Fluxo de trabalho baseado na combinação de traçador isotópico experimentos para investigar o metabolismo microbiano de múltiplas fontes de nutrientes

Resumo

Este protocolo descreve um procedimento experimental para quantitativamente e exaustivamente investigar o metabolismo de várias fontes de nutrientes. Este fluxo de trabalho, com base em uma combinação de experiências de traçador isotópico e um procedimento analítico, permite que o destino dos nutrientes consumidos e a origem metabólica de moléculas synthetized por microorganismos a ser determinada.

Resumo

Estudos no campo da microbiologia dependem da implementação de uma vasta gama de metodologias. Em particular, o desenvolvimento de métodos adequados substancialmente contribui para fornecer amplo conhecimento do metabolismo dos microrganismos crescendo em meios quimicamente definidos contendo nitrogênio exclusivo e fontes de carbono. Em contraste, a gestão através do metabolismo de várias fontes de nutrientes, apesar de sua ampla presença em ambientes naturais ou industriais, permanece praticamente inexplorada. Esta situação é principalmente devido à falta de metodologias adequadas, o que dificulta as investigações.

Nós relatamos uma estratégia experimental quantitativamente e exaustivamente explorar como metabolismo funciona quando um nutriente é fornecido como uma mistura de moléculas diferentes, ou seja, um recurso complexo. Aqui, descrevemos a sua aplicação para avaliar o particionamento de várias fontes de nitrogênio através da rede metabólica de levedura. O fluxo de trabalho combina informações obtidas durante as experiências de traçador de isótopo estável usando selecionado ¹³C - ou ¹⁵N-rotulado substratos. Primeiro consiste em fermentações paralelas e pode ser reproduzidas no mesmo meio, que inclui uma mistura de moléculas contendo N; no entanto, uma fonte de nitrogênio selecionado é rotulada de cada vez. Uma combinação de procedimentos analíticos (HPLC, GC-MS) é implementada para avaliar os padrões de rotulagem dos compostos alvo e para quantificar o consumo e a recuperação de substratos em outros metabólitos. Uma análise integrada do conjunto completo de dados fornece uma visão geral sobre o destino dos substratos consumidos dentro das células. Essa abordagem requer um protocolo exato para a coleta de amostras – facilitada por um sistema de monitoramento on-line de fermentações robô-assistida – e a realização de inúmeras análises demoradas. Apesar dessas limitações, permitiu compreender, pela primeira vez, o particionamento de várias fontes de nitrogênio em toda a rede metabólica de levedura. Nós elucidado a redistribuição do nitrogênio de fontes mais abundantes em direção a outros compostos de N e determinada a origem metabólica de moléculas voláteis e aminos-ácido proteinogenic.

Introdução

Entendimento como funciona o metabolismo microbiano é uma questão fundamental para a concepção de estratégias eficientes para melhorar os processos de fermentação e modulam a produção de compostos fermentativa. Avanços na genômica e genômica funcional nestas últimas duas décadas, em grande medida contribuídas para alargar o conhecimento da topologia de redes metabólicas em muitos microorganismos. Acesso a esta informação levou ao desenvolvimento de abordagens que aponta para uma visão abrangente da função celular¹. Essas metodologias muitas vezes dependem de uma interpretação baseada em modelo de parâmetros mensuráveis. Estes dados experimentais incluem, por um lado, taxas de absorção e produção do metabólito e, por outro lado, experiências quantitativa informação intracelular que é obtida do traçador de isótopo. Estes dados fornecem informações essenciais para a dedução da atividade na vivo de percursos diferentes em uma rede metabólica definidas^2,3,4. Atualmente, as técnicas analíticas disponíveis apenas permitem a detecção precisa de rotulagem padrões de moléculas quando usando um elemento único isótopo e, possivelmente, quando co etiquetando com dois elementos isotópicos. Além disso, na maioria das condições de crescimento, a fonte de carbono consiste apenas de um ou dois compostos. Por conseguinte, abordagens baseadas em ¹³C-isotópica traçadores de substratos de carbono foram amplamente e com êxito aplicadas para desenvolver uma compreensão completa do carbono rede metabólica operações^{5,6,7 ,8}.

Em contraste, em muitos ambientes naturais e industriais, o recurso de azoto disponível que suporta o crescimento microbiano, muitas vezes é composto de uma vasta gama de moléculas. Por exemplo, durante a fermentação do vinho ou cerveja, o nitrogênio é fornecido como uma mistura de 18 aminoácidos e amônia em concentrações variáveis de⁹. Essa matriz de compostos de N que são acessíveis para o anabolismo faz estas condições complexas de mídia extremamente diferentes daqueles comumente usados para estudos fisiológicos, como o último é obtido usando uma fonte única de nitrogênio, normalmente de amónio.

Em geral, internalizada nitrogênio compostos podem ser diretamente incorporados em proteínas ou catabolizados. A estrutura da rede do metabolismo de nitrogênio em muitos microorganismos, incluindo o fermento Saccharomyces cerevisiae, é muito complexa, em conformidade com a diversidade de substratos. Esquematicamente, este sistema é baseado na combinação do núcleo central do metabolismo de nitrogênio que catalisa a interconversão de glutamina, glutamato e α-cetoglutarato^10,,¹¹, com transaminases e deaminases. Através desta rede, grupos amina de amónio ou outros aminoácidos são reunidos e α-ceto ácidos liberados. Estes intermediários são também synthetized a central carbono metabolismo (CCM)^12,13. Este grande número de reações ramificadas e intermediários, envolvidos em ambos o catabolismo de fontes exógenas de nitrogênio e o anabolismo dos aminos-ácido proteinogenic, cumpre os requisitos anabólicos das células. A atividade através destes diferentes rotas interconectadas resulta também na excreção de metabólitos. Em particular, α-ceto ácidos podem ser redirecionados através da via de Ehrlich para produzir alcoóis superiores e seus acetato éster derivados¹⁴, que são contribuintes essenciais para os perfis sensoriais dos produtos. Posteriormente, como funciona o metabolismo de nitrogênio desempenha um papel fundamental na produção de biomassa e a formação de moléculas voláteis (aroma).

As reações, enzimas e genes envolvidos no metabolismo de nitrogênio são extensivamente descritos na literatura. No entanto, a questão da distribuição de várias fontes de nitrogênio em toda uma rede metabólica não ainda foi resolvida. Existem duas razões principais que explicam esta falta de informação. Em primeiro lugar, tendo em conta a complexidade importante da rede do metabolismo de nitrogênio, uma grande quantidade de dados quantitativos é necessária para um completo entendimento da sua operação, que não estava disponível até agora. Segundo, muitos experimentais restrições e limitações dos métodos analíticos impediram a implementação de abordagens que foram usados anteriormente para a elucidação da função do CCM.

Para superar esses problemas, nós escolhemos desenvolver uma abordagem de nível de sistema que se baseia a reconciliação de dados de uma série de experimentos de traçador isotópico. O fluxo de trabalho inclui:
-Um conjunto de fermentações realizados sob as mesmas condições ambientais, enquanto uma fonte de nutrientes selecionada diferente (substrato) é rotulada de cada vez.
-Uma combinação de procedimentos analíticos (HPLC, GC-MS) para uma determinação precisa, em diferentes fases da fermentação, a concentração residual de rotulada de substrato e a concentração e o enriquecimento isotópico de compostos derivados de o catabolismo da molécula rotulado, incluindo a biomassa derivada.
-Um cálculo do balanço de massa e isotópico para cada consumido molécula etiquetada e uma posterior análise integrada do conjunto de dados para obter uma visão global da gestão de múltiplas fontes de nutrientes por microorganismos através da determinação de taxas de fluxo .

Para aplicar esta metodologia, deve ser dada atenção ao comportamento reprodutível dos microorganismos/tensão entre culturas. Além disso, devem ser colhidas amostras de diferentes culturas durante o andamento de fermentação bem definidos mesmo. No trabalho experimental relatado neste manuscrito, um sistema de robô-assistida é usado para monitoramento on-line de fermentações para contabilizar essas restrições.

Além disso, é essencial escolher um conjunto de substratos rotulados (composto, natureza e posição da rotulagem) que é apropriado para abordar o problema científico do estudo. Aqui, arginina, glutamina e ¹⁵N-rotulado amónio foram selecionados como as três fontes de nitrogênio principais encontradas no suco de uva. Isso permitiu avaliar o padrão de redistribuição do nitrogênio de compostos consumidos para o aminos-ácido proteinogenic. Nós também objetivou investigar o destino do backbone de aminoácidos consumidos e sua contribuição para a produção de moléculas voláteis de carbono. Para cumprir este objectivo, uniformemente ¹³C-rotulado leucina, valina, treonina e isoleucina foram incluídos no estudo como aminoácidos, que são derivados de grandes intermediários da via de Ehrlich.

No geral, nós exploramos quantitativamente como fermento gerencia um recurso complexo nitrogênio pela redistribuição de fontes exógenas de nitrogênio para cumprir suas exigências anabolizantes durante a fermentação enquanto Adicionalmente, removendo o excesso de precursores de carbono como moléculas voláteis. O procedimento experimental relatado neste artigo pode ser aplicado para investigar outras múltiplas fontes de nutrientes usados por qualquer outro microorganismo. Parece ser uma abordagem adequada para a análise do impacto do fundo genético ou condições ambientais sobre o comportamento metabólico de microorganismos.

Protocolo

1. fermentação e amostragem

1. Preparação de mídia e fermentadores
   Nota: Todas as fermentações são efectuadas em paralelo, usando a mesma tensão e na mesma quimicamente definidas sintético médio (SM, composição fornecida na tabela 1), que inclui uma mistura de amônia e aminoácidos como fontes de nitrogênio¹⁵. Para cada fermentação, um composto único nitrogênio é fornecido exclusivamente em um uniforme etiquetados ¹³C ou formulário ¹⁵N (100%), enquanto os outros permanecem sem rótulo. Para cada fonte de nitrogênio rotulado que é usado no conjunto de experimentos (aqui: ¹⁵NH₄, U -¹⁵N4-Arg, U -¹⁵N2-Gln, U -¹³C6-Leu, U -¹³C5-Val, U -¹³C6-Ile, U -¹³C4-Thr), dois fermentadores são preparados. Para cada condição, fermentação duplicada é realizada usando apenas sem rótulo moléculas (fermentações de controle 7).
   1. Para cada fonte de N a ser estudado, preparar 500 mL de SM médio que contém todas as fontes de nitrogênio listadas na tabela 1, com excepção do composto a ser usado em 100% rotulado formulário.
      Nota: A molécula etiquetada é adicionada nas próximas etapas.
   2. Pasteurizar a cada meio em um frasco de 1 L (10 min, 100 ° C) que contém uma barra de agita magnética. Pesar a quantidade adequada de molécula etiquetada para atingir a concentração final que é relatada na tabela 1 e dissolvê-lo no meio.
   3. Esterilize o meio usando um sistema de filtragem de vácuo descartável (membrana de acetato de celulose, 0,22 µm). Usando uma proveta estéril, divida o meio entre dois fermentadores pré-esterilizados (250 mL) que contêm uma barra de agita magnética e estão equipados com fechaduras de fermentação para evitar a entrada de oxigênio, mas permitir a liberação de CO₂.
   4. Aqueça os frascos de fermentação a 28 ° C, colocando-os na sala de incubação para 1 noite (temperatura de 28 ° C).
2. Inoculação e monitoramento de fermentações
   1. Cresce a cepa de S. cerevisiae em tubos estéreis, contendo 10 mL de meio YPD a 28 ° C, com agitação (150 rpm) por 12 h. Em seguida, Pipetar 1 mL de YPD preculture e transferi-lo para 10 mL de meio de SM (em tubos estéreis de 15 mL). Incube a cultura para 12 horas a 28 ° C, com agitação (150 rpm).
   2. Sob fluxo laminar, recolher uma alíquota de preculture e quantificar a população de células usando um contador de partículas eletrônico que é equipado com uma abertura de 100 µm. Centrifugue o preculture (2.000 x g, 15 min, 4 ° C) e suspender o sedimento em um volume adequado de água estéril para obter uma concentração final de 2,5 x 10⁸ células/mL. Inocule cada fermentador com 1 mL de suspensão de célula.
      Nota: O sistema robótico usado para monitorar o progresso da fermentação é descrito na Figura 1.
   3. Prepare a plataforma de fermentação instalando os fermentadores em guias de apoio que são colocados sobre as placas de agita 21-posição corretamente e definir a taxa de agita a 270 rpm. Para iniciar o monitoramento on-line de cada fermentação, iniciar o aplicativo de controle do robô, em seguida, clique no botão "Iniciar teste" e selecione o volume de fermentação a efectuar (300 mL).
   4. A interface exibida permite a indicação do número e a posição de fermentadores na plataforma. Para garantir que isso ocorrer, clique com o botão direito sobre a localização do slot e escolher "enable" para ativar o monitoramento de fermentador localizado nessa posição.
   5. Inicialize o software de cálculo, permanentemente em execução no sistema, antes de iniciar a aquisição de peso. Clique no botão "Initialiser" e validar com "okey". Clique sobre o botão"Iniciar" do aplicativo para iniciar as aquisições de peso-controle do robô.
3. Procedimento de amostragem
   Nota: Para cada fermentador, amostras quando a CO₂ produção (valor mostrado o computador que está executando o software de cálculo on-line) atinge o set-point necessário: 5, 10, 40 e 90 g/L neste estudo.
   1. Procedimento para culturas com compostos rotulados de amostragem.
      1. Centrifugar duas amostras de 6 mL (2.000 x g, 5 min, 4 ° C). Salvar e armazenar os sobrenadantes congelados em duas alíquotas a-80 ° C. Lave as pelotas duas vezes com 5 mL de água destilada e loja a-80 ° C para a medição dos avanços isotópicas.
   2. Procedimento para culturas sem compostos rotulados de amostragem
      1. Colha 10 mL de cultura, que será utilizada para determinação do peso seco. Granule as células de duas amostras de 10ml por centrifugação (2.000 x g, 5 min, 4 ° C). Lave as pelotas duas vezes com 10 mL de água destilada e armazená-los a-80 ° C para a determinação do teor de proteínas e aminoácidos.

2. quantificação de fontes de nitrogênio consumido

1. Determinação enzimática das concentrações de amônia residual
   Nota: A determinação da concentração de amônia em sobrenadantes é realizada usando um kit de enzimáticos comercial; todos os reagentes são fornecidos pelo fabricante.
   1. Preparar uma solução padrão de amônia (61,4 mg/L), dissolvendo a 25 mg de precisamente pesada (NH₄)₂então₄ num balão volumétrico de 100 mL.
   2. Para cumprir as instruções do fabricante, realize uma diluição de 1:2 das amostras que foram tiradas antes da fermentação e a 5 g/L de CO₂ lançado. Ajuste o pH das amostras de aproximadamente 8 adicionando 1m KOH. Tome nota do volume adicionado e levar em conta o fator de diluição.
   3. Em cubetas de Espectrofotômetro de 4 mL, mistura, 100 µ l de amostra (diluída se necessário), água destilada ou solução de amoníaco padrão com 2 mL de Reagente 1 (0,75 mM ADP e 30 U/mL glutamato desidrogenase no buffer de pH 7,8) e 500 µ l de Reagente 2 (NADH 1,3 mM). Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente e ler a absorbância do NADH a 340 nm (A1).
   4. Adicionar 500 µ l de Reagente 3 (60mm α-cetoglutarato em tampão de pH 8), incubar a amostra por 20 min em temperatura ambiente e ler a absorbância do NADH a 340 nm (A2).
   5. Calcule a concentração de amônia usando:
      C_amônia (g/L) = 0.083 x [(0.839 x A1-A2)_amostra- (0.839 x A1-A2)_{água destilada}]
   6. Verifique a concentração correta é obtida com a solução-padrão.
2. Determinação cromatográfica das concentrações residuais de aminoácido
   Nota: A determinação das concentrações de aminoácidos em sobrenadantes é conseguida usando um sistema de análise de aminoácidos dedicado baseado em cromatografia de troca iônica com post de derivatização de coluna de N-compostos com ninidrina, que permite sua Detecção colorimétrica.
   1. Prepare uma solução de referência, adicionando-se 200 µ l de uma mistura comercial de aminoácidos neutros e ácidos, 200 µ l de uma mistura comercial de aminoácidos básicos e 200 µ l de glutamina de 2,5 mM a 400 µ l de tampão de citrato de lítio 200 mM, pH 2.2. Esta solução de referência quimicamente definidas é tratada como uma amostra.
   2. Adicione 200 µ l de solução de ácido sulfosalicílico 25% (p/v) que contém 2,5 mM norleucina (padrão interno) a 800 µ l de amostra para remover moléculas com alto peso molecular. Incube durante 1 h a 4 ° C, o centrifugador (3.000 x g, 10 min, 4 ° C) e o filtro através de uma membrana de nitrocelulose de tamanho de poros de 0,22 µm (seringas).
   3. No software do programador, clique no botão "Executar" para iniciar a cromatografia líquida de análises (LC) com o analisador equipado com uma coluna permutadora de catiões (forma de lítio). Eluir os aminoácidos com buffers de lítio sucessivas para criar um gradiente de pH e um gradiente na concentração de Counter-íons em combinação com um gradiente de temperatura (tabela 2).
   4. Quantificar os compostos de azoto após derivatização ninidrina por um detector espectrofotométrico a 570 nm (roxo coloração: reação entre um grupo de ninidrina e amina de aminoácidos) e 440 nm (amarelo coloração: reação entre o grupo de ninidrina e imina prolina).
   5. Realize uma calibração interna de ponto único, usando a solução de referência e norleucina como padrão interno para calcular as concentrações de aminoácidos nas amostras usando o software do fabricante.

3. quantificação dos aminos-ácido Proteinogenic

1. Medição do peso seco celular
   1. Filtro 10 mL da cultura através de um filtro de nitrocelulose (poros tamanho 0,45 µm) que é pré-pesados em um copo de alumínio, utilizando um dispositivo de vácuo. Lave duas vezes com 50 mL de água destilada.
   2. Coloque o filtro no copo de alumínio e secar em forno de calor a 105 ° C por 48 h (até que não há mais mudança de peso é observada) antes de contra-peritagem o filtro no copo. Calcule a diferença de peso.
   3. Calcule a média de pelo menos 3 medições independentes para determinar com precisão o peso de pilha seca de cultura de levedura.
2. Quantificação do teor de proteínas de células
   Nota: A quantificação da fração de proteínas das células é realizada pelo menos em triplicado utilizar pastilhas de célula sem rótulo que foram obtidas conforme descrito na seção 1.3.2.
   1. Extrair proteínas pela adição de 1 mL de solução de DMSO (50% v/v) de pelotas congeladas e incubar a 105 ° C por 1h em forno de calor seco.
   2. Quantificar o teor de proteínas em extratos de DMSO usando o ensaio colorimétrico bioquímico que se baseia a redução de proteínas de Cu +⁺ em íons de Cu⁺ que são ainda mais precipitadas pelo ácido bicinchoninic em um complexo azul (ensaio BCA).
3. Determinação das contribuições relativas de aminoácidos em proteínas
   Nota: O perfil de aminoácidos proteinogenic é determinado pelo menos em triplicado de pelotas célula sem rótulo (1.3.2.).
   1. Prepare um extracto oxidado, suspendendo o centrifugado em 200 µ l de ácido perfórmico (90% de ácido fórmico, 10% de peróxido de hidrogênio). Incubar por 4 h a 4 ° C e parar a reação pela adição de sulfato de sódio de 33,6 mg.
      Nota: A etapa de oxidação é necessária para converter a cisteína e a metionina em metionina sulfona e cisteico ácido, o que será ainda mais quantificar por cromatografia de troca iônica. No entanto, alguns aminoácidos (tirosina, fenilalanina, histidina e arginina) são desnaturados durante o tratamento da oxidação. Por conseguinte, preparam-se dois hidrolisados (com e sem oxidação).
   2. Adicionar 800 µ l de HCl 6N célula pelotas ou oxidado extrato e incubar a amostra em um tubo de vidro hermeticamente fechados para 16 h a 110 ° C em um forno de calor seco. Adicionar 200 µ l de 2,5 mM norleucina e remover HCl com uma corrente de azoto. Lave (resuspending o extrato seco e em seguida, removendo o líquido com um fluxo de nitrogênio), duas vezes com 800 µ l de água destilada e, em seguida, com 800 µ l de etanol. Ocupa-se em 800 µ l de tampão de acetato de lítio 200 mM, pH 2.2.
      Nota: Deve ser dada atenção para o tempo de incubação para a hidrólise como alguns aminoácidos não são estáveis em condições ácidas. A fração de triptofano em proteína é estimada a partir de dados encontrados no literatura¹⁶, como este aminoácido é inteiramente desnaturado durante a hidrólise de HCl.
   3. Prepare um hidrolisado-padrão para a calibração interna de ponto único. Adicione 160 µ l de uma solução comercial de aminoácidos hidrolisados a 840 µ l de tampão de acetato do lítio 200 mM, pH 2.2, que contém 625 sulfona de metionina µM, 625 de ácido cisteico µM e 625 norleucina µM.
   4. Determine a concentração relativa de aminoácidos em proteínas usando o método cromatográfico, descrito na seção 2.2.
4. Cálculos
   1. Calcule a percentagem de peso de cada aminoácido em proteínas, dividindo a quantidade medida de cada aminoácido (mg/L) pela quantidade total de ácido aminado que foi medido no extracto de proteína (soma em mg/L).
   2. Multiplica esse percentual pela concentração de proteínas em cultura (mg/L), ou seja, o produto entre o teor de proteína da biomassa e o peso seco, para avaliar a concentração de cada aminoácido proteinogenic na cultura (mg/L).

4. medida de enriquecimento isotópico de aminos-ácido Proteinogenic

Nota: Para a medição de enriquecimento isotópico de aminos-ácido proteinogenic, use as célula rotulada de Pelotas. Três agentes diferentes são usados para a etapa de derivatização para quantificar o enriquecimento isotópico de aminoácidos. As intensidades de íons de cluster são medidas para estimar os padrões de rotulagem dos aminoácidos. O sinal de cada íon de cluster corresponde a abundância de isotopomers a massa (m₀ = sem rotulagem, m_{+ 1} = 1 átomo rotulado,...) de um fragmento de ácido aminado. Um exemplo de um cromatograma é obtida após o procedimento DMADMF é fornecido na Figura 2.

1. Hidrólise de biomassa
   1. Hidrolise as pelotas de célula (correspondendo a 1-2 mg de biomassa seca) adicionando 1,2 mL de 6 M de HCl e incubar a amostra para 16 h a 105 ° C em tubos de vidro hermeticamente fechado em um forno de calor seco.
   2. Adicione 1,2 mL de água destilada e centrifugação a 3.000 x g por 5 min remover restos celulares. Distribua o sobrenadante em frações de 6 400 µ l em tubos de vidro aberto. Seque as frações em um forno de calor a 105 ° C até atingir a consistência de xarope (4-5h).
2. Derivatização de Ethylchloroformate (ECF)
   1. Dissolver o hidrolisado secado em 200 µ l de 20mm HCl; em seguida, adicione o µ l 133 de piridina: etanol (1:4). Adicione 50 µ l de ECF para derivatize os aminoácidos e esperar até que todos os CO₂ foi lançado. Transfira a mistura para centrifugar os tubos que contêm 500 µ l do diclorometano para extrair os pyrazole compostos.
   2. Vórtice os tubos durante 10 s e centrifugar por 4 min a 10.000 g x; recolha a fase orgânica inferior, com uma pipeta Pasteur e transferência para os frascos de GC que contêm inserções de vidro cônico, de modo que as amostras podem ser injetadas diretamente dentro do instrumento de GC/MS.
3. (N, N)-derivatização de acetal (DMFDMA) de dimetil dimetilformamida.
   1. Dissolva o hidrolisado secado em 50 µ l de metanol e 200 µ l de acetonitrilo. Adicione 300 µ l de DMFDMA. O tubo de vórtice e transferência as amostras para mostruário de GC frascos que contêm inserções de vidro cônico.
4. N, derivatização de trifluoroacetamide (BSTFA) O-Bis (trimetilsilil)
   1. Suspenda o hidrolisado em 200 µ l de acetonitrilo. Acrescente 200 µ l de BSTFA, fechar hermeticamente o tubo de vidro e incube por 4 h a 135 ° C antes de transferir o extrato diretamente para frascos de GC.
5. Análise por CG-em
   1. Analise amostras com um cromatógrafo de gás que está equipado com um injector de mostruário e é acoplado a um espectrômetro de massa.
      1. Utilize software específicos para o instrumento de controle e analisar os cromatogramas. No menu "Sequence", clique na "tabela de Log de exemplo" para criar a lista de exemplo e clique no botão "Executar" para iniciar as injeções.
         Nota: O cromatógrafo a gás é equipado com uma coluna capilar de sílica 30 m x 0,25 mm apolar com uma espessura de película 0,15 μm. Temperatura do espectrômetro de massa quadrupolo a 150 ° C e mantenha a linha de transferência a 250 ° C para todas as análises. Três programas analíticos, cada um específico para cada agente de derivatização, são usados.
      2. Derivados ECF: Uso de hélio como fase móvel com um fluxo de 1,2 mL/min. Regule a temperatura da entrada a 230 ° C e que da origem a 250 ° C. Programe o mostruário para injetar 1 µ l de amostras com uma relação de divisão de 3:1. Executar as análises, aumentando gradualmente a temperatura do forno da seguinte forma: 130 ° C por 3 min; gradiente de 15 ° C/min a 260 ° C; manter a temperatura a 260 ° C por 20 min.
      3. Derivados DMFDMA: Uso de hélio como fase móvel com um fluxo constante de 1,2 mL/min. Regule a temperatura da entrada a 230 ° C e que da origem a 250 ° C. Programe o mostruário para injetar 1 µ l de amostras com uma relação de divisão de 3:1. Executar as análises, aumentando gradualmente a temperatura do forno da seguinte forma: 60 ° C, durante 1 min; gradiente de 20 ° C/min até 130 ° C; segundo gradiente de 4 ° C/min a 260 ° C; manter a temperatura a 260 ° C por 10 min.
      4. Derivados BSTFA: Uso de hélio como fase móvel com um fluxo constante de 1,2 mL/min. Regule a temperatura da entrada a 275 ° C e que da origem a 300 ° C. Executar as análises (injeção: 1 µ l), gradualmente aumentando a temperatura do forno da seguinte forma: 110 ° C por 1 min; primeiro gradiente de 2 ° C/min a 154 ° C; segundo gradiente de 5 ° C/min até 300 ° C; manter a temperatura de 300 ° c por 10 min.
      5. Procedimento deteção: Para cada modo de derivatização, injetar uma amostra (1 µ l) em modo de varredura com ionização de elétron positivo impacto em 70 eV e tomar nota do tempo de retenção de cada aminoácido.
      6. Usar esses valores para definir as janelas de tempo ao longo do cromatograma e de íons de diferentes selecionados, que são característicos de cada aminoácido e listados na tabela 3; esses valores devem ser incluídos para cada aminoácido. Incluir esta informação no programa SIM deteção e executar as análises no modo SIM com ionização de elétron positivo impacto em 70 eV.
   2. Coletar os resultados das análises; ou seja, para cada aminoácido, grave um cluster de intensidades que correspondem a seus diferentes isotopomers em massa. Processar os dados usando o dedicatedsoftware¹⁷ para corrigir para a rotulagem natural e calcular o enriquecimento isotópico dos aminoácidos proteinogenic (definido como a fração rotulada de um aminoácido com relação a sua quantidade total da proteína amostras).
      Nota: O enriquecimento isotópico de uma molécula (ou seja), expressos em percentagem, é calculada dividindo a soma das intensidades corrigidas da massa isotopomers com rotulagem (m₁, m₂,.... m_n) pela soma do corrigido intensidades de todas as isotopomers em massa (m₀, m₁, m₂,... m,_n):
      I. E. = (m₁ + m₂ +... + m_n) / (m₀ + m₁+ m₂ +... + m,_n)

5. quantificação e enriquecimento isotópico de compostos voláteis

1. Extração de compostos voláteis rotuladas
   1. Adicionar 10 µ l de deuterado padrões internos para 5 mL do sobrenadante (concentração final de compostos deuterados: 100 µ g/L) em um tubo de vidro de 15 mL. Adicionar 1 mL de diclorometano, firmemente fechar os tubos e agitá-los em uma plataforma de balanço de 20 min. centrifugar por 5 min a 3.000 x g e recolher a fase orgânica inferior em um tubo de vidro de 15 mL. Repeti a extracção de diclorometano.
   2. Seque o extrato orgânico mais de 500 mg de sulfato de sódio anidro e recolher a fase líquida, com uma pipeta Pasteur. Concentrar o extrato por um fator de quatro sob fluxo de nitrogênio e transferir para um frasco de mostruário de GC.
2. GC-MS quantificação de compostos voláteis
   1. Equipar o cromatógrafo a gás com uma coluna capilar de sílica fundida de 30 m x 0,25 mm com 0,25 μm de espessura de filme e aplicar um fluxo constante de hélio de 1,0 mL/min. Segure o injetor e a linha de transferência a 250 ° C.
   2. Injectar 2 µ l da amostra com uma relação de divisão de 10:1 e separar as moléculas voláteis extraídas usando o seguinte perfil de temperatura do forno: manter a temperatura por 3 min a 40 ° C, aumentar até 4 ° C/min até 220 ° C e mantenha o forno a 220 ° C por 20 min.
   3. Detectar os compostos usando um espectrômetro de massa com sua temperatura de origem definido a 230 ° C e sua temperatura de espectrômetro de massa quadrupolo fixado em 150 ° C. Grave os espectros de massa no modo de monitoração de íon selecionado (SIM) com ionização de elétron positivo impacto em 70 eV e utilizando os clusters de íons específicos para os compostos voláteis que são relatados na tabela 4.
   4. Use uma calibração externa de 7 pontos para quantificar as concentrações de moléculas voláteis das somas das intensidades do cluster do íon correspondente. Prepare Soluções conservadas em estoque de cada composto (10 g/L) em 100% de etanol. Então, prepare-se soluções-padrão para cada classe de moléculas voláteis (ésteres, acetatos, ácidos e álcoois), misturando as soluções. Finalmente, dilua a quantidades diferentes das soluções-padrão em uma solução hidroalcoólica de 12% contendo 5 g/L ácido tartárico com o pH ajustado para 3.3 para preparo de soluções de calibração.
   5. Em paralelo, corrigir para a rotulagem natural das intensidades de cada cluster de íon e calcular o enriquecimento isotópico de compostos voláteis, que é definido como a fração rotulada das moléculas e é expresso como uma porcentagem usando o software dedicado ¹⁷.

6. cálculos para uma análise integrada do conjunto de dados

1. Recolha dos dados brutos
   1. Usando as planilhas mostradas nas tabelas 5, 6, 7 e 8, Insira os valores de dados brutos que correspondem à concentração dos aminoácidos extracelulares, peso seco de célula, teor de proteínas das células, a concentração de moléculas voláteis e isotópica enriquecimento dos aminos-ácido proteinogenic e moléculas voláteis.
      Nota: Os dados mostrados nas tabelas são expressas em mM. Todos os resultados também são expressos em mg/L, multiplicando-se os valores em mM pelo peso molecular de cada molécula ou em mg N/L multiplicando a concentração milimolar de um amino-ácido proteinogenic a massa atômica do nitrogênio (14 u) e pelo número de ato de nitrogênio MS que são fornecidos pelo catabolismo desta molécula.
   2. Calcule a percentagem em massa de cada aminoácido em proteínas dividindo sua quantidade em mg/L no hidrolisado pela quantidade total de aminoácidos (sua soma em mg/L).
   3. Calcule significa, desvios-padrão e erros-padrão da média a partir dos dados obtidos nos experimentos independentes.
   4. Calcular a concentração de proteinogenic (mg/L) para cada aminoácido multiplicando-se o percentual deste aminoácido em proteínas (mg aa/g de proteínas), a fração de proteína na biomassa (g proteínas/g DW) e o resíduo seco (produção de biomassa), na médio (g DW/L).
2. ¹⁵ Experimentos de traçador isotópico N
   1. Usando as planilhas que são apresentadas na tabela 9, calcular as frações sem rótulo e rotuladas de nitrogênio que estão presentes em aminoácidos proteinogenic (expressos em mg N/L) de suas concentrações totais (expressas em mg de N/L) e suas isotópicos avanços. Para cada aminoácido, rotulada fração corresponde ao produto entre a sua concentração total e seu enriquecimento isotópico, e a parte sem rótulo é a diferença entre o total e os montantes rotulados.
   2. Em seguida, determinar a fração de nitrogênio total em proteínas contido em aminoácidos proteinogenic quantificados neste estudo soma o montante total da Ala Gly, Val, Asp, Phe, Leu, Ile, Thr, Ser, Pro, Lys, dele, Glu e Arg (em mg N/L) e o total, dividindo um Monte do nitrogênio contido nas proteínas por este montante.
   3. Calcular o nitrogênio fornecido por arginina, glutamina ou amónia que foi recuperada nos ácidos proteinogenic quantificados neste estudo, somando-se a fração rotulada (em mg N/L) de aminos-ácido proteinogenic que foram quantificados no estudo (Ala Gly, Val, Asp, PHE, Leu, Ile, Thr, Ser, Pro, Lys, dele, Glu e Arg) durante experimentos na presença de ¹⁵N-rotulado de arginina, glutamina, ou de amónio e dividindo esta fração de nitrogênio rotulados pela quantidade total de azoto no proteinogenic quantificado amino ácidos.
   4. Avalie a contribuição dos 3 aminoácidos mais abundantes para o pool intracelular de nitrogênio utilizado para a biossíntese de novo combinando dados do ¹³C e experimentos de traçador de isótopo de ¹⁵N (planilha na tabela 7).
   5. Do montante total (expressado em milímetros) de proteinogenic Val, Leu, Ile ou Thr, deduzir a parte derivada da incorporação direta de compostos consumidos (¹³C experimentos) e a parte que foi synthetized de novo usando nitrogênio do 3 principais fontes a fim de avaliar a fração que foi synthetized de novo usando nitrogênio de outros aminoácidos.
   6. Em seguida, calcular a razão entre a quantidade de aminoácido de novo synthetized usando nitrogênio fornecido por Gln, Arg e NH₄⁺ (soma expressada em mM) a quantidade total de proteinogenic aminoácidos (em mM) para quantificar a contribuição de arginina, glutamina e amónio para o pool de nitrogênio intracelular.
3. ¹³ C experimentos de traçador isotópico
   1. Calcular as frações etiquetadas e sem rótulo dos aminoácidos proteinogenic das concentrações expressados em mM e avanços isotópicos dos aminos-ácido proteinogenic que foram obtido durante experimentos na presença de ¹³C-rotulado Leu, Val, Ile ou Thr. (ver 6.2.1, quadro 10).
   2. Calcular as frações sem rótulo e rotuladas de compostos voláteis de concentrações expressados em mM e avanços isotópicos de compostos voláteis que foram obtidos durante experimentos na presença de ¹³C-rotulado Leu, Val, Ile ou Thr ( Tabela 10).

Resultados

A Figura 3 apresenta um diagrama de fluxo de trabalho que foi implementado para investigar a gestão pelo fermento de várias fontes de nitrogênio que são encontrados durante a fermentação do vinho.
Para diferentes pontos de amostragem, as características de parâmetros – crescimento biológico, padrões de consumo de nitrogênio e o perfil de aminoácidos, proteinogenic demonstrará uma grande reprodutibilidade entre fermentações (

Discussão

Quantificar o particionamento de compostos através de redes metabólicas usando experimentos traçador isotópico é uma abordagem promissora para a compreensão do funcionamento do metabolismo microbiano. Esta metodologia, quando aplicada com êxito com um ou dois substratos rotulados, atualmente não pode ser implementada para estudar o metabolismo de várias fontes usando vários isótopos elementais rotulados (ou seja, mais de dois substratos). Com efeito, as técnicas analíticas disponíveis permitem a de...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
D-Glucose	PanReac	141341.0416
D-Fructose	PanReac	142728.0416
DL-Malic acid	Sigma Aldrich	M0875
Citric acid monohydrate	Sigma Aldrich	C7129
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P5379
Potassium sulfate	Sigma Aldrich	P0772
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	230391
Calcium chloride dihydrate	Sigma Aldrich	C7902
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S9625
Ammonium chloride	Sigma Aldrich	A4514
Sodium hydroxide	Sigma Aldrich	71690
Manganese sulfate monohydrate	Sigma Aldrich	M7634
Zinc sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	Z4750
Copper (II) sulfate pentahydrate	Sigma Aldrich	C7631
Potassium iodine	Sigma Aldrich	P4286
Cobalt (II) chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	C3169
Boric acid	Sigma Aldrich	B7660
Ammonium heptamolybdate	Sigma Aldrich	A7302
Myo-inositol	Sigma Aldrich	I5125
D-Pantothenic acid hemicalcium salt	Sigma Aldrich	21210
Thiamine, hydrochloride	Sigma Aldrich	T4625
Nicotinic acid	Sigma Aldrich	N4126
Pyridoxine	Sigma Aldrich	P5669
Biotine	Sigma Aldrich	B4501
Ergostérol	Sigma Aldrich	E6510
Tween 80	Sigma Aldrich	P1754
Ethanol absolute	VWR Chemicals	101074F
Iron (III) chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	236489
L-Aspartic acid	Sigma Aldrich	A9256
L-Glutamic acid	Sigma Aldrich	G1251
L-Alanine	Sigma Aldrich	A7627
L-Arginine	Sigma Aldrich	A5006
L-Cysteine	Sigma Aldrich	C7352
L-Glutamine	Sigma Aldrich	G3126
Glycine	Sigma Aldrich	G7126
L-Histidine	Sigma Aldrich	H8000
L-Isoleucine	Sigma Aldrich	I2752
L-Leucine	Sigma Aldrich	L8000
L-Lysine	Sigma Aldrich	L5501
L-Methionine	Sigma Aldrich	M9625
L-Phenylalanine	Sigma Aldrich	P2126
L-Proline	Sigma Aldrich	P0380
L-Serine	Sigma Aldrich	S4500
L-Threonine	Sigma Aldrich	T8625
L-Tryptophane	Sigma Aldrich	T0254
L-Tyrosine	Sigma Aldrich	T3754
L-Valine	Sigma Aldrich	V0500
13C5-L-Valine	Eurisotop	CLM-2249-H-0.25
13C6-L-Leucine	Eurisotop	CLM-2262-H-0.25
15N-Ammonium chloride	Eurisotop	NLM-467-1
ALPHA-15N-L-Glutamine	Eurisotop	NLM-1016-1
U-15N4-L-Arginine	Eurisotop	NLM-396-PK
Ethyl acetate	Sigma Aldrich	270989
Ethyl propanoate	Sigma Aldrich	112305
Ethyl 2-methylpropanoate	Sigma Aldrich	246085
Ethyl butanoate	Sigma Aldrich	E15701
Ethyl 2-methylbutanoate	Sigma Aldrich	306886
Ethyl 3-methylbutanoate	Sigma Aldrich	8.08541.0250
Ethyl hexanoate	Sigma Aldrich	148962
Ethyl octanoate	Sigma Aldrich	W244910
Ethyl decanoate	Sigma Aldrich	W243205
Ethyl dodecanoate	Sigma Aldrich	W244112
Ethyl lactate	Sigma Aldrich	W244015
Diethyl succinate	Sigma Aldrich	W237701
2-methylpropyl acetate	Sigma Aldrich	W217514
2-methylbutyl acetate	Sigma Aldrich	W364401
3-methyl butyl acetate	Sigma Aldrich	287725
2-phenylethyl acetate	Sigma Aldrich	290580
2-methylpropanol	Sigma Aldrich	294829
2-methylbutanol	Sigma Aldrich	133051
3-methylbutanol	Sigma Aldrich	309435
Hexanol	Sigma Aldrich	128570
2-phenylethanol	Sigma Aldrich	77861
Propanoic acid	Sigma Aldrich	94425
Butanoic acid	Sigma Aldrich	19215
2-methylpropanoic acid	Sigma Aldrich	58360
2-methylbutanoic acid	Sigma Aldrich	193070
3-methylbutanoic acid	Sigma Aldrich	W310212
Hexanoic acid	Sigma Aldrich	153745
Octanoic acid	Sigma Aldrich	W279900
Decanoic acid	Sigma Aldrich	W236403
Dodecanoic acid	Sigma Aldrich	L556
Fermentor 1L	Legallais	AT1357	Fermenter handmade for fermentation
Disposable vacuum filtration system	Dominique Deutscher	029311
Fermenters (250 ml)	Legallais	AT1352	Fermenter handmade for fermentation
Sterile tubes	Sarstedt	62.554.502
Fermentation locks	Legallais	AT1356	Fermetation locks handmade for fermentation
BactoYeast Extract	Becton, Dickinson and Company	212750
BactoPeptone	Becton, Dickinson and Company	211677
Incubator shaker	Infors HT
Particle Counter	Beckman Coulter	6605697	Multisizer 3 Coulter Counter
Centrifuge	Jouan		GR412
Plate Butler Robotic system	Lab Services BV	PF0X-MA	Automatic instrument
Plate Butler Software	Lab Services BV		Robot monitor software
RobView			In-house developed calculation software
My SQL			International source database
Cimarec i Telesystem Multipoint Stirrers	Thermo Fisher Scientific	50088009	String Drive 60
BenchBlotter platform rocker	Dutscher	60903
Ammonia enzymatic kit	R-Biopharm AG	5390
Spectrophotometer cuvettes	VWR	634-0678
Spectrophotometer UviLine 9400	Secomam
Amino acids standards physiological - acidics and neutrals	Sigma Aldrich	A6407
Amino acids standards physiological - basics	Sigma Aldrich	A6282
Citrate lithium buffers - Ultra ninhydrin reagent	Biochrom	BC80-6000-06
Sulfosalycilic acid	Sigma Aldrich	S2130
Norleucine	Sigma Aldrich	N1398
Biochrom 30 AAA	Biochrom
EZChrom Elite	Biochrom		Instrument control and Data analysis software
Ultropac 8 resin Lithium	Biochrom	BC80-6002-47	Lithium High Resolution Physiological Column
Filter Millex GV	Merck Millipore	SLGVX13NL	Millex GV 13mm (pore size 0.22 µm)
Membrane filter PALL	VWR	514-4157	Supor-450 47mm 0.45µm
Vacuum pump Millivac Mini	Millipore	XF5423050
Aluminium smooth weigh dish 70mm	VWR	611-1380
Precision balance	Mettler		Specifications AE163
Dimethyl sulfoxid dried	Merck	1029310161	(max. 0.025% H2O) SeccoSolv
Combustion oven	Legallais
Pierce BCA protein assay kit	Interchim	UP40840A
Formic acid	Fluka	94318
Hydrogen peroxide	Sigma Aldrich	H1009
Hydrochloric Acid Fuming 37% Emsure	Merck	1003171000	Grade ACS,ISO,Reag. Ph Eur
Lithium acetate buffer	Biochrom	80-2038-10
Commercial solution of hydrolyzed amino acids	Sigma Aldrich	AAS18
L-Methionine sulfone	Sigma Aldrich	M0876
L-Cysteic acid monohydrate	Sigma Aldrich	30170
Pyrex glass culture tubes	Sigma Aldrich	Z653586
Pyridine	Acros Organics	131780500	99% Extrapure
Ethyl chloroformate	Sigma Aldrich	23131
Dichloromethane	Sigma Aldrich	32222
Vials	Sigma Aldrich	854165
Microinserts for 1.5ml vials	Sigma Aldrich	SU860066
GC/MS	Agilent Technologies	5890 GC/5973 MS
Chemstation	Agilent Technologies		Instrument control and data analysis software
Methanol	Sigma Aldrich	34860	Chromasolv, for HPLC
Acetonitrile	Sigma Aldrich	34998	ChromasolvPlus, for HPLC
N,N-Dimethylformamide dimethyl acetal	Sigma Aldrich	394963
BSTFA	Sigma Aldrich	33024
DB-17MS column	Agilent Technologies	122-4731	30m*0.25mm*0.15µm
Sodium sulfate, anhydrous	Sigma Aldrich	238597
Technical nitrogen	Air products	14629
Zebron ZB-WAX column	Phenomenex	7HG-G007-11	30m*0.25mm*0.25µm
Helium BIP	Air products	26699
Glass Pasteur pipettes	VWR	612-1702