS, 0,5% BSA, 2mM EDTA
Mouse restrainer	Various
Multi-photon microscope	Leica, Wetzlar, Deutschland		Leica SP5 Confocal microscope, Cameleon, Coherent
NaCl (0,9%)	Berlin Chemie AG, Berlin, Germany
Neubauer counting chamber	Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany
Objective	Leica, Wetzlar, Deutschland		Leica HC PL APO 10x/0.4 CS
PBS	Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany		ph 7,4 sterile
Penicillin/Streptomycin	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Percoll	Manufactured by our group with single components		90 % Percoll, 10% 1,5M NaCl, ρ= 1,064 g cm-3
Percoll solution	GE Healthcare, Bio-Science AB, Uppsala, Sweden
Pipettes	Eppendorf AG, Hamburg, Germany		10µL/100µL/200µL/1000µL
Pipettes serological	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		Cellstar2ml, 5ml, 10ml
Pipetting heads	Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Pipetus	Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Polystyrol tube	Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany
Scissor	Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA
Scale	Mettler PM4800 Delta Range, Mettler-Toledo GmbH, Gießen, Germany
Suction unit	Integra bioscience, Fernwald, Germany		Vacusafe comfort
Surgical scissors	Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA
Trypan blue solution 0,4 %	Sigma Aldrich, Hamburg, Germany
Tubes with cap	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany		15ml, 50ml Cellstar
Xylazine (2 %)	Ceva Tiergesundheit GmbH, Düsseldorf, Germany