基于同位素示踪实验结合的工作流研究多营养源的微生物代谢

摘要

本议定书描述了一个实验过程, 定量和全面地研究多种营养来源的代谢。这一工作流程, 基于同位素示踪实验和分析程序的结合, 使被消耗的营养素的命运和由微生物综合的分子的新陈代谢的起源被确定。

摘要

微生物学领域的研究依赖于各种方法的实施。特别是, 适当的方法的发展大大有助于提供广泛的知识代谢的微生物生长在化学定义的媒体含有独特的氮和碳源。相比之下, 通过多种营养来源的新陈代谢的管理, 尽管它们在自然或工业环境中的广泛存在, 仍然几乎未被探索。这种情况主要是由于缺乏适当的方法, 妨碍了调查工作。

我们报告一个实验策略, 以定量和全面地探讨新陈代谢是如何运作的, 当一个营养素作为不同的分子,即, 一个复杂的资源的混合物提供。在这里, 我们描述了它的应用, 通过酵母代谢网络评估多氮源的划分。该工作流结合了稳定同位素示踪实验中所获得的信息, 使用选定的¹³C 或¹⁵N 标记基板。它首先包括平行和可再生的发酵在同一个媒介, 包括 N 包含分子的混合物;但是, 每次选定的氮源都被标记。结合分析程序 (HPLC, gc-ms), 以评估目标化合物的标记模式, 并量化的消耗和回收的基质在其他代谢物。完整的数据集的综合分析提供了在细胞内消耗的基质的命运的概述。这种方法需要一个精确的协议, 收集 samples–facilitated 的机器人辅助系统的在线监测 fermentations–and 实现了大量的耗时分析。尽管有这些限制, 它还是第一次允许对酵母代谢网络中的多个氮源进行划分。我们阐明了从更丰富的来源向其他 n-化合物的氮的再分配, 并确定了挥发性分子和 proteinogenic 氨基酸的代谢来源。

引言

了解微生物代谢如何运作是一个关键问题的设计有效的战略, 以改善发酵过程和调节生产的发酵化合物。在过去的二十年中, 基因组学和功能基因组学的进步, 在很大程度上促进了许多微生物代谢网络拓扑的知识的扩展。对此信息的访问导致了旨在全面概述蜂窝功能¹的方法的发展。这些方法通常依赖于基于模型的可测量参数的解释。这些实验数据一方面包括代谢物的吸收率和生产率, 另一方面, 从同位素示踪实验中获得的定量的细胞内信息。这些数据提供了在定义的新陈代谢网络中的不同通路的体内活动的扣除的基本信息^2,3,4。目前, 可用的分析技术只能够准确地检测分子在使用单元素同位素时的标记模式, 并可能在两个同位素元素的共同标记下。此外, 在大多数生长条件下, 碳源只由一个或两个化合物组成。因此, 基于碳基板上的¹³C 同位素示踪剂的方法得到了广泛和成功的应用, 以全面了解碳代谢网络的运行情况^{5,6,7 ,8}。

相比之下, 在许多自然和工业环境中, 支持微生物生长的可用氮资源通常由广泛的分子组成。例如, 在葡萄酒或啤酒发酵过程中, 氮气作为18种氨基酸和铵的混合物提供, 在可变浓度下为⁹。这一系列的 N 类化合物, 可用于代谢使这些复杂的媒体条件大大不同于那些通常用于生理学研究, 因为后者是通过使用独特的氮源, 典型的铵。

总的来说, 内化的氮化合物可以直接纳入蛋白质或 catabolized。许多微生物的氮代谢网络结构, 包括酵母的酿酒酵母, 是非常复杂的根据基板的多样性。示意性地, 这个系统是基于氮代谢中心核心的组合, 它催化谷氨酰胺、谷氨酸和α-二的转换^10,11, 具有转氨酶和 deaminases。通过这个网络, 胺基团从铵或其他氨基酸收集和α-酮酸释放。这些中间体也综合通过中央碳代谢 (CCM)^12,13。这种大量的分支反应和中间体, 参与了外源氮源的分解和 proteinogenic 氨基酸的代谢, 满足了细胞的合成代谢要求。通过这些不同的相互连接的路线的活动也导致代谢物的排泄。特别是α-酮酸可以通过艾氏通路重定向产生更高的醇及其乙酸酯衍生物¹⁴, 这是产品感官图谱的重要贡献。随后, 氮代谢如何运作在生物质生产和挥发性分子 (香气) 的形成中起着关键作用。

有关氮代谢的反应、酶和基因在文献中有广泛的描述。然而, 在整个代谢网络中分配多种氮源的问题尚未得到解决。解释这种缺乏信息有两个主要原因。首先, 鉴于氮代谢网络的重要复杂性, 需要大量的定量数据才能完全了解它的运作, 直到现在。其次, 许多实验性的约束和分析方法的局限性阻碍了以前用于解释 CCM 函数的方法的实现。

为了克服这些问题, 我们选择了一种系统级的方法, 它是基于对一系列同位素示踪实验数据的核对。该工作流包括:
-在相同环境条件下进行的一组发酵, 而不同的营养源 (基质) 每次都被标记。
-结合分析程序 (HPLC、gc-ms), 在发酵的不同阶段, 对被标记的基质的残留浓度和化合物的浓度和同位素富集进行精确测定。标记分子的分解代谢, 包括衍生生物质。
-计算每个被消耗标记的分子的质量和同位素平衡, 并对数据集进行进一步的综合分析, 以获得全球对微生物通过测定通量比值管理多种营养源的概览.

要应用这种方法, 必须注意培养菌株/微生物的可再生行为。此外, 在相同的发酵过程中, 必须采取不同文化的样品。在这篇手稿中所报道的实验工作中, 一个机器人辅助系统用于在线监测发酵, 以此来解释这些限制。

此外, 必须选择一套标签的基板 (化合物, 性质, 和位置的标签), 这是适当的, 以解决科学问题的研究。在这里, ¹⁵N 标记铵、谷氨酰胺和精氨酸被选为葡萄汁中发现的三主要氮源。这就允许评估从消耗化合物到 proteinogenic 氨基酸的氮再分配模式。我们还研究了被消耗的氨基酸的碳骨架的命运及其对挥发性分子生产的贡献。为了实现这一目标, 在研究中加入了一致的¹³C 标记亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸和缬氨酸, 这些氨基酸是从艾氏通路的主要中间体中获得的。

总的来说, 我们定量地探讨了酵母如何管理一个复杂的氮资源, 通过重新分配外源氮源, 以满足其合成代谢的要求, 在整个发酵, 而另外消除过剩的碳前体挥发性分子。本文所报道的实验方法可用于研究其他微生物所使用的多种营养源。这似乎是分析遗传背景或环境条件对微生物代谢行为的影响的适当方法。

研究方案

1. 发酵和取样

1. 培养基和发酵的制备
   注: 所有的发酵都是并行进行的, 使用相同的应变和相同的化学定义的合成介质 (SM, 在表 1中提供的成分), 其中包括铵和氨基酸的混合物作为氮源的¹⁵。对于每种发酵, 一个单一的氮化合物只提供一个统一标记的¹³C 或¹⁵N 形式 (100%), 而其余的则保持未标记。对于在实验组中使用的每个标记的氮源 (这里: ¹⁵NH₄, u-¹⁵N4-Arg, u-¹⁵N2-Gln, u-¹³C6-Leu, u-¹³C5-Val, u-13 C6-Ile, u-13 C4-Thr), 2发酵准备好了对于每个条件, 重复发酵只使用未标记的分子 (7 控制发酵) 进行。
   1. 对于要研究的每个 N 个源, 准备500毫升的 SM 介质, 其中包含表 1中列出的所有氮源, 但要用100% 标记形式的化合物除外。
      注: 在接下来的步骤中添加标记的分子。
   2. 消毒1升瓶 (10 分钟, 100 ° c) 中含有磁性搅拌棒的每种培养基。称适当数量的标记分子达到最终浓度, 在表 1中报告并将其溶解在介质中。
   3. 使用一次性真空过滤系统 (醋酸纤维素膜, 0.22 µm) 消毒介质。使用不育的测量缸, 在两个预先灭菌的发酵 (250 毫升) 之间划分介质, 其中含有磁性搅拌棒, 并配备发酵锁, 以避免进入氧气, 但允许 CO₂的释放。
   4. 将发酵烧瓶加热到28° c, 将它们放在孵化室中1晚 (温度设置在28° c)。
2. 发酵的接种与监测
   1. 在含有10毫升 YPD 培养基的无菌管中, 在28° c 的情况下, 以震动 (150 rpm) 为12小时, 培养出S. 酿酒酵母菌株。然后, 吸管1毫升的 YPD 培养, 并转移到10毫升的 SM 培养基 (在15毫升无菌管)。孵育文化为 12 h 在28° c 以震动 (150 转每分钟)。
   2. 在层流下, 收集一个培养分和量化的细胞数量使用一个电子粒子计数器, 装有一个100µm 口径。离心培养 (2000 x g, 15 min, 4 ° c), 并在适当的无菌水量中悬浮颗粒以获得 2.5 x 10⁸细胞/毫升的最终浓度。接种每发酵1毫升的细胞悬液。
      注意: 用于监视发酵过程的机器人系统在图 1中进行了描述。
   3. 通过在21位搅拌板上正确放置的支撑导轨上安装发酵, 将搅拌速度设置为 270 rpm, 从而准备发酵平台。启动对每种发酵的在线监测, 启动机器人控制应用, 然后点击 "开始化验" 按钮, 选择要进行的发酵量 (300 毫升)。
   4. 所显示的接口允许在平台上指示数字和发酵的位置。要确保发生这种情况, 请右键单击插槽位置, 然后选择 "启用" 以激活位于该位置的发酵的监视。
   5. 初始化计算软件, 在系统上永久运行, 然后开始进行权重获取。单击 "Initialiser" 按钮并验证 "确定"。点击 "启动按钮" 的机器人控制应用程序开始的重量收购。
3. 抽样程序
   注意: 对于每个发酵, 在本研究中, 当 CO₂生产 (在运行计算软件的计算机上显示的在线值) 达到所需的设置点: 5、10、40和 90 g/L 时, 就会取样。
   1. 具有标记化合物的培养物的取样程序。
      1. 离心机两个6毫升样品 (2000 x g, 5 分钟, 4 ° c)。保存和储存在-80 ° c 的两个等分冷冻清。用5毫升蒸馏水冲洗两次, 并在-80 ° c 下贮存, 用于测量同位素富。
   2. 无标记化合物培养的抽样方法
      1. 收获10毫升的文化, 将用于干体重测定。通过离心 (2000 x g, 5 分钟, 4 ° c) 将两个10毫升样品中的细胞颗粒。用10毫升蒸馏水冲洗两次, 并将其储存在-80 ° c, 用于测定蛋白质和氨基酸含量。

2. 消耗的氮源的量化

1. 酶法测定残余氨浓度
   注: 清中氨浓度的测定采用商业化酶试剂盒进行;所有的试剂都是由制造商提供的。
   1. 准备一个标准的氨溶液 (61.4 毫克/升), 溶解25毫克的精确称量 (NH₄)₂所以₄在一个100毫升体积烧瓶。
   2. 为了满足制造商的指示, 执行1:2 稀释的样品, 在发酵和5克/升的 CO₂释放。调整样品的 pH 值到大约8通过增加 1 M KOH。记下所增加的体积, 并在稀释系数中考虑到这一点。
   3. 在4毫升分光光度计试管, 混合100µL 样品 (必要时稀释), 蒸馏水或标准氨水溶液与2毫升试剂 1 (0.75 毫米 ADP 和 30 U/毫升谷氨酸脱氢酶在 pH 7.8 缓冲) 和500µL 试剂 2 (1.3 mm NADH)。在室温下孵育15分钟, 并读取 NADH 340 纳米 (A1) 的吸光度。
   4. 添加500µL 试剂 3 (60 毫米α-二在 pH 8 缓冲), 孵化样品为20分钟的室温, 并读取 NADH 吸光度在 340 nm (A2)。
   5. 使用以下方法计算氨浓度:
      C_氨(g/升) = 0.083 x [(0.839 x A1-A2)_样本-(0.839 x A1-A2)_蒸馏水]
   6. 检查是否使用标准溶液获得正确浓度。
2. 残留氨基酸浓度的色谱测定
   注: 在清中氨基酸浓度的测定是通过一种专用氨基酸分析系统实现的, 它是基于离子交换色谱和柱后衍生 n-化合物的茚, 从而使其比色检测。
   1. 准备一个参考解决方案, 添加200µL 的中性和酸性氨基酸的商业混合物, 200 µL 的商业混合物的基本氨基酸, 和200µL 2.5 毫米谷氨酰胺到400毫米的200µL 的柠檬酸锂缓冲, pH 2.2。这个化学定义的参考解决方案被视为一个样本。
   2. 添加200µL 25% (w/v) 水杨酸酸溶液, 其中含有2.5 毫米亮 (内部标准) 到800µL 样品, 以去除分子量高分子量。孵育1小时在4° c, 离心机 (3000 x g, 10 min, 4 ° c) 和过滤通过一个 0.22-µm 孔大小的硝化棉膜 (注射器系统)。
   3. 在程序员软件, 点击按钮 "运行" 开始的液相色谱 (LC) 分析与分析仪配备了阳离子交换柱 (锂形式)。洗的氨基酸与连续的锂缓冲, 创造了 pH 梯度和梯度的反离子浓度与温度梯度结合 (表 2)。
   4. 用分光光度检测器在 570 nm 茚衍生后的氮化合物 (紫色着色: 茚与胺类氨基酸的反应) 和 440 nm (黄色着色: 茚和胺组之间的反应脯氨酸)。
   5. 使用参考解决方案和亮作为内部标准进行单点内部校准, 以使用制造商的软件计算样品中氨基酸的浓度。

3. Proteinogenic 氨基酸的定量化

1. 干电池重量的测量
   1. 过滤10毫升的文化通过硝化纤维过滤器 (孔径0.45 µm), 在铝杯前称量, 使用真空装置。用50毫升蒸馏水冲洗两次。
   2. 将过滤器放在铝杯中, 在105° c 的温度下晾干48小时 (直到没有观察到进一步的重量变化), 然后再在杯中 reweighing 过滤器。计算重量差异。
   3. 计算至少3独立测量的平均值, 以准确地确定酵母培养物的干电池重量。
2. 细胞蛋白质含量的定量化
   注: 细胞的蛋白质含量的定量是至少在三个使用未标记的细胞小球, 获得如1.3.2 节所述。
   1. 将1毫升的亚甲基亚砜溶液 (50% 伏/v) 加入冷冻颗粒, 在干热烘箱中在105° c 下孵育1小时, 以提取蛋白质。
   2. 用生化比色法将亚甲基亚砜提取物中的蛋白质含量量化, 这是基于将 cu⁺⁺的蛋白质还原为二辛可宁酸在蓝色络合物中进一步沉淀的 cu⁺离子。
3. 蛋白质中氨基酸相对贡献的测定
   注: proteinogenic 氨基酸的剖面至少是由未标记的细胞小球 (1.3.2。
   1. 在200µL 甲酸酸 (90% 甲酸, 10% 过氧化氢) 中悬浮细胞颗粒, 制备氧化提取物。在4° c 孵育4小时, 并通过添加33.6 毫克硫酸钠停止反应。
      注: 氧化步骤需要将半胱氨酸和蛋氨酸转化为蛋氨酸砜和丙酸, 用离子交换色谱法进一步量化。然而, 某些氨基酸 (酪氨酸, 苯丙氨酸, 组氨酸, 和精氨酸) 在氧化处理过程中变性。因此, 两个水解物 (有和没有氧化) 准备。
   2. 添加800µL 6N HCl 到细胞颗粒或氧化提取物, 并在一个密封的玻璃管中孵育16小时在一个干燥的热烘箱110° c 的样品。添加200µL 的2.5 毫米亮和删除 HCl 与一流氮。用800µL 蒸馏水, 然后用800µL 乙醇洗净 (溶液干萃取液, 然后除去氮气流) 两次。在800µL 的200毫米醋酸锂缓冲, pH 2.2。
      注意: 在酸性条件下某些氨基酸不稳定时, 应注意水解的潜伏期。蛋白质中的色氨酸分数是从文献中的¹⁶中发现的, 因为这种氨基酸在 HCl 水解过程中是完全变性的。
   3. 为单点内部校准准备一个水解物标准。添加160µL 水解氨基酸到840µL 200 毫米醋酸锂缓冲液, pH 2.2, 其中含有625µM 蛋氨酸砜, 625 µM 丙酸, 625 µM 亮。
   4. 使用2.2 节描述的色谱法测定蛋白质中氨基酸的相对浓度。
4. 计算
   1. 通过将每种氨基酸 (毫克/升) 的测定量除以蛋白质提取物 (毫克/升) 中测定的氨基酸总量来计算蛋白质中每个氨基酸的重量百分比。
   2. 乘以这个百分比的蛋白质浓度的文化 (镁/升),即, 产品之间的蛋白质含量的生物量和干重, 以评估的浓度每 proteinogenic 氨基酸的文化 (毫克/升)。

4. Proteinogenic 氨基酸的同位素富集测定

注: 用于测定 proteinogenic 氨基酸的同位素富集, 使用标记的细胞颗粒。三种不同的试剂用于衍生化步骤来量化氨基酸的同位素富集。通过测量聚类离子的强度来估计氨基酸的标记模式。信号从每个群离子对应于大量 isotopomers (m₀ = 没有标号, m₊₁ = 1 标记了原子,...) 氨基酸片段。在图 2中提供了 DMADMF 过程后获得的色谱的示例。

1. 生物质水解
   1. 水解的细胞颗粒 (相当于1-2 毫克的干生物量) 添加1.2 毫升 6 M HCl 和孵化样品为 16 h 在105° c 的紧密封闭玻璃管在干燥的热烘箱。
   2. 加入1.2 毫升蒸馏水和离心机在 3000 x g为5分钟, 以消除细胞碎片。在开放的玻璃管中, 将上清液分布到六400µL 馏分中。在105° c 的烘箱中烘干馏分, 直至达到糖浆的稠度 (4-5 h)。
2. Ethylchloroformate 衍生化
   1. 将干水解物溶解在200µL 20 毫米盐酸盐中;然后, 加入133µL 吡啶: 乙醇 (1:4)。添加50µL 的 derivatize 氨基酸, 并等待, 直到所有 CO₂已被释放。将混合物转移到含有500µL 的二氯甲烷的离心管中, 以提取衍生化合物。
   2. 漩涡管为十年代和离心他们为4分钟在 1万 x g;收集较低的有机相与巴斯德吸管和转移到 gc 瓶, 其中包含锥形玻璃插入, 使样品可以直接注入到 gc/MS 仪器。
3. (n, n)-胺二甲缩醛 (DMFDMA) 衍生。
   1. 将干水解物溶解在50µL 甲醇和200µL 乙腈中。添加300µL 的 DMFDMA。涡流管和转移样品到 GC 样瓶, 其中包含锥形玻璃刀片。
4. n,n-双 (三甲基硅基) 乙酰 (BSTFA) 衍生
   1. 将水解物悬浮在200µL 的乙腈中。添加200µL BSTFA, 密封关闭玻璃管和孵化4小时在135° c 之前, 将提取物直接转移到 GC 瓶。
5. gc-ms 分析
   1. 用装有样注射器的气相色谱仪分析样品, 并将其与质谱仪耦合。
      1. 使用仪器专用软件对仪器进行控制, 分析谱。在 "序列" 菜单中, 单击 "示例日志表" 以创建示例列表, 然后单击 "运行" 按钮开始注射。
         注: 气相色谱仪装有30米 x 0.25 毫米 apolar 二氧化硅毛细管柱, 其膜厚为0.15 微米。将质谱仪的四极温度设置在150° c, 并在250° c 下举行传输线的所有分析。三分析程序, 每一个特定的衍生化剂, 使用。
      2. 环保基金衍生物:使用氦作为流动阶段, 流量为1.2 毫升/分钟. 设置在230° c 和源的温度在250° c 的入口。程序的样注入1µL 的样品与分裂率为3:1。运行分析, 逐步提高烘箱温度如下: 130 ° c 为3分钟;梯度15° c/分至260° c;保持温度在260° c 20 分钟。
      3. DMFDMA 衍生物:使用氦作为流动阶段的恒定流量为1.2 毫升/分钟. 设置入口的温度在230° c 和那的来源在250° c。程序的样注入1µL 的样品与分裂率为3:1。运行分析, 逐步提高烘箱温度如下:60 ° c 为1分钟;梯度20° c/分至130° c;第二梯度4° c/分钟到260° c;保持温度在260° c 10 分钟。
      4. BSTFA 衍生物:使用氦作为流动阶段的恒定流量为1.2 毫升/分钟. 设置入口的温度在275° c 和那的来源在300° c。运行分析 (注: 1 µL), 逐步提高烘箱温度如下: 110 ° c 1 分钟;第一梯度2° c/分钟到154° c;第二梯度5° c/分钟到300° c;保持温度在300° c 10 分钟。
      5. 检测过程:对于每种衍生模式, 注入一个样本 (1 µL) 的扫描模式与正电子撞击电离在 70 eV, 并注意到每个氨基酸的保留时间。
      6. 使用这些值来定义整个色谱中的时间窗和不同的选定离子, 它们是每个氨基酸的特征, 并在表 3中列出;这些值应包括在每个氨基酸。将此信息包括在 sim 检测程序中, 并在 70 eV 上以正电子撞击电离的 sim 模式运行分析。
   2. 收集分析结果;即, 对于每一种氨基酸, 记录一簇与其不同质量 isotopomers 相对应的强度。使用 dedicatedsoftware¹⁷处理数据, 以更正自然标记和计算 proteinogenic 氨基酸的同位素富集 (定义为氨基酸的标记分数相对于蛋白质的总量样本)。
      注: 以百分率表示的分子 (即) 的同位素富集被计算除以 isotopomers 的修正强度与标记 (m₁, m₂,..._n) 的总和所有质量 isotopomers 的强度 (m₀, m₁, m₂,... m_n):
      即 = (m₁ + m₂ +... + m_n)/(m₀ + m₁+ m₂ +... + m_n)

5. 挥发性化合物的定量和同位素富集

1. 标记挥发性化合物的提取
   1. 在15毫升玻璃管中加入10µL 氘内部标准至5毫升上清 (最终浓度为氘化合物: 100 µg/升)。加入1毫升的二氯甲烷, 紧紧地关闭管和动摇他们在一个摇摆平台上20分钟离心5分钟, 在 3000 x g 和收集有机下相在一个15毫升玻璃管。重复二氯甲烷萃取。
   2. 将有机萃取物干燥500毫克的无水硫酸钠, 用巴斯德吸管收集液相。在氮气通量下将萃取物浓缩为四, 并将其转移到 GC 样瓶中。
2. 挥发性化合物的气相色谱-MS 定量
   1. 将气相色谱仪与30米 x 0.25 mm 的熔融二氧化硅毛细管柱配有0.25 μ m 薄膜厚度, 并应用恒定的氦流1.0 毫升/分钟. 在250° c 处按住注射器和传输线。
   2. 注入2µL 的样品, 分裂率为 10:1, 分离提取的挥发性分子使用以下烘箱温度剖面: 保持温度为3分钟在40° c, 增加它由4° c/分钟由220° c 然后举行烤箱在220° c 为 20 min。
   3. 用质谱仪检测化合物, 其源温度设置在230° c, 其质谱仪的四极温度设置在150° c。记录在选择的离子监测 (SIM) 模式的质量谱与正电子撞击电离在 70 eV 和使用的离子簇特定的挥发性化合物, 报告在表 4。
   4. 使用外部7点校准, 从相应离子簇的强度的总和中量化挥发性分子的浓度。在100% 乙醇中制备每种化合物 (10 克/升) 的库存溶液。然后, 通过混合库存溶液, 为每类挥发性分子 (乙酯、醋酸、醇和酸) 制备标准溶液。最后, 在 12% hydroalcoholic 溶液中稀释不同数量的标准溶液, 其中含有5克/L 酒石酸, pH 值调整到3.3 以制备校准溶液。
   5. 同时, 对每个离子簇强度的自然标记进行校正, 并计算挥发性化合物的同位素富集, 这被定义为分子的标记分数, 并用专用软件表示为百分比。¹⁷。

6. 对数据集进行综合分析的计算

1. 原始数据的集合
   1. 使用表5、6、7、和8中显示的电子表格, 输入与胞外氨基酸浓度、细胞干重、细胞蛋白质含量、挥发性分子浓度和同位素相对应的原始数据值。proteinogenic 氨基酸和挥发性分子的富集。
      注意: 表中显示的数据用 mM 表示。所有的结果也表示在毫克/升通过乘以每个分子的分子量, 或在毫克 N/l 通过乘以 proteinogenic 氨基酸的 millimolar 浓度的氮原子质量 (14 u) 和由氮的数量。这是由这个分子的分解代谢所提供的。
   2. 计算蛋白质中每种氨基酸的质量百分比, 将其在水解物中的含量除以氨基酸的总量 (它们在镁/升中的总和)。
   3. 从独立实验所得的数据计算平均值、标准偏差和标准误差。
   4. 计算每种氨基酸的 proteinogenic 浓度 (毫克/升), 将这种氨基酸在蛋白质 (mg aa/g 蛋白) 中的百分比乘以生物量中的蛋白质 (g 蛋白/g DW) 和干重含量 (生物质生产)中型 (g DW/L)。
2. ¹⁵N 同位素示踪实验
   1. 使用表 9中提供的电子表格, 计算 proteinogenic 氨基酸 (以毫克/升表示) 中存在的标记和未标记的氮分数 (以毫克/升) 和它们的总浓度同位素富。对于每个氨基酸, 标记分数对应于产品的总浓度和它的同位素富集, 而未标记的部分是总量和标记量的差额。
   2. 然后, 通过总结 Ala 的总用量, 确定该研究中所含 proteinogenic 氨基酸中含有的蛋白质中总氮的分数, 甘, Val, Asp, 美国, a, 伊, 赖氨酸, 他, 谷氨酸和 Arg (在毫克/升) 和除以总蛋白质中含有的氮的载入。
   3. 计算在本研究中 proteinogenic 酸中的精氨酸、谷氨酰胺或铵所提供的氮, 通过对在研究中量化的 proteinogenic 氨基酸的标记分数 (毫克/升) 求和 (Ala, 甘, Val, Asp,在实验中, 在¹⁵N 标记的精氨酸、谷氨酰胺或铵的存在下, 将这个标记氮的分数除以定量的 proteinogenic 氨基中的氮总量氨基酸.
   4. 通过将¹³C 和¹⁵N 同位素示踪实验 (电子表格表 7) 中的数据组合起来, 评估3种最丰富的氨基酸对用于de 从头生物合成的细胞内氮池的贡献。
   5. 从总金额 (以 mM 表示) 的 proteinogenic Val, 列伊, 或, 或, 扣除从直接并入消耗化合物 (¹³C 实验) 和部分是de 从头综合使用氮从3主要来源, 以评估的分数, 是de 从头综合使用氮从其他氨基酸。
   6. 然后, 用酰、Arg 和 NH ₄⁺ (mm 表示的总和) 对 proteinogenic 氨基酸的总用量 (mm) 来计算氨基酸的综合量的比值, 以量化精氨酸、谷氨酰胺和铵到胞内氮池。
3. ¹³C 同位素示踪实验
   1. 计算 proteinogenic 氨基酸的标记和未标记的分数, 从毫米和 proteinogenic 氨基酸的同位素富中得到的浓度表示, 在存在¹³C 标记的列伊, Val,(请参见 6.2.1,表 10)。
   2. 计算在实验过程中, 在存在¹³C 标记的列伊、Val、微笑或 () 中所获得的挥发性化合物的浓度和同位素富中所标明的和未标记的组分.表 10)。

结果

图 3提供了工作流的示意图, 该流程图是为了调查在葡萄酒发酵过程中发现的多种氮源的酵母的管理情况而实施的。
对于不同的取样点, 生物 parameters–growth 特性、氮耗形态和 proteinogenic 氨基 acids–show 的剖面在发酵中具有很高的重现性 (图 4)。这种一致性根据在一组14独立发酵中生成的数据的组合来验证方法的相关性。

讨论

利用同位素示踪实验, 通过代谢网络定量化化合物, 是了解微生物代谢操作的一种很有前途的方法。这种方法, 虽然成功地应用于一个或两个标记的基板, 目前不能实施研究的代谢各种来源使用多重标记元素同位素 (即, 超过两个基板)。事实上, 可用的分析技术能够准确地确定 proteinogenic 氨基酸和分子的标记模式, 仅当使用单一元素的同位素时, 并且可能时用两个元素进行联合标记。因此, 为了?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
D-Glucose	PanReac	141341.0416
D-Fructose	PanReac	142728.0416
DL-Malic acid	Sigma Aldrich	M0875
Citric acid monohydrate	Sigma Aldrich	C7129
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P5379
Potassium sulfate	Sigma Aldrich	P0772
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	230391
Calcium chloride dihydrate	Sigma Aldrich	C7902
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S9625
Ammonium chloride	Sigma Aldrich	A4514
Sodium hydroxide	Sigma Aldrich	71690
Manganese sulfate monohydrate	Sigma Aldrich	M7634
Zinc sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	Z4750
Copper (II) sulfate pentahydrate	Sigma Aldrich	C7631
Potassium iodine	Sigma Aldrich	P4286
Cobalt (II) chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	C3169
Boric acid	Sigma Aldrich	B7660
Ammonium heptamolybdate	Sigma Aldrich	A7302
Myo-inositol	Sigma Aldrich	I5125
D-Pantothenic acid hemicalcium salt	Sigma Aldrich	21210
Thiamine, hydrochloride	Sigma Aldrich	T4625
Nicotinic acid	Sigma Aldrich	N4126
Pyridoxine	Sigma Aldrich	P5669
Biotine	Sigma Aldrich	B4501
Ergostérol	Sigma Aldrich	E6510
Tween 80	Sigma Aldrich	P1754
Ethanol absolute	VWR Chemicals	101074F
Iron (III) chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	236489
L-Aspartic acid	Sigma Aldrich	A9256
L-Glutamic acid	Sigma Aldrich	G1251
L-Alanine	Sigma Aldrich	A7627
L-Arginine	Sigma Aldrich	A5006
L-Cysteine	Sigma Aldrich	C7352
L-Glutamine	Sigma Aldrich	G3126
Glycine	Sigma Aldrich	G7126
L-Histidine	Sigma Aldrich	H8000
L-Isoleucine	Sigma Aldrich	I2752
L-Leucine	Sigma Aldrich	L8000
L-Lysine	Sigma Aldrich	L5501
L-Methionine	Sigma Aldrich	M9625
L-Phenylalanine	Sigma Aldrich	P2126
L-Proline	Sigma Aldrich	P0380
L-Serine	Sigma Aldrich	S4500
L-Threonine	Sigma Aldrich	T8625
L-Tryptophane	Sigma Aldrich	T0254
L-Tyrosine	Sigma Aldrich	T3754
L-Valine	Sigma Aldrich	V0500
13C5-L-Valine	Eurisotop	CLM-2249-H-0.25
13C6-L-Leucine	Eurisotop	CLM-2262-H-0.25
15N-Ammonium chloride	Eurisotop	NLM-467-1
ALPHA-15N-L-Glutamine	Eurisotop	NLM-1016-1
U-15N4-L-Arginine	Eurisotop	NLM-396-PK
Ethyl acetate	Sigma Aldrich	270989
Ethyl propanoate	Sigma Aldrich	112305
Ethyl 2-methylpropanoate	Sigma Aldrich	246085
Ethyl butanoate	Sigma Aldrich	E15701
Ethyl 2-methylbutanoate	Sigma Aldrich	306886
Ethyl 3-methylbutanoate	Sigma Aldrich	8.08541.0250
Ethyl hexanoate	Sigma Aldrich	148962
Ethyl octanoate	Sigma Aldrich	W244910
Ethyl decanoate	Sigma Aldrich	W243205
Ethyl dodecanoate	Sigma Aldrich	W244112
Ethyl lactate	Sigma Aldrich	W244015
Diethyl succinate	Sigma Aldrich	W237701
2-methylpropyl acetate	Sigma Aldrich	W217514
2-methylbutyl acetate	Sigma Aldrich	W364401
3-methyl butyl acetate	Sigma Aldrich	287725
2-phenylethyl acetate	Sigma Aldrich	290580
2-methylpropanol	Sigma Aldrich	294829
2-methylbutanol	Sigma Aldrich	133051
3-methylbutanol	Sigma Aldrich	309435
Hexanol	Sigma Aldrich	128570
2-phenylethanol	Sigma Aldrich	77861
Propanoic acid	Sigma Aldrich	94425
Butanoic acid	Sigma Aldrich	19215
2-methylpropanoic acid	Sigma Aldrich	58360
2-methylbutanoic acid	Sigma Aldrich	193070
3-methylbutanoic acid	Sigma Aldrich	W310212
Hexanoic acid	Sigma Aldrich	153745
Octanoic acid	Sigma Aldrich	W279900
Decanoic acid	Sigma Aldrich	W236403
Dodecanoic acid	Sigma Aldrich	L556
Fermentor 1L	Legallais	AT1357	Fermenter handmade for fermentation
Disposable vacuum filtration system	Dominique Deutscher	029311
Fermenters (250 ml)	Legallais	AT1352	Fermenter handmade for fermentation
Sterile tubes	Sarstedt	62.554.502
Fermentation locks	Legallais	AT1356	Fermetation locks handmade for fermentation
BactoYeast Extract	Becton, Dickinson and Company	212750
BactoPeptone	Becton, Dickinson and Company	211677
Incubator shaker	Infors HT
Particle Counter	Beckman Coulter	6605697	Multisizer 3 Coulter Counter
Centrifuge	Jouan		GR412
Plate Butler Robotic system	Lab Services BV	PF0X-MA	Automatic instrument
Plate Butler Software	Lab Services BV		Robot monitor software
RobView			In-house developed calculation software
My SQL			International source database
Cimarec i Telesystem Multipoint Stirrers	Thermo Fisher Scientific	50088009	String Drive 60
BenchBlotter platform rocker	Dutscher	60903
Ammonia enzymatic kit	R-Biopharm AG	5390
Spectrophotometer cuvettes	VWR	634-0678
Spectrophotometer UviLine 9400	Secomam
Amino acids standards physiological - acidics and neutrals	Sigma Aldrich	A6407
Amino acids standards physiological - basics	Sigma Aldrich	A6282
Citrate lithium buffers - Ultra ninhydrin reagent	Biochrom	BC80-6000-06
Sulfosalycilic acid	Sigma Aldrich	S2130
Norleucine	Sigma Aldrich	N1398
Biochrom 30 AAA	Biochrom
EZChrom Elite	Biochrom		Instrument control and Data analysis software
Ultropac 8 resin Lithium	Biochrom	BC80-6002-47	Lithium High Resolution Physiological Column
Filter Millex GV	Merck Millipore	SLGVX13NL	Millex GV 13mm (pore size 0.22 µm)
Membrane filter PALL	VWR	514-4157	Supor-450 47mm 0.45µm
Vacuum pump Millivac Mini	Millipore	XF5423050
Aluminium smooth weigh dish 70mm	VWR	611-1380
Precision balance	Mettler		Specifications AE163
Dimethyl sulfoxid dried	Merck	1029310161	(max. 0.025% H2O) SeccoSolv
Combustion oven	Legallais
Pierce BCA protein assay kit	Interchim	UP40840A
Formic acid	Fluka	94318
Hydrogen peroxide	Sigma Aldrich	H1009
Hydrochloric Acid Fuming 37% Emsure	Merck	1003171000	Grade ACS,ISO,Reag. Ph Eur
Lithium acetate buffer	Biochrom	80-2038-10
Commercial solution of hydrolyzed amino acids	Sigma Aldrich	AAS18
L-Methionine sulfone	Sigma Aldrich	M0876
L-Cysteic acid monohydrate	Sigma Aldrich	30170
Pyrex glass culture tubes	Sigma Aldrich	Z653586
Pyridine	Acros Organics	131780500	99% Extrapure
Ethyl chloroformate	Sigma Aldrich	23131
Dichloromethane	Sigma Aldrich	32222
Vials	Sigma Aldrich	854165
Microinserts for 1.5ml vials	Sigma Aldrich	SU860066
GC/MS	Agilent Technologies	5890 GC/5973 MS
Chemstation	Agilent Technologies		Instrument control and data analysis software
Methanol	Sigma Aldrich	34860	Chromasolv, for HPLC
Acetonitrile	Sigma Aldrich	34998	ChromasolvPlus, for HPLC
N,N-Dimethylformamide dimethyl acetal	Sigma Aldrich	394963
BSTFA	Sigma Aldrich	33024
DB-17MS column	Agilent Technologies	122-4731	30m*0.25mm*0.15µm
Sodium sulfate, anhydrous	Sigma Aldrich	238597
Technical nitrogen	Air products	14629
Zebron ZB-WAX column	Phenomenex	7HG-G007-11	30m*0.25mm*0.25µm
Helium BIP	Air products	26699
Glass Pasteur pipettes	VWR	612-1702