سير العمل على أساس المزيج تجارب التتبع النظائري للتحقيق الأيض الميكروبي من عدة مصادر المغذيات

Summary

ويصف هذا البروتوكول إجراء تجريبي للكمية وشاملة التحقيق الأيض من عدة مصادر المغذيات. يسمح سير العمل هذا، استناداً إلى مجموعة من التجارب الراسم النظائر المشعة وإجراء التحليل، مصير المواد الغذائية المستهلكة ومنشأ الأيضية سينثيتيزيد جزيئات من الكائنات الحية الدقيقة تحديد.

Abstract

دراسات في مجال علم الأحياء الدقيقة تعتمد على تنفيذ مجموعة واسعة من المنهجيات. على وجه الخصوص، تطوير أساليب مناسبة إلى حد كبير يسهم في توفير معرفة واسعة بالتمثيل الغذائي للكائنات الدقيقة التي تنمو في المعرفة كيميائيا الوسائط التي تحتوي على مصادر الكربون والنيتروجين فريدة من نوعها. على النقيض من ذلك، ما زالت إدارة مصادر المغذيات متعددة، على الرغم من وجودها الواسع في البيئات الطبيعية أو الصناعية، من خلال التمثيل الغذائي تقريبا غير مستكشفة. وهذه الحالة يرجع أساسا إلى الافتقار إلى منهجيات مناسبة، مما يعوق التحقيقات.

نحن تقرير استراتيجية تجريبية كمياً وشاملة استكشاف كيفية تشغيل الأيض عندما يتم توفير مغذيات كخليط من جزيئات مختلفة، أي، مورد معقدة. هنا، نحن تصف تطبيقها لتقييم تقسيم مصادر النيتروجين متعددة من خلال شبكة الأيضية الخميرة. سير العمل يجمع بين المعلومات التي تم الحصول عليها من خلال تجارب الراسم النظائر المستقرة باستخدام المحدد ¹³ج-أو ركائز المسمى ن ¹⁵. الأولى تتكون من تخمير موازية واستنساخه في المتوسط نفسها، التي تضم خليط جزيئات المحتوية على ن؛ ومع ذلك، يسمى مصدر نيتروجين محدد في كل مرة. يتم تنفيذ مزيج من الإجراءات التحليلية ([هبلك]، GC-MS) لتقييم أنماط التوسيم للمركبات المستهدفة وقياس الاستهلاك والانتعاش من ركائز في نواتج الأيض الأخرى. تحليل متكامل لمجموعة البيانات كاملة يوفر لمحة عامة عن مصير ركائز المستهلكة داخل الخلايا. ويتطلب هذا النهج بروتوكولا دقيقة لجمع العينات – تيسير نظام الروبوت للرصد على الإنترنت لتخمير – وتحقيق العديد من التحليلات تستغرق وقتاً طويلاً. على الرغم من هذه القيود، فقد أتاح فهم، للمرة الأولى، على تقسيم مصادر النيتروجين متعددة في جميع أنحاء الشبكة الاستقلابية الخميرة. توضيح توزيع النيتروجين من مصادر أكثر وفرة تجاه المركبات الأخرى ن، وتحدد أصول الأيضية للجزيئات المتطايرة والأحماض الأمينية قائمة.

Introduction

فهم كيف يعمل الأيض الميكروبي مسألة أساسية لتصميم استراتيجيات فعالة لتحسين عمليات التخمير وتعدل إنتاج المركبات معفن. التقدم في علم الوراثة وعلم الجينوم الوظيفي في هذين العقدين الماضي ساهمت إلى حد كبير إلى توسيع نطاق معرفة طبولوجيا الشبكات التمثيل الغذائي في العديد من الكائنات الحية الدقيقة. الوصول إلى هذه المعلومات أدت إلى تطوير النهج التي تهدف لإجراء استعراض شامل لوظيفة الخلوية¹. غالباً ما تعتمد هذه المنهجيات على تفسير يستند إلى نموذج لمعايير قابلة للقياس. وتشمل هذه البيانات التجريبية، من ناحية، معدلات الإقبال والإنتاج المستقلب، ومن ناحية أخرى، تجارب كمية المعلومات داخل الخلايا التي يتم الحصول عليها من الراسم النظائر. توفر هذه البيانات معلومات أساسية لخصم النشاط في فيفو مسارات مختلفة في تعريف شبكة الاستقلابية^2،3،4. التقنيات التحليلية المتاحة حاليا، فقط تمكين الكشف عن دقة وصف أنماط الجزيئات عند استخدام أحد نظائر عنصر مفرد، وربما عندما وسم يشترك مع عنصرين النظائر. وعلاوة على ذلك، تحت ظروف نمو معظم، مصدر الكربون يتكون فقط من واحد أو اثنين--المركبات. ونتيجة لذلك، النهج القائمة على تتبع النظائر ج ¹³من ركائز الكربون بنجاح وعلى نطاق واسع وطبقت على التوصل إلى فهم كامل للكربون الأيضية شبكة عمليات^{5،6،7 ،8}.

وفي المقابل، في العديد من البيئات الطبيعية والصناعية، المورد متاح النيتروجين التي تدعم النمو الميكروبي غالباً ما تتألف من مجموعة واسعة من الجزيئات. على سبيل المثال، أثناء تخمير النبيذ أو البيرة، يتم توفيرها من النيتروجين كخليط من الأحماض الأمينية والأمونيوم في تركيزات متغير⁹18. هذا الصفيف ن المركبات التي يمكن الوصول إليها لابتناء يجعل هذه الشروط المعقدة وسائل الإعلام مختلفة إلى حد كبير عن تلك التي تستخدم عادة للدراسات الفسيولوجية، كما هذا الأخير يتم تحقيقه باستخدام مصدرا فريداً للنيتروجين، عادة من الأمونيوم.

وعموما، مستوعبة النيتروجين قد أدرجت في البروتينات المركبات مباشرة أو كاتابوليزيد. بنية الشبكة استقلاب النيتروجين في العديد من الكائنات الحية الدقيقة، بما في ذلك الخميرة Saccharomyces cerevisiae، معقد للغاية وفقا لتنوع ركائز. العريضة، ويقوم هذا النظام على تركيبة النواة المركزية استقلاب النيتروجين الذي يحفز إينتيركونفيرسيون من الجلوتامين والغلوتامات و α-كيتوجلوتاراتي^10،11، مع اميناز وديميناسيس. من خلال هذه الشبكة، وهي تجمع مجموعات أمين من الأمونيوم أو الأحماض الأمينية الأخرى والإفراج عن الأحماض α-keto. هذه الوسيطة أيضا سينثيتيزيد من خلال الكربون المركزية الأيض (CCM)^12،13. هذا العدد الكبير من ردود فعل تشعبت والمواد الوسيطة، تشارك في الانتقاض مصادر خارجية النيتروجين وابتناء قائمة الأحماض الأمينية، يفي بمتطلبات المنشطة للخلايا. كما يؤدي النشاط من خلال هذه الطرق المختلفة المترابطة في إفراز نواتج الأيض. على وجه الخصوص، قد توجيه الأحماض α-keto من خلال المسار ايرليك لإنتاج الكحول أعلى وما خلات إستر المشتقات¹⁴، التي هي من المساهمين أساسيا للملامح الحسية للمنتجات. وفي وقت لاحق، كيف تعمل استقلاب النيتروجين دوراً رئيسيا في إنتاج الكتلة الأحيائية وتشكيل الجزيئات المتطايرة (رائحة).

ردود الفعل والأنزيمات والجينات المشاركة في استقلاب النيتروجين توصف على نطاق واسع في الأدب. بيد أن مسألة توزيع مصادر النيتروجين متعددة في جميع أنحاء شبكة التمثيل الغذائي لم تعالج بعد. هناك اثنين من الأسباب الرئيسية التي تفسر هذا النقص في المعلومات. أولاً، نظراً لتعقيد مهمة شبكة استقلاب النيتروجين، كمية كبيرة من البيانات الكمية المطلوبة لفهم كامل لعملها أن لم تكن متاحة حتى الآن. ثانيا، العديد من القيود التجريبية والقيود المفروضة على الطرق التحليلية حالت دون تنفيذ النهج التي كانت تستخدم سابقا لتوضيح الدالة CCM.

للتغلب على هذه المشاكل، اخترنا لوضع نهج مستوى النظام تقوم على التوفيق بين البيانات من سلسلة من التجارب الراسم النظائر. يتضمن سير العمل:
--مجموعة من تخمير نفذت تحت نفس الظروف البيئية، بينما يسمى مصدر مغذيات محددة مختلفة (الركيزة) في كل مرة.
--مزيج من الإجراءات التحليلية ([هبلك]، GC-MS) لتحديد دقيق، في مراحل مختلفة من التخمير، تركيز المتبقية من الركازة المسمى والتركيز وإثراء المركبات المشتقة من النظائر المشعة تقويض للجزيء المسمى، بما في ذلك الكتلة الحيوية المشتقة.
-عملية حسابية للتوازن الشامل والنظائر المشعة لكل تستهلك الجزيء المسمى ومزيد من تحليل متكامل لمجموعة البيانات للحصول على لمحة عامة لإدارة مصادر المغذيات متعددة من الكائنات الحية الدقيقة من خلال تحديد نسب التمويه .

لتطبيق هذه المنهجية، يجب إيلاء الاهتمام لسلوك استنساخه من السلالة/الكائنات الدقيقة بين الثقافات. وعلاوة على ذلك، يجب أخذ عينات من ثقافات مختلفة خلال نفس التقدم التخمير محددة تحديداً جيدا. في الأعمال التجريبية التي ذكرت في هذه المخطوطة، يستخدم نظام الروبوت للرصد على الإنترنت لتخمير لمراعاة هذه القيود.

وعلاوة على ذلك، من الضروري أن تختار مجموعة من ركائز المسمى (مجمع، والطبيعة، ووضع العلامات) التي مناسبة معالجة مشكلة الدراسة العلمية. هنا، تم اختيار ¹⁵المسمى ن الأمونيوم، الجلوتامين، وارجينين كمصادر النيتروجين الرئيسية الثلاثة الموجودة في عصير العنب. وهذا يسمح بتقييم نمط توزيع النيتروجين من المركبات المستهلكة للأحماض الأمينية قائمة. نحن تهدف أيضا إلى التحقيق في مصير العمود الفقري الكربون من الأحماض الأمينية المستهلكة ومساهمتها في إنتاج الجزيئات المتقلبة. آيسولوسين، ثريونين، وحمض أميني أساسي للوفاء بهذا الهدف، وشكل موحد لوسين المسمى ج ¹³، قد أدرجت في الدراسة الأحماض الأمينية المستمدة من المواد الوسيطة الرئيسية للمسار ايرليك.

عموما، فإننا استكشاف كمياً كيف يدير الخميرة مورد نيتروجين معقدة بإعادة توزيع مصادر النيتروجين الخارجية للوفاء بمتطلباتها الابتنائية طوال التخمير أثناء إزالة فائض السلائف الكربون كما بالإضافة إلى ذلك الجزيئات المتقلبة. يمكن تطبيق الإجراءات التجريبية عنها في هذه الورقة للتحقيق في مصادر المغذيات المتعددة الأخرى المستخدمة من قبل أي من الكائنات الدقيقة الأخرى. ويبدو أن نهج مناسب لتحليل تأثير الخلفية الجينية أو الظروف البيئية على السلوك الأيضية للكائنات الحية الدقيقة.

Protocol

1-التخمير وأخذ العينات

1. إعداد الوسائط والتخمير
   ملاحظة: تعريف كل تخمير يتم يضطلع بالتوازي، باستخدام نفس السلالة وفي نفس كيميائيا المتوسطة الاصطناعية (SM، التكوين الواردة في الجدول 1)، الذي يتضمن مزيجاً من الأمونيوم والأحماض الأمينية حسب مصادر النيتروجين¹⁵. لكل التخمير، يتم توفيرها مركب النتروجين واحد حصرا في شكل موحد المسمى ¹³ج أو نموذج ¹⁵ن (100%)، بينما لا يزال الآخرون غير مسمى. لكل مصدر النيتروجين المسمى الذي يتم استخدامه في مجموعة التجارب (هنا: ¹⁵NH₄، يو-¹⁵N4-الأرجنتين، يو-¹⁵N2-جلن، يو-¹³C6-لوي، يو-¹³C5-فال، يو-¹³C6-إيل، يو-¹³C4-الثريونين)، وهما وتعد المخمرات. لكل شرط، تتم التخمير المكررة باستخدام فقط غير مسمى جزيئات (تخمير التحكم 7).
   1. لكل N-مصدر لدراستها، وإعداد 500 مل SM المسمى المتوسط الذي يحتوي على كافة مصادر النيتروجين المذكورة في الجدول 1، باستثناء المجمع لاستخدامها في 100% النموذج.
      ملاحظة: يتم إضافة الجزيء المسمى في الخطوات التالية.
   2. بسترة كل المتوسطة في قارورة ل 1 (10 دقيقة، 100 درجة مئوية) التي تحتوي على شريط إثارة مغناطيسية. وزن المقدار المناسب من جزيء المسمى للوصول إلى تركيز النهائية التي يتم الإبلاغ عنها في الجدول 1 وحله في الأجل المتوسط.
   3. تعقيم المتوسطة استخدام نظام ترشيح فراغ المتاح (غشاء اسيتات السليولوز، 0.22 ميكرومتر). باستخدام اسطوانة قياس عقيمة، تقسيم المتوسطة بين المخمرات معقمة قبل سنتين (250 مل) التي تحتوي على شريط إثارة مغناطيسية وهي مجهزة بإقفال التخمير تجنب دخول الأوكسجين ولكن السماح بالإفراج عن أول أكسيد الكربون₂.
   4. الحرارة قوارير التخمير إلى 28 درجة مئوية عن طريق وضعها في غرفة الحضانة لليلة واحدة (درجة الحرارة في 28 درجة مئوية).
2. التطعيم والرصد لتخمير
   1. تنمو سلالة S. cerevisiae في أنابيب معقمة تحتوي على 10 مل متوسطة YPD في 28 درجة مئوية مع الهز (150 لفة في الدقيقة) ح 12. ثم بيبيت 1 مل YPD بريكولتوري ونقلها إلى 10 مل من SM المتوسطة (في أنابيب معقمة 15 مل). احتضان ثقافة ح 12 في 28 درجة مئوية مع الهز (150 لفة في الدقيقة).
   2. تحت الاندفاق الصفحي، جمع من بريكولتوري الكوة والتحديد الكمي للسكان الخلية باستخدام عداد جسيمات إلكترونية التي يتم تركيبها مع فتحه 100 ميكرومتر. الطرد المركزي بريكولتوري (2,000 x ز، 15 دقيقة، 4 درجة مئوية) وتعليق بيليه في وحدة تخزين مناسبة من الماء المعقم للحصول على تركيز نهائي 2.5 × 10⁸ خلايا/مل. تطعيم كل تخمير مع 1 مل تعليق خلية.
      ملاحظة: النظام الروبوتية المستخدمة لرصد التقدم المحرز في التخمير يرد في الشكل 1.
   3. إعداد منهاج التخمير بتثبيت التخمير في أدلة الدعم التي يتم وضعها على لوحات التحريك 21-الموقف بشكل صحيح وتعيين معدل إثارة 270 لفة في الدقيقة. لبدء الرصد المباشر لكل التخمير، بدء تشغيل التطبيق الروبوت--عنصر تحكم، ثم انقر فوق الزر "بدء الفحص" وحدد حجم التخمر سيضطلع (300 مل).
   4. واجهة عرض يسمح الإشارة إلى عدد وموقف المخمرات على المنصة. لضمان حدوث ذلك، انقر على الحق في مكان فتحه واختر "تمكين" تفعيل رصد تخمير يقع في هذا الموضع.
   5. تهيئة البرنامج حساب، تعمل بشكل دائم على النظام، قبل البدء في اكتساب الوزن. انقر فوق الزر "إينيتياليسير"، والتحقق من صحة مع "موافق". انقر على زر "ابدأ" روبوت لمراقبة التطبيق لبدء عمليات الشراء الوزن.
3. إجراءات أخذ العينات
   ملاحظة: لكل تخمير، وتؤخذ عينات عندما يصل إنتاج₂ CO (القيمة المعروضة على شبكة الإنترنت على الكمبيوتر الذي يشغل البرنامج حساب) النقطة المحددة المطلوبة: 5، 10 و 40 و 90 جرام/لتر في هذه الدراسة.
   1. أخذ العينات الداخلي للثقافات مع مركبات مسماة.
      1. الطرد المركزي عينتين 6 مل (2,000 x ز, 5 دقيقة, 4 درجة مئوية). حفظ وتخزين supernatants المجمدة في مختبرين اثنين في-80 درجة مئوية. تغسل الكريات مرتين مع 5 مل المقطر ماء ومخزن في-80 درجة مئوية لقياس الفاسدون النظائر.
   2. أخذ العينات الداخلي للثقافات دون مركبات مسماة
      1. حصاد 10 مل ثقافة، والذي سيتم استخدامه لتحديد الوزن الجاف. بيليه الخلايا من 10 مل عينتين بالطرد المركزي (2,000 x ز, 5 دقيقة, 4 درجة مئوية). تغسل الكريات مرتين مع 10 مل ماء المقطر وتخزينها في-80 درجة مئوية لتحديد محتوى البروتين والأحماض الأمينية.

2-التحديد الكمي لمصادر النيتروجين المستهلكة

1. تصميم الانزيمية تركيزات الأمونيا المتبقية
   ملاحظة: يتم تحديد تركيز الأمونيا في supernatants استخدام مجموعة المستندة إلى إنزيم تجارية؛ جميع الكواشف توفرها الشركة المصنعة.
   1. تعد حلاً الأمونيا قياسية (61.4 مغ/لتر) بإذابة 25 ملغ من دقة وزنه (NH₄)₂حتى₄ في قارورة حجمية 100 مل.
   2. للوفاء بإرشادات الشركة المصنعة، نفذ إضعاف 1:2 للعينات التي أخذت قبل التخمير والساعة 5 غ/لتر من CO₂ صدر. ضبط الأس الهيدروجيني للعينات لما يقرب من 8 بإضافة 1 م كوه. يحيط علما بحجم المضافة وأخذها في الاعتبار في معامل التخفيف.
   3. في 4 مل جهاز المطياف الضوئي الترعة، المقطر مزيج 100 ميكروليتر من عينة (المخفف إذا لزم الأمر)، المياه أو محلول الأمونيا القياسية مع 2 مل كاشف 1 (0.75 مم ADP و 30 U/mL غلوتامات نازعة في المخزن المؤقت للأس الهيدروجيني 7.8) و 500 ميليلتر من كاشف 2 (1.3 مم NADH). احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وقراءة امتصاص NADH في 340 نانومتر (A1).
   4. إضافة 500 ميليلتر من الكاشف 3 (60 ملم α-كيتوجلوتاراتي في المخزن المؤقت لدرجة الحموضة 8) واحتضان العينة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وقراءة امتصاص NADH في 340 نانومتر (A2).
   5. حساب تركيز الأمونيا باستخدام:
      ج_{النشادر} (غرام/لتر) = 0.083 x [(0.839 x A1-A2)_عينة-(0.839 x A1-A2)_{ماء مقطر}]
   6. تحقق من أن يتم الحصول على التركيز الصحيح مع الحل القياسية.
2. تصميم الكروماتوغرافي تركيزات الأحماض الأمينية المتبقية
   ملاحظة: تحديد تركيزات الأحماض الأمينية في supernatants يتحقق باستخدام نظام تحليل الأحماض الأمينية مخصصة تقوم على التبادل الأيوني اللوني مع وظيفة العمود derivatization ن-المركبات مع نينهيدرين، الذي يسمح بها كشف اللونية.
   1. إعداد حل مرجع بإضافة 200 ميليلتر من خليط تجاري من الأحماض الأمينية محايدة والحمضية و 200 ميليلتر من خليط تجاري من الأحماض الأمينية الأساسية 200 ميليلتر من الجلوتامين 2.5 ملم إلى 400 ميليلتر من 200 ملم الليثيوم سترات عازلة، درجة الحموضة 2.2. هذا الحل إشارة محددة كيميائيا يعامل كعينة.
   2. إضافة 200 ميليلتر من حل حمض سولفوساليسيليك 25% (w/v) الذي يحتوي على 2.5 مم نورليوسيني (الداخلية القياسية) إلى 800 ميليلتر من عينة لإزالة الجزيئات ذات الأوزان الجزيئية العالية. احتضانها ح 1 في 4 درجات مئوية، وأجهزة الطرد المركزي (3,000 x ز، 10 دقيقة، 4 درجة مئوية) وعامل التصفية عن طريق غشاء النيتروسليلوز حجم المسام 0.22 ميكرومتر (نظام الحقن).
   3. في برنامج مبرمج، انقر فوق الزر "تشغيل" لبدء اللوني السائل التحليلات (LC) مع محلل مزودة بعمود تبادل الأيونات الموجبة (نموذج الليثيوم). الوت الأحماض الأمينية مع المخازن المؤقتة الليثيوم المتعاقبة لإنشاء تدرج الأس الهيدروجيني وتدرج في تركيز أيون مكافحة في تركيبة مع تدرج درجة الحرارة (الجدول 2).
   4. تحديد كمية مركبات النيتروجين بعد derivatization نينهيدرين بجهاز كشف سبيكتروفوتوميتريك في 570 نانومتر (الأرجواني التلون: تفاعل بين مجموعة نينهيدرين وأمين من الأحماض الأمينية) و 440 نانومتر (الأصفر تلوين: تفاعل بين مجموعة نينهيدرين وايمين برولين).
   5. إجراء معايرة داخلية نقطة واحدة استخدام حل مرجع ونورليوسيني كمعيار داخلية لحساب تركيزات الأحماض الأمينية في العينات باستخدام البرنامج الخاص بالشركة المصنعة.

3-التحديد الكمي لقائمة الأحماض الأمينية

1. قياس الوزن الجاف خلية
   1. تصفية 10 مل ثقافة من خلال عامل تصفية النيتروسليلوز (المسام حجم 0.45 ميكرومتر) موزون مسبقاً في كأس ألومنيوم، واستخدام جهاز الشفط. تغسل مرتين مع 50 مل ماء المقطر.
   2. وضع عامل التصفية في كأس الألمنيوم والجافة في فرن حرارة عند 105 درجة مئوية ح 48 (حتى يتم ملاحظة أي تغيير زيادة في الوزن) قبل ريويغينج عامل التصفية في الكأس. حساب فرق الوزن.
   3. حساب متوسط قياسات مستقلة على الأقل 3 لدقة تحديد الوزن الجاف خلية ثقافة الخميرة.
2. التحديد الكمي لمحتوى البروتين من الخلايا
   ملاحظة: يتم إجراء التحديد الكمي للجزء من البروتين الخلايا على الأقل في ثلاث نسخ باستخدام الكريات غير مسمى الخلية التي تم الحصول عليها كما هو موضح في القسم 1-3-2.
   1. استخراج البروتينات بإضافة 1 مل من محلول [دمس] (50% v/v) إلى الكريات المجمدة واحتضان عند 105 درجة مئوية ح 1 في فرن حرارة جافة.
   2. التحديد الكمي لمحتوى البروتين في المقتطفات [دمس] باستخدام مقايسة اللونية البيوكيميائية يرتكز على الحد من البروتينات Cu⁺⁺ إلى أيونات Cu⁺ التي هي كذلك عجلت بحمض بيسينتشونينيك في مجمع زرقاء (مقايسة اتفاق التعاون الأساسي).
3. تحديد المساهمات النسبية للأحماض الأمينية في البروتينات
   ملاحظة: يتم تحديد ملف التعريف من قائمة الأحماض الأمينية على الأقل في ثلاث نسخ من خلية غير مسمى الكريات (1.3.2.).
   1. إعداد مقتطف المؤكسد بتعليق بيليه الخلية في 200 ميليلتر من حمض بيرفورميك (حمض الفورميك 90%، وفوق أكسيد الهيدروجين 10%). احتضانها ح 4 في 4 درجات مئوية ويتوقف رد الفعل بإضافة كبريتات الصوديوم ملغ 33.6.
      ملاحظة: الخطوة أكسدة مطلوب تحويل سيستين والميثيونين حمض الميثيونين [سولفون] وسيستيك، مما سوف يمكن تحديدها كمياً المزيد من التبادل الأيوني اللوني. ومع ذلك، بعض الأحماض الأمينية (تيروزين، فينيلالاناين، الحامض الأميني، وارجينين) هي التشويه والتحريف أثناء علاج الأكسدة. ونتيجة لذلك، يتم إعداد اثنين من البروتينات (مع ودون الأكسدة).
   2. إضافة 800 ميليلتر من 6N HCl إلى حبيبات الخلية أو تتأكسد استخراج واحتضان العينة في أنبوب زجاج مختومة بأحكام ح 16 عند 110 درجة مئوية في فرن وحرارة جافة. إضافة 200 ميليلتر من نورليوسيني 2.5 ملم وإزالة HCl مع تيار نيتروجين. أغسل (ريسوسبيندينج استخراج المجففة وثم إزالة السائل مع تيار نيتروجين) مرتين مع 800 ميليلتر من الماء المقطر ثم مع 800 ميليلتر من الإيثانول. يستغرق في 800 ميليلتر من 200 ملم الليثيوم خلات العازلة، الأس الهيدروجيني 2.2.
      ملاحظة: ينبغي إيلاء الاهتمام لفترة الحضانة للتحلل المائي بعض الأحماض الأمينية ليست مستقرة تحت الظروف الحمضية. ويقدر الكسر التربتوفان في البروتين من البيانات الموجودة في الأدبيات¹⁶، الأحماض الأمينية هذا هو التشويه والتحريف تماما أثناء التحلل HCl.
   3. إعداد معيار هيدروليساتي لمعايرة الداخلية نقطة واحدة. إضافة 160 ميليلتر للتوصل إلى حل تجاري لتحلل الأحماض الأمينية إلى 840 ميليلتر 200 ملم الليثيوم خلات المخزن المؤقت، الأس الهيدروجيني 2.2، يحتوي على 625 [سولفون] الميثيونين ميكرومتر وحمض سيستيك ميكرومتر 625 625 مكم نورليوسيني.
   4. تحديد تركيزات النسبية من الأحماض الأمينية في البروتينات باستخدام الأسلوب الكروماتوغرافي الموصوفة في القسم 2-2.
4. العمليات الحسابية
   1. حساب نسبة وزن كل من الأحماض الأمينية في البروتينات بتقسيم مبلغ محسوب لكل حمض أميني (مغ/لتر) بمبلغ إجمالي قدرة الأحماض الأمينية التي تم قياسها في استخراج البروتين (مجموع في مغ/لتر).
   2. تتضاعف هذه النسبة المئوية بتركيز البروتينات في الثقافة (مغ/لتر)، و أي، والمنتج بين محتوى البروتين من الكتلة الأحيائية والوزن الجاف، لتقييم تركيز كل حمض أميني قائمة في الثقافة (مغ/لتر).

4-قياس تخصيب النظائر المشعة من قائمة الأحماض الأمينية

ملاحظة: لقياس تخصيب النظائر المشعة من قائمة الأحماض الأمينية، استخدام الكريات خلية مسماة. وتستخدم ثلاثة عوامل مختلفة لخطوة derivatization كمياً في إثراء النظائر المشعة من الأحماض الأمينية. يتم قياس كثافة الكتلة أيونات لتقدير أنماط التوسيم من الأحماض الأمينية. الإشارة من كل أيون الكتلة يتوافق مع وفرة إيسوتوبوميرس الشامل (م₀ = بدون تسمية، m_{+ 1} = 1 ذرة المسمى،...) جزء من الأحماض الأمينية. ويرد مثال على تشروماتوجرام التي تم الحصول عليها بعد إجراء دمادمف في الشكل 2.

1. التحلل المائي الكتلة الأحيائية
   1. يتحلل الكريات الخلية (الموافق 1-2 مغ من الكتلة الأحيائية الجافة) بإضافة 1.2 مل من 6 M HCl وتفرخ العينة ح 16 عند 105 درجة مئوية في أنابيب زجاجية مغلقة بأحكام في فرن حرارة جافة.
   2. إضافة 1.2 مل من الماء المقطر وأجهزة الطرد المركزي في 3,000 س ز لمدة 5 دقائق لإزالة الحطام الخلوية. توزيع المادة طافية في ستة 400 ميليلتر الكسور في أنابيب زجاجية مفتوحة. الجاف الكسور في فرن حرارة عند 105 درجة مئوية حتى تصل إلى اتساق شراب (ح 4-5).
2. Derivatization اثيلتشلوروفورماتي (ECF)
   1. حل هيدروليساتي المجفف في 200 ميليلتر من عيار 20 ملم HCl؛ ثم أضف ميليلتر 133 بيريدين: الإيثانول (1:4). إضافة 50 ميليلتر من ECF ديريفاتيزي الأحماض الأمينية والانتظار حتى لقد تم الإفراج عن جميع CO₂ . نقل الخليط الطرد المركزي أنابيب تحتوي على 500 ميليلتر من الميثان لاستخراج المركبات ديريفاتيزيد.
   2. دوامة الأنابيب 10 s والطرد المركزي لهم لمدة 4 دقائق في 10,000 س ز؛ جمع المرحلة العضوية أقل مع بيبيت باستور ونقل إلى GC قارورة تحتوي على إدراج الزجاج مخروطية الشكل حيث أن العينات قد حقنت مباشرة الصك GC/MS.
3. (ن، ن)-ديميثيلفورماميدي ثنائي ميثيل أسيتال (دمفدما) derivatization.
   1. حل هيدروليساتي المجفف في 50 ميليلتر من الميثانول و 200 ميليلتر من الاسيتو الانيتريل. إضافة 300 ميليلتر من دمفدما. دوامة الأنبوب ونقل العينات إلى GC أوتوسامبلير زجاجة تحتوي على إدراج الزجاج مخروطية الشكل.
4. ن، س-مكررا (تريميثيلسيليل) تريفلورواسيتاميدي (بستفا) derivatization
   1. تعليق هيدروليساتي في 200 ميليلتر من الاسيتو الانيتريل. إضافة 200 ميليلتر من بستفا ومغلقة بأحكام إغلاق أنبوب زجاج واحتضانها ح 4 في 135 درجة مئوية قبل نقل النص المقتبس مباشرة إلى قارورة GC.
5. تحليل GC-MS
   1. تحليل العينات مع كروماتوجرافيا الغاز مجهزة حاقن أوتوسامبلير وهو بالإضافة مطياف كتلة.
      1. استخدام البرمجيات الخاصة بأداة للتحكم في الصك وتحليل في تشروماتوجرامس. في قائمة "سلسلة"، انقر فوق "نموذج سجل الجدول" لإنشاء قائمة نماذج، وانقر فوق الزر "تشغيل" لبدء الحقن.
         ملاحظة: كروماتوجرافيا الغاز مزودة بعمود شعري السليكا أبولار 30 م × 0.25 مم مع سماكة فيلم ميكرومترات 0.15. ضبط درجة حرارة الرباعي مطياف كتلة عند 150 درجة مئوية وعقد خط نقل على 250 درجة مئوية لكل التحليلات. وتستخدم ثلاثة برامج تحليلية، كل واحدة محددة لكل عامل derivatization،.
      2. ECF المشتقات المالية: استخدام الهيليوم كمرحلة المتنقلة مع تدفق 1.2 مل/دقيقة اضبط درجة حرارة المدخل في 230 درجة مئوية، وأن المصدر عند 250 درجة مئوية. برنامج أوتوسامبلير لحقن 1 ميليلتر من العينات بتقسيم نسبة 3:1. تشغيل هذه التحليلات، تدريجيا على زيادة درجة حرارة الفرن كما يلي: 130 درجة مئوية لمدة 3 دقائق؛ التدرج من 15 درجة مئوية/دقيقة إلى 260 درجة مئوية؛ الحفاظ على درجة حرارة 260 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
      3. مشتقات دمفدما: استخدام الهيليوم كمرحلة المتنقلة مع تدفق مستمر من 1.2 مل/دقيقة اضبط درجة حرارة المدخل في 230 درجة مئوية، وأن المصدر عند 250 درجة مئوية. برنامج أوتوسامبلير لحقن 1 ميليلتر من العينات بتقسيم نسبة 3:1. تشغيل هذه التحليلات، تدريجيا على زيادة درجة حرارة الفرن كما يلي: 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة؛ التدرج في الدقيقة 20 درجة مئوية إلى 130 درجة مئوية؛ التدرج الثانية من 4 درجة مئوية/دقيقة إلى 260 درجة مئوية؛ الحفاظ على درجة حرارة 260 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
      4. مشتقات بستفا: استخدام الهيليوم كمرحلة المتنقلة مع تدفق مستمر من 1.2 مل/دقيقة اضبط درجة حرارة المدخل في 275 درجة مئوية، وأن المصدر في 300 درجة مئوية. تشغيل التحليلات (الحقن: 1 ميليلتر)، تدريجيا زيادة درجة حرارة الفرن كما يلي: 110 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة؛ التدرج الأولى من 2 درجة مئوية/دقيقة إلى 154 درجة مئوية؛ التدرج الثانية من 5 درجة مئوية/دقيقة إلى 300 درجة مئوية؛ الحفاظ على درجة حرارة 300 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
      5. الكشف الداخلي: لوضع كل من derivatization، حقن عينة (1 ميليلتر) في وضع المسح الضوئي مع الإلكترون الإيجابي أثر التأين في 70 eV والإحاطة بوقت الاحتفاظ بكل من الأحماض الأمينية.
      6. استخدم هذه القيم لتحديد الإطارات الزمنية في جميع أنحاء في chromatogram والايونات مختلفة مختارة، ومميزة لكل من الأحماض الأمينية والمدرجة في الجدول 3؛ ينبغي أن تكون هذه القيم لكل من الأحماض الأمينية. تضمين هذه المعلومات في برنامج الكشف عن سيم وتشغيل التحليلات في وضع سيم مع الإلكترون الإيجابي أثر التأين في 70 eV.
   2. جمع نتائج التحليلات؛ هي لكل من الأحماض الأمينية، سجل مجموعة من الشدة التي تتوافق مع إلى ما إيسوتوبوميرس أسلحة مختلفة. معالجة البيانات باستخدام ديديكاتيدسوفتواري¹⁷ لتصحيح لوضع العلامات الطبيعية وحساب تخصيب النظائر المشعة من قائمة الأحماض الأمينية (ويعرف الكسر مسماة من الأحماض الأمينية فيما يتعلق بالمبلغ الإجمالي للبروتين عينات).
      ملاحظة: في إثراء النظائر لجزيء (أي)، كنسبة مئوية، يتم حساب قسمة مجموع كثافات تصحيحها من إيسوتوبوميرس الشامل مع وضع العلامات (م₁، م₂،...m_ن) على مجموع المصوبة كثافة من جميع إيسوتوبوميرس أسلحة (م₀، م₁، م₂... م_ن):
      أولاً هاء = (م₁ + م₂ +... + م_ن)/(م₀ + م₁+ م₂ +... + م_ن)

5-التقدير الكمي والنظائر إثراء المتطايرة

1. استخراج المركبات المتطايرة المسمى
   1. إضافة 10 ميليلتر من الديوتيريوم المعايير الداخلية إلى 5 مل من المادة طافية (تركيز مركبات الديوتيريوم النهائي: 100 ميكروغرام/لتر) في أنبوب زجاج 15 مل. إضافة 1 مل الميثان وأحكام إغلاق الأنابيب ويهز لهم على منصة هزاز لأدنى 20 جهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 3,000 س ز وجمع في مرحلة انخفاض العضوية في أنبوب زجاج 15 مل. كرر استخراج الميثان.
   2. الجاف لاستخراج العضوية أكثر من 500 مغ كبريتات الصوديوم اللامائية وجمع الطور السائل مع بيبيت باستور. التركيز الاستخراج بمعامل أربع تحت التمويه النيتروجين ونقلها إلى قنينة أوتوسامبلير GC.
2. تقدير المركبات المتطايرة GC-MS
   1. تزويد كروماتوجرافيا الغاز مع عمود شعري والسليكا فوسيد 30 م × 0.25 مم 0.25 ميكرو فيلم سمك وتطبيق تدفق هليوم مستمر من 1.0 مل/دقيقة عقد محقن وخط نقل في 250 درجة مئوية.
   2. حقن 2 ميليلتر من عينة بنسبة 10:1 تقسيم وفصل الجزيئات المتطايرة المستخرجة باستخدام التشكيل الجانبي التالي لدرجة حرارة الفرن: اضغط بدرجة الحرارة لمدة 3 دقائق عند 40 درجة مئوية، وزيادتها من خلال 4 درجة مئوية/دقيقة يصل إلى 220 درجة مئوية، وعقد بعد ذلك الفرن على 220 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
   3. الكشف عن المركبات باستخدام مطياف كتلة مع درجة حرارة المصدر بها تعيين في 230 درجة مئوية ودرجة الحرارة الرباعي مطياف كتلة تعيين عند 150 درجة مئوية. تسجيل الأطياف الشامل في الوضع المحدد أيون الرصد (SIM) مع الإلكترون الإيجابي أثر التأين في 70 eV واستخدام كتل أيون المحددة للمركبات المتطايرة التي ترد في الجدول 4.
   4. استخدام معايرة 7-النقطة خارجية لقياس تركيزات الجزيئات المتطايرة من مبالغ كثافة الكتلة أيون المطابق. إعداد حلول الأسهم لكل مجمع (10 غرام/لتر) في الإيثانول 100%. ثم، إعداد الحلول القياسية لكل فئة من الجزيئات المتطايرة (استرات الإيثيل، والاسيتات والكحول والأحماض) عن طريق خلط الحلول الأسهم. وأخيراً، يؤدي إلى تمييع كميات مختلفة من الحلول القياسية في حل hydroalcoholic 12% يحتوي على حمض الطرطريك 5 غرام/لتر مع درجة الحموضة تعديلها إلى 3.3 لإعداد حلول المعايرة.
   5. في موازاة ذلك، تصحيح للعلامات الطبيعية من شدة كل مجموعة أيون وحساب إثراء النظائر للمركبات المتطايرة، الذي يعرف الكسر مسماة من الجزيئات، ويتم التعبير عنها كنسبة مئوية باستخدام برامج مخصصة ¹⁷.

6-العمليات الحسابية لإجراء تحليل متكامل لمجموعة البيانات

1. جمع البيانات الأولية
   1. استخدام جداول البيانات المبينة في الجداول 5، 6، 7، و 8، قم بإدخال قيم البيانات الخام التي تتوافق مع تركيز الأحماض الأمينية خارج الخلية، الخلية من الوزن الجاف، ومحتوى البروتين في الخلايا، وتركيز الجزيئات المتقلبة، والنظائر المشعة الإثراء من قائمة الأحماض الأمينية والجزيئات المتقلبة.
      ملاحظة: يتم التعبير عن البيانات الواردة في الجداول في مم. ويعبر أيضا عن جميع النتائج في مغ/لتر بضرب القيم في مم الوزن الجزيئي لكل جزيء أو مغ N/لتر بضرب ميليمولار تركيز الأحماض الأمينية قائمة الكتلة الذرية من النيتروجين (14 ش) وعدد من النيتروجين أتو مرض التصلب العصبي المتعدد التي يتم توفيرها من تقويض لهذا الجزيء.
   2. حساب النسبة المئوية الشامل لكل من الأحماض الأمينية في البروتينات بقسمة كميته في مغ/لتر في هيدروليساتي مبلغ إجمالي قدرة الأحماض الأمينية (بمجموع في مغ/لتر).
   3. حساب الوسائل والانحرافات المعيارية، والأخطاء المعيارية للوسط من البيانات التي تم الحصول عليها في التجارب المستقلة.
   4. حساب تركيز قائمة (مغ/لتر) لكل من الأحماض الأمينية بضرب النسبة المئوية لهذه الأحماض الأمينية في البروتينات (مغ أإ/ز البروتينات) بواسطة الكسر البروتين في الكتلة الأحيائية (ز البروتينات/ز دويتشه فيلة) ومحتوى الوزن الجاف (إنتاج الكتلة الأحيائية) في المتوسطة (ز DW/لتر).
2. ¹⁵ تجارب التتبع النظائري N
   1. استخدام جداول البيانات التي ترد في الجدول 9، حساب الكسور المسماة وغير المسماة النيتروجين الموجودة في قائمة الأحماض الأمينية (معبراً عنها بملغ N/لتر) من تلك التركيزات الإجمالية (معبراً عنها بملغ N/لتر)، وعلى الفاسدون النظائر. لكل من الأحماض الأمينية، الكسر المسمى يتوافق مع المنتج بين تركيزه الكلي وتخصيب النظائر المشعة، والجزء غير مسمى هو الفرق بين المجموع المبالغ المسماة.
   2. ثم تحديد جزء صغير من مجموع النتروجين في البروتينات التي ترد في قائمة الأحماض الأمينية كمياً في هذه الدراسة بجمع المبلغ الإجمالي لعلاء، الغليسين، Val، آسيا والمحيط الهادئ، الفنيل ألانين، لوي، إيل، Thr، سر، برو، ليز، وله، وغلو والأرجنتين (في ملغ N/لتر)، وقسمة المجموع جبل النيتروجين الواردة في البروتينات بهذا المبلغ.
   3. حساب النيتروجين المقدمة من ارجينين، الجلوتامين أو الأمونيوم التي تم استردادها في قائمة الأحماض كمياً في هذه الدراسة بجمع الكسر المسمى (بملغ N/لتر) من قائمة الأحماض الأمينية التي تم تقديرها كمياً في الدراسة (علاء، الغليسين، فال، آسيا والمحيط الهادئ، Phe، لوي، إيل، Thr، سر، برو، ليز، له، وغلو، والأرجنتين) أثناء تجارب حضور ¹⁵ن المسمى ارجينين، الجلوتامين، أو الأمونيوم وقسمة المبلغ الإجمالي للنيتروجين في قائمة كمياً الأمينية هذا الكسر يسمى النيتروجين الأحماض.
   4. تقييم مساهمة الأحماض الأمينية الأكثر وفرة 3 إلى تجمع داخل الخلايا من النتروجين التي تستخدم تخليق حيثياته الحيوي عن طريق الجمع بين البيانات من ¹³ج و ¹⁵ن النظائر الراسم تجارب (جدول البيانات في الجدول 7).
   5. من إجمالي المبلغ (معبراً عنه بوحدات مم) من قائمة Val، لوي، وايل، أو Thr، خصم الجزء مستمدة من الإدماج المباشر للمركبات المستهلكة (¹³ج التجارب) والجزء الذي كان سينثيتيزيد نوفو دي استخدام النتروجين من 3 المصادر الرئيسية لتقييم الكسر الذي كان سينثيتيزيد نوفو دي استخدام النتروجين من الأحماض الأمينية الأخرى.
   6. ثم، حساب نسبة الكمية من الأحماض الأمينية دي نوفو سينثيتيزيد استخدام النتروجين تقدمها جلن، والأرجنتين، و NH₄⁺ (مجموع المعرب عنها في مم) بمبلغ إجمالي قدرة قائمة الأحماض الأمينية (في مم) لقياس المساهمة ارجينين، الجلوتامين، والأمونيوم إلى تجمع النيتروجين داخل الخلايا.
3. ¹³ تجارب التتبع النظائري ج
   1. حساب الكسور المسماة وغير المسماة الأحماض الأمينية قائمة من التركيزات في ملم والنظائر الفاسدون من قائمة الأحماض الأمينية التي تم الحصول عليها من خلال تجارب حضور ¹³ج المسمى اليورانيوم المنخفض التخصيب، فال، إيل أو Thr-(انظر 6.2.1، الجدول 10).
   2. حساب كسور المتطايرة من التركيزات في ملم والفاسدون النظائر للمركبات المتطايرة التي تم الحصول عليها من خلال تجارب حضور ¹³ج المسمى اليورانيوم المنخفض التخصيب، فال أو إيل Thr ( المسماة وغير المسماة الجدول 10).

النتائج

ويبين الشكل 3 رسم تخطيطي لسير العمل الذي تنفذه الخميرة من تعدد مصادر النيتروجين التي تم العثور عليها أثناء تخمير النبيذ للتحقيق في الإدارة.
للحصول على نقاط مختلفة لأخذ العينات والخصائص البيولوجية معلمات – النمو وأنماط استهلاك النيتروجين وملف التعريف ?...

Discussion

التحديد الكمي لتقسيم المركبات عن طريق شبكات الأيضية باستخدام تجارب التتبع النظائري نهج واعدة لفهم عملية الأيض الميكروبي. هذه المنهجية، بينما طبقت بنجاح مع واحد أو اثنين من ركائز المسمى، لا يمكن حاليا تنفيذ دراسة أيض مصادر مختلفة باستخدام نظائر عنصري مسماة متعددة (أي، ركائز اثنين أو ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
D-Glucose	PanReac	141341.0416
D-Fructose	PanReac	142728.0416
DL-Malic acid	Sigma Aldrich	M0875
Citric acid monohydrate	Sigma Aldrich	C7129
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P5379
Potassium sulfate	Sigma Aldrich	P0772
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	230391
Calcium chloride dihydrate	Sigma Aldrich	C7902
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S9625
Ammonium chloride	Sigma Aldrich	A4514
Sodium hydroxide	Sigma Aldrich	71690
Manganese sulfate monohydrate	Sigma Aldrich	M7634
Zinc sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	Z4750
Copper (II) sulfate pentahydrate	Sigma Aldrich	C7631
Potassium iodine	Sigma Aldrich	P4286
Cobalt (II) chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	C3169
Boric acid	Sigma Aldrich	B7660
Ammonium heptamolybdate	Sigma Aldrich	A7302
Myo-inositol	Sigma Aldrich	I5125
D-Pantothenic acid hemicalcium salt	Sigma Aldrich	21210
Thiamine, hydrochloride	Sigma Aldrich	T4625
Nicotinic acid	Sigma Aldrich	N4126
Pyridoxine	Sigma Aldrich	P5669
Biotine	Sigma Aldrich	B4501
Ergostérol	Sigma Aldrich	E6510
Tween 80	Sigma Aldrich	P1754
Ethanol absolute	VWR Chemicals	101074F
Iron (III) chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	236489
L-Aspartic acid	Sigma Aldrich	A9256
L-Glutamic acid	Sigma Aldrich	G1251
L-Alanine	Sigma Aldrich	A7627
L-Arginine	Sigma Aldrich	A5006
L-Cysteine	Sigma Aldrich	C7352
L-Glutamine	Sigma Aldrich	G3126
Glycine	Sigma Aldrich	G7126
L-Histidine	Sigma Aldrich	H8000
L-Isoleucine	Sigma Aldrich	I2752
L-Leucine	Sigma Aldrich	L8000
L-Lysine	Sigma Aldrich	L5501
L-Methionine	Sigma Aldrich	M9625
L-Phenylalanine	Sigma Aldrich	P2126
L-Proline	Sigma Aldrich	P0380
L-Serine	Sigma Aldrich	S4500
L-Threonine	Sigma Aldrich	T8625
L-Tryptophane	Sigma Aldrich	T0254
L-Tyrosine	Sigma Aldrich	T3754
L-Valine	Sigma Aldrich	V0500
13C5-L-Valine	Eurisotop	CLM-2249-H-0.25
13C6-L-Leucine	Eurisotop	CLM-2262-H-0.25
15N-Ammonium chloride	Eurisotop	NLM-467-1
ALPHA-15N-L-Glutamine	Eurisotop	NLM-1016-1
U-15N4-L-Arginine	Eurisotop	NLM-396-PK
Ethyl acetate	Sigma Aldrich	270989
Ethyl propanoate	Sigma Aldrich	112305
Ethyl 2-methylpropanoate	Sigma Aldrich	246085
Ethyl butanoate	Sigma Aldrich	E15701
Ethyl 2-methylbutanoate	Sigma Aldrich	306886
Ethyl 3-methylbutanoate	Sigma Aldrich	8.08541.0250
Ethyl hexanoate	Sigma Aldrich	148962
Ethyl octanoate	Sigma Aldrich	W244910
Ethyl decanoate	Sigma Aldrich	W243205
Ethyl dodecanoate	Sigma Aldrich	W244112
Ethyl lactate	Sigma Aldrich	W244015
Diethyl succinate	Sigma Aldrich	W237701
2-methylpropyl acetate	Sigma Aldrich	W217514
2-methylbutyl acetate	Sigma Aldrich	W364401
3-methyl butyl acetate	Sigma Aldrich	287725
2-phenylethyl acetate	Sigma Aldrich	290580
2-methylpropanol	Sigma Aldrich	294829
2-methylbutanol	Sigma Aldrich	133051
3-methylbutanol	Sigma Aldrich	309435
Hexanol	Sigma Aldrich	128570
2-phenylethanol	Sigma Aldrich	77861
Propanoic acid	Sigma Aldrich	94425
Butanoic acid	Sigma Aldrich	19215
2-methylpropanoic acid	Sigma Aldrich	58360
2-methylbutanoic acid	Sigma Aldrich	193070
3-methylbutanoic acid	Sigma Aldrich	W310212
Hexanoic acid	Sigma Aldrich	153745
Octanoic acid	Sigma Aldrich	W279900
Decanoic acid	Sigma Aldrich	W236403
Dodecanoic acid	Sigma Aldrich	L556
Fermentor 1L	Legallais	AT1357	Fermenter handmade for fermentation
Disposable vacuum filtration system	Dominique Deutscher	029311
Fermenters (250 ml)	Legallais	AT1352	Fermenter handmade for fermentation
Sterile tubes	Sarstedt	62.554.502
Fermentation locks	Legallais	AT1356	Fermetation locks handmade for fermentation
BactoYeast Extract	Becton, Dickinson and Company	212750
BactoPeptone	Becton, Dickinson and Company	211677
Incubator shaker	Infors HT
Particle Counter	Beckman Coulter	6605697	Multisizer 3 Coulter Counter
Centrifuge	Jouan		GR412
Plate Butler Robotic system	Lab Services BV	PF0X-MA	Automatic instrument
Plate Butler Software	Lab Services BV		Robot monitor software
RobView			In-house developed calculation software
My SQL			International source database
Cimarec i Telesystem Multipoint Stirrers	Thermo Fisher Scientific	50088009	String Drive 60
BenchBlotter platform rocker	Dutscher	60903
Ammonia enzymatic kit	R-Biopharm AG	5390
Spectrophotometer cuvettes	VWR	634-0678
Spectrophotometer UviLine 9400	Secomam
Amino acids standards physiological - acidics and neutrals	Sigma Aldrich	A6407
Amino acids standards physiological - basics	Sigma Aldrich	A6282
Citrate lithium buffers - Ultra ninhydrin reagent	Biochrom	BC80-6000-06
Sulfosalycilic acid	Sigma Aldrich	S2130
Norleucine	Sigma Aldrich	N1398
Biochrom 30 AAA	Biochrom
EZChrom Elite	Biochrom		Instrument control and Data analysis software
Ultropac 8 resin Lithium	Biochrom	BC80-6002-47	Lithium High Resolution Physiological Column
Filter Millex GV	Merck Millipore	SLGVX13NL	Millex GV 13mm (pore size 0.22 µm)
Membrane filter PALL	VWR	514-4157	Supor-450 47mm 0.45µm
Vacuum pump Millivac Mini	Millipore	XF5423050
Aluminium smooth weigh dish 70mm	VWR	611-1380
Precision balance	Mettler		Specifications AE163
Dimethyl sulfoxid dried	Merck	1029310161	(max. 0.025% H2O) SeccoSolv
Combustion oven	Legallais
Pierce BCA protein assay kit	Interchim	UP40840A
Formic acid	Fluka	94318
Hydrogen peroxide	Sigma Aldrich	H1009
Hydrochloric Acid Fuming 37% Emsure	Merck	1003171000	Grade ACS,ISO,Reag. Ph Eur
Lithium acetate buffer	Biochrom	80-2038-10
Commercial solution of hydrolyzed amino acids	Sigma Aldrich	AAS18
L-Methionine sulfone	Sigma Aldrich	M0876
L-Cysteic acid monohydrate	Sigma Aldrich	30170
Pyrex glass culture tubes	Sigma Aldrich	Z653586
Pyridine	Acros Organics	131780500	99% Extrapure
Ethyl chloroformate	Sigma Aldrich	23131
Dichloromethane	Sigma Aldrich	32222
Vials	Sigma Aldrich	854165
Microinserts for 1.5ml vials	Sigma Aldrich	SU860066
GC/MS	Agilent Technologies	5890 GC/5973 MS
Chemstation	Agilent Technologies		Instrument control and data analysis software
Methanol	Sigma Aldrich	34860	Chromasolv, for HPLC
Acetonitrile	Sigma Aldrich	34998	ChromasolvPlus, for HPLC
N,N-Dimethylformamide dimethyl acetal	Sigma Aldrich	394963
BSTFA	Sigma Aldrich	33024
DB-17MS column	Agilent Technologies	122-4731	30m*0.25mm*0.15µm
Sodium sulfate, anhydrous	Sigma Aldrich	238597
Technical nitrogen	Air products	14629
Zebron ZB-WAX column	Phenomenex	7HG-G007-11	30m*0.25mm*0.25µm
Helium BIP	Air products	26699
Glass Pasteur pipettes	VWR	612-1702