זרימת עבודה המבוסס על השילוב של מעקב איזוטרופי ניסויים כדי לחקור את חילוף החומרים מיקרוביאלית של מקורות מזון רבים

Summary

פרוטוקול זה מתאר תהליך ניסוי לחקור באופן כמותי ומקיף על חילוף החומרים של מקורות מזון רבים. זרימת עבודה זו, המבוססת על שילוב של ניסויים מעקב איזוטרופי שגרת אנליטית, מאפשר את גורלו של חומרים מזינים נצרך המקור מטבולית של מולקולות synthetized על-ידי מיקרואורגניזמים נקבע.

Abstract

מחקרים בתחום המיקרוביולוגיה להסתמך על ביצוע מגוון רחב של מתודולוגיות. בפרט, פיתוח שיטות המתאימות תורמת באופן משמעותי במתן ידע נרחב על חילוף החומרים של המיקרואורגניזמים הגדלים בתקשורת כימית מוגדרים המכילים חנקן ייחודי ומקורות פחמן. לעומת זאת, הניהול באמצעות חילוף החומרים ממספר מקורות מזון, למרות נוכחותם רחבה בסביבה טבעית או תעשייתית, נשאר כמעט שאינו גלוי. המצב הזה הוא בעיקר בגלל חוסר של מתודולוגיות מתאימים, שפוגעת חקירות.

אנחנו מדווחים על אסטרטגיית ניסיוני לחקור באופן כמותי ומקיף איך חילוף החומרים פועל כאשר התזונתי מסופק הוא תערובת של מולקולות שונות, קרי, משאב מורכבים. כאן, אנו מתארים את היישום שלה לשם הערכת חלוקת ממספר מקורות חנקן דרך הרשת מטבולית שמרים. זרימת העבודה משלב מידע שהתקבל במהלך איזוטופ יציב מעקב ניסויים באמצעות שנבחרו ¹³C - או ¹⁵התווית על-ידי N סובסטרטים. תחילה מורכבת fermentations מקבילים, לשחזור במדיום אותו, הכולל תערובת של מולקולות המכילות N; עם זאת, מקור חנקן שנבחר מסומן בכל פעם. שילוב של תהליכים אנליטיים (HPLC, GC-MS) מיושמת כדי להעריך את הדפוסים תיוג של תרכובות יישוב וכדי לכמת את צריכת ושחזור של מצעים בשנת מטבוליטים אחרים. ניתוח משולב של ערכת הנתונים השלם מספק מבט על גורלם של סובסטרטים נצרך בתוך התאים. גישה זו דורשת פרוטוקול מדויק עבור האוסף של דוגמאות – הקל על-ידי מערכת בסיוע רובוט לניטור המקוון של fermentations – ואת ההישג של אינספור ניתוחים גוזלת זמן. למרות אילוצים אלה, זה מותר הבנה, בפעם הראשונה, חלוקת מקורות חנקן רבים ברחבי הרשת מטבולית שמרים. מבואר הפצה מחדש של חנקן ממקורות שופע יותר לכיוון N-תרכובות אחרות ואנו נחוש את המקורות מטבולית של מולקולות נדיפות וחומצות אמינו proteinogenic.

Introduction

ההבנה כיצד פועלת מטבוליזם מיקרוביאלי היא סוגיה מרכזית על עיצוב האתר של אסטרטגיות יעילות כדי לשפר תהליכי תסיסה, לווסת את הייצור של תרכובות fermentative. ההתקדמות גנומיקה, גנומיקה תפקודית בשני עשורים האחרונים אלו תרמו במידה רבה הרחבת הידע של הטופולוגיה של רשתות מטבוליות של מיקרואורגניזמים רבים. הגישה למידע זה הוביל לפיתוח גישות המטרה עבור סקירה מקיפה של תפקוד התאים¹. מתודולוגיות אלה לעיתים קרובות לסמוך על פרשנות המבוססת על מודל של פרמטרים מדידים. נתונים ניסיוני אלה כוללים, מצד אחד, ספיגת מטבוליט וקצבי ייצור ו, מצד שני, ניסויים כמותיים תאיים המתקבל איזוטופ מעקב. נתונים אלה מספקים מידע חיוני עבור ניכוי של הפעילות ויוו של מסלולים שונים הרשת המוגדרות מטבוליים^2,3,4. כיום, טכניקות אנליטיות זמין רק לאפשר את איתור מדויק של תיוג דפוסים של מולקולות בעת שימוש איזוטופ רכיב אחד ואולי גם כאשר תיוג במשותף עם שני אלמנטים איזוטרופי. יתר על כן, תחת רוב תנאי הגידול, מקור פחמן מורכבת רק אחד או שניים-תרכובות. כתוצאה מכך, גישות המבוסס על ¹³C-איזוטרופי קליעים נותבים של פחמן סובסטרטים נרחב ובהצלחה הוחלו לפתח הבנה מלאה של פחמן רשת מטבולית פעולות^{5,6,7 ,8}.

לעומת זאת, רבים בסביבות טבעיים ותעשייתיים, המשאב חנקן זמין התומך צמיחת חיידקים מורכב לעיתים קרובות של מגוון רחב של מולקולות. לדוגמה, במהלך התסיסה יין או בירה, חנקן מסופק הוא תערובת של 18 חומצות אמינו, אמוניום ריכוזים משתנים⁹. זה מגוון של תרכובות N הנגישים עבור אנאבוליזם הופך תנאים אלה מדיה מורכבת מאוד שונים מאלה הנפוץ עבור מחקרים פיזיולוגיים, כמו האחרון מושגות באמצעות מקור ייחודי של חנקן, בדרך כלל אמוניום.

בסך הכל, הפנימו עשוי להיות שולבו חלבונים או catabolized ישירות תרכובות חנקן. מבנה הרשת של חילוף החומרים חנקן מיקרואורגניזמים רבים, כולל את השמרים האפייה, מורכב מאוד בהתאם המגוון של סובסטרטים. סכמטי, מערכת זו מבוססת על השילוב של הליבה המרכזית של חילוף החומרים של חנקן אשר מזרז את interconversion של גלוטמין, גלוטמט וα-ketoglutarate^10,11, עם הטרנסאמינאז ורמת deaminases. דרך רשת זו, אמין קבוצות אמוניום או חומצות אמיניות אחרות נאספים ושוחררה חומצות α-קטו. Intermediates אלה הם גם synthetized עד^12,פחמן מרכזי חילוף החומרים (CCM)¹³. זה מספר רב של תגובות מסועף, intermediates, מעורב קטבוליזם של מקורות חנקן אקסוגני והן את אנאבוליזם proteinogenic חומצות אמינו, ממלא את הדרישות anabolic של התאים. הפעילות דרך המסלולים מחוברים שונים תוצאות גם הפרשה של מטבוליטים. בפרט, חומצות α-קטו ייתכן שתנותב דרך ארליך בשביל לייצר כהלים גבוה יותר, שלהם אצטט אסתר נגזרים¹⁴, אשר חיוני כתורמים הפרופילים חושית של מוצרים. לאחר מכן, איך פועל חנקן מטבוליזם תפקיד המפתח לייצור ביומסה, היווצרות של מולקולות נדיפות (ארומה).

תגובות, אנזימים, גנים המעורבים בחילוף החומרים חנקן מתוארים בהרחבה בספרות. עם זאת, סוגיית חלוקת מקורות חנקן רבים ברחבי רשת מטבולית לא כבר טופלה. ישנן שתי סיבות עיקריות להסביר חוסר מידע. ראשית, על רקע המורכבות חשוב של הרשת חילוף החומרים חנקן, כמות גדולה של נתונים כמותיים נדרשת עבור הבנה מלאה של הפעולה שלו, זה לא היה זמין עד עכשיו. שנית, רבים ניסיוני אילוצים ומגבלות של שיטות אנליטיות מנעו את יישום גישות ששימשו בעבר הבהרה של הפונקציה CCM.

כדי להתגבר על בעיות אלה, בחרנו לפתח גישה ברמת המערכת המבוסס על הפיוס של נתונים מתוך סדרה של ניסויים איזוטרופי מעקב. זרימת העבודה כוללת:
-קבוצת fermentations מתבצעת תחת באותם תנאים סביבתיים, בעוד מקור מזין שנבחר שונה (סובסטרט) נקראת בכל פעם.
-שילוב של תהליכים אנליטיים (HPLC, GC-MS) לקביעת מדויק, בשלבים שונים של התסיסה, של ריכוז המצע שכותרתו וריכוז שיורית והעשרה איזוטרופי של תרכובות הנגזרים קטבוליזם של מולקולת שכותרתו, כולל ביומסה נגזר.
-חישוב של האיזון מסה ו איזוטרופי לכל נצרך מולקולה שכותרתו, ניתוח משולב נוסף של ערכת הנתונים כדי לקבל סקירה הכללית של ההנהלה של מקורות מזון רבים על-ידי מיקרואורגניזמים באמצעות הקביעה של יחסי גודל השטף .

כדי להחיל מתודולוגיה זו, ישולם תשומת לב להתנהגות לשחזור של הזן/בקטריה בין תרבויות. יתר על כן, יש לקחת דגימות מתרבויות שונות במהלך התקדמות התסיסה מוגדרים היטב אותו. עבודה ניסיונית דיווח בכתב היד, מערכת בסיוע רובוט משמש לניטור המקוון של fermentations להביא בחשבון אילוצים אלה.

יתר על כן, זה חיוני לבחור סט מצעים עם תוויות (מתחם טבע, המיקום של תיוג) המתאים לדון בבעיית המדעי של המחקר. . הנה, ¹⁵התווית על-ידי N אמוניום, גלוטמין וארגינין נבחרו שלושה מקורות חנקן העיקריים שנמצאו מיץ ענבים. פעולה זו מותרת הערכת הדפוס של חנקן הפצה מחדש של תרכובות נצרך כדי חומצות האמינו את proteinogenic. אנחנו נועד גם כדי לחקור את גורלו של עמוד השדרה פחמן של חומצות האמינו נצרך את ותרומתם הייצור של מולקולות נדיפות. לפגוש את המטרה, בצורה אחידה ¹³התווית על-ידי C לאוצין, איזולאוצין, תראונין, ולין נכללו במחקר כמו חומצות אמינו הנגזרים intermediates העיקריים של הנתיב ארליך.

בסך הכל, באופן כמותי חרשנו שבו שמרים מנהל משאב חנקן מורכבים, בעזרת חנקן אקסוגני מקורות כדי למלא את הדרישות anabolic שלה במהלך התסיסה בעת הסרת בנוסף עודף של פחמן מבשרי כמו מולקולות נדיפות. ניתן להחיל את הליך ניסיוני דיווח בעיתון הזה לחקור מקורות תזונתיים מרובים אחרים בשימוש על ידי כל מיקרואורגניזם אחר. זה נראה גישה המתאים לניתוח של ההשפעה של הרקע הגנטי או תנאי הסביבה על התנהגות מטבולית של מיקרואורגניזמים.

Protocol

1. תסיסה ודגימה

1. הכנת fermenters ומדיה
   הערה: כל fermentations מתבצעות בחוץ במקביל, תוך שימוש המתח אותו, באותו כימית מוגדר בינוני סינתטי (SM, קומפוזיציה הניתנים טבלה 1), אשר כוללת תערובת של אמוניה וחומצות אמינו כמו חנקן ממקורות¹⁵. עבור כל התסיסה, תרכובת חנקן אחד מסופק באופן בלעדי בצורה אחידה שכותרתו ¹³C או טופס ¹⁵N (100%), בעוד האחרים נותרים ללא תווית. עבור כל מקור חנקן שכותרתו בו נעשה שימוש בערכת ניסויים (כאן: ¹⁵NH₄, U -¹⁵N4-Arg, U -¹⁵N2-אך זה לא נגמר, U -¹³C6-Leu, U -¹³C5-ואל, U -¹³C6-איל, U -¹³C4-חמישי), שתיים fermenters מוכנות. עבור כל תנאי, כפולים התסיסה מתבצעת באמצעות רק מולקולות ללא תווית (פקד 7 fermentations).
   1. עבור כל N-מקור להילמד, הכנת 500 מ"ל של SM בינוני המכיל את כל מקורות חנקן המפורטים בטבלה 1, למעט המתחם כדי לשמש 100% תוויות הטופס.
      הערה: המולקולה שכותרתו נוסף בשלבים הבאים.
   2. Pasteurize כל מדיום בבקבוקון 1 ליטר (10 דקות, 100 ° C) המכילה בר מלהיב מגנטי. שוקל את הכמות המתאימה של מולקולה שכותרתו להגיע הריכוז הסופי המדווחת ב טבלה 1 , לפזר זאת בתוך המדיום.
   3. לעקר את המדיום באמצעות מערכת סינון חד פעמיים ואקום (ממברנה אצטט תאית, 0.22 מיקרומטר). באמצעות צילינדר מדידה סטרילי, לחלק האמצעי בין fermenters מראש מעוקרות שני (250 מ"ל) מכילים פס מגנטי מלהיב, מצוידים. התססה מנעולים כדי למנוע כניסת חמצן, אך לאפשר את שחרורו של CO₂.
   4. מחממים את המבחנות תסיסה עד 28 ° C על-ידי הצבתם בחדר דגירה ללילה 1 (טמפרטורה להגדיר ב 28 מעלות צלזיוס).
2. חיסון וניטור של fermentations
   1. לגדל זן cerevisiae ס צינורות סטרילי המכיל 10 מ"ל YPD בינוני ב 28 ° C עם טלטול (150 סל ד) במשך 12 שעות. לאחר מכן, pipet 1 מ"ל של YPD preculture. ולהעביר אותו ל 10 מ"ל של SM בינוני (צינורות סטרילי 15 מ"ל). דגירה התרבות של 12 שעות ב 28 ° C עם טלטול (150 סל ד).
   2. תחת זרימה שכבתית, לאסוף preculture aliquot, לכמת האוכלוסייה התא באמצעות מונה הניתן חלקיקים אלקטרונית זה מצויד עם צוהר 100 מיקרומטר. Centrifuge את preculture (2,000 x g, 15 דקות, 4 ° C), להשעות את צניפה ףקיהב במים סטריליים בריכוז הסופי של 2.5 x 10⁸ תאים למ"ל המתאים. לחסן כל fermenter עם 1 מ"ל של התליה תא.
      הערה: מערכת רובוטית המשמשת לפיקוח ההתקדמות תסיסה מתואר באיור1.
   3. הכן את הפלטפורמה תסיסה על ידי התקנת fermenters את המדריכים תמיכה כמו שצריך להציב על לוחות מלהיב 21-מיקום, לקבוע את שיעור מלהיב בכל סל ד 270. כדי להתחיל מאפשר פיקוח על כל התסיסה, להפעיל את היישום בקרת רובוט, ולאחר מכן לחץ על לחצן "התחל assay" ובחר האחסון תסיסה יבוצע (300 מ ל).
   4. הממשק המוצג מאפשרת את הסימן של המספר המיקום של fermenters על הרציף. כדי להבטיח שמצב זה מתרחש, לחץ לחיצה ימנית על המיקום חריץ ובחרו 'הפעל' כדי להפעיל פיקוח על fermenter ממוקם במיקום זה.
   5. אתחל את תוכנת חישוב, לצמיתות הפועלים במערכת, לפני תחילת הרכישה משקל. לחץ על כפתור "Initialiser" ולאמת עם "אישור". לחץ על "לחצן התחל" של היישום בקרת רובוט להתחיל את הרכישות משקל.
3. הליך הדגימה
   הערה: עבור כל fermenter, דגימות נלקחים כאשר ההפקה₂ CO (הערך המוצג ופשוט במחשב שבו פועל את תוכנת חישוב) מגיעה נקודת-הסט נדרש: 5, 10, 40 ו- 90 g/L במחקר זה.
   1. דגימה נוהל תרבויות עם תרכובות עם תוויות.
      1. צנטריפוגה 6 מ ל שני מדגמים (2,000 x גרם, 5 דקות, 4 ° C). לשמור ולאחסן את supernatants קפוא ב- aliquots שני ב-80 מעלות צלזיוס. לשטוף את החבילות פעמיים עם מים מזוקקים מ ל, חנות ב-80 מעלות צלזיוס לשקילת איזוטרופי enrichments.
   2. דגימה נוהל תרבויות ללא תרכובות עם תוויות
      1. קציר 10 מ"ל של תרבות, אשר ישמשו לקביעת משקל יבש. גלולה התאים מדגימות 10 מ ל שני על ידי צנטריפוגה (2,000 x גרם, 5 דקות, 4 ° C). לשטוף את החבילות פעמיים עם 10 מ"ל מים מזוקקים ואחסן אותם ב- 80 ° C לקביעת חלבון ותוכן חומצת אמינו.

2. כימות של מקורות חנקן נצרך

1. נחישות אנזימטי של ריכוזי אמוניה שיורית
   הערה: קביעת ריכוז אמוניה supernatants מתבצעת באמצעות ערכת מבוססי אנזים מסחרי; כל ריאגנטים מסופקים על ידי היצרן.
   1. להכין פתרון אמוניה סטנדרטי (61.4 mg/L) על ידי המסת 25 מ ג של דיוק שנשקל (NH₄)₂אז₄ ב 100 מ ל סטריליות.
   2. כדי ליישם הוראות היצרן, לבצע לדילול 1:2 הדגימות שנלקחו לפני התסיסה ו- 5 g/L של CO₂ שוחרר. התאם את רמת החומציות של הדגימות כ 8 על-ידי הוספת 1 מ' KOH. שימו לב האחסון הוסיף, קח את זה בחשבון הגורם לדילול.
   3. ב- 4 מ"ל ספקטרופוטומטרים וואקום, µL 100 מיקס מדגם (מדולל במידת הצורך), מזוקק מים או פתרון אמוניה סטנדרט עם 2 מ של ריאגנט 1 (0.75 מ מ ADP ו- U/mL 30 גלוטמט דהידרוגנאז במאגר pH 7.8) ו- 500 µL של ריאגנט 2 (1.3 מ'מ NADH). תקופת דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר, קרא NADH ספיגת-340 nm (A1).
   4. להוסיף 500 µL של ריאגנט 3 (60 מ מ α-ketoglutarate במאגר pH 8), דגירה המדגם במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, ולקרוא את ספיגת NADH-340 nm (A2).
   5. לחשב באמצעות ריכוז אמוניה:
      ג_אמוניה (g/L) = 0.083_מדגםx [(0.839 x A1-A2) - (0.839 x A1-A2)_{מים מזוקקים}]
   6. בדוק הריכוז הנכון מתקבל עם הפתרון הסטנדרטי.
2. כרומטוגרפי קביעת ריכוזי חומצת אמינו שיורית
   הערה: קביעת ריכוזי חומצת אמינו ב supernatants מושגת באמצעות מערכת ניתוח חומצת אמינו ייעודי המבוסס על יונים כרומטוגרפיה עם פוסט derivatization עמודה של N-תרכובות עם ninhydrin, אשר מאפשר שלהם זיהוי ערכי צבע מוחלטים.
   1. להכין פתרון הפניה על-ידי הוספת µL 200 של תערובת מסחרית של חומצות אמינו ניטרליים, חומצי, 200 µL של תערובת מסחרית של חומצות אמינו בסיסיות, 200 µL של 2.5 מ מ גלוטמין µL 400 מ מ 200 ליתיום ציטרט מאגר, pH 2.2. פתרון זה מוגדרים כימי התייחסות כאל מדגם.
   2. להוסיף 200 µL של 25% (w/v) sulfosalicylic תמיסה חומצית המכיל norleucine 2.5 מ מ (תקן פנימי) µL 800 של הדגימה כדי להסיר את מולקולות עם משקולות מולקולרית גבוהה. תקופת דגירה של h 1-4 ° C, צנטריפוגה (3,000 x גרם, 10 דקות, 4 ° C), מסנן דרך קרום גודל הנקבוביות ניטרוצלולוזה 0.22-מיקרומטר (מערכת מזרק).
   3. בתוכנה מתכנת, לחץ על לחצן "הפעל" כדי להתחיל את כרומטוגרפיה נוזלית (LC) ניתוחים במנתח מצויד עמודה קטיון (ליתיום טופס). Elute של חומצות אמינו עם מאגרי ליתיום רצופים כדי ליצור מעבר הדרגתי pH והן הדרגתי בריכוז נגד יון בשילוב עם מעבר צבע חום (טבלה 2).
   4. לכמת את תרכובות חנקן לאחר ninhydrin derivatization על ידי גלאי spectrophotometric-570 nm (סגול הגיוון: תגובה בין ninhydrin וקבוצת אמין של חומצות אמינו), 440 ננומטר (צהוב הגיוון: תגובה בין ninhydrin ואימין קבוצת פרולין).
   5. לבצע כיול פנימי של נקודה אחת באמצעות הפניה פתרון norleucine כמו תקן פנימי כדי לחשב את ריכוזי חומצות אמינו הדגימות באמצעות התוכנה של היצרן.

3. כימות של חומצות אמינו Proteinogenic

1. מידת משקל יבש תא
   1. סנן 10 מ"ל של תרבות דרך מסנן ניטרוצלולוזה (נקבובית גודל 0.45 מיקרומטר) כי היא מראש שנשקל במשקע אלומיניום, באמצעות מכשיר ואקום. לשטוף פעמיים עם 50 מ ל מים מזוקקים.
   2. מקם את המסנן בגביע אלומיניום ויבש בתנור החום ב 105 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות (עד ללא שינוי נוסף במשקל נצפית) לפני ושקילה המסנן בגביע. חישוב הפרש המשקל.
   3. חישוב הממוצע של מדידות עצמאי לפחות 3 כדי לקבוע באופן מדויק את המשקל תאים יבשים של התרבות שמרים.
2. כימות של תכולת החלבון של תאים
   הערה: כימות של השבר חלבונים מהתאים מבוצע לפחות שהפקידים באמצעות כדורי תא ללא תווית כי התקבלו כמתואר בסעיף 1.3.2.
   1. תמצית חלבונים על ידי תוספת של 1 מ"ל של פתרון דימתיל סולפוקסיד (50% v/v) כדורי קפוא, דגירה ב 105 ° C לשעה בתנור חום יבש.
   2. לכמת את תכולת חלבון תמציות דימתיל סולפוקסיד באמצעות וזמינותו ערכי צבע מוחלטים הביוכימי מבוססת על צמצום על ידי חלבונים של Cu⁺⁺ לתוך Cu⁺ יונים יש נוספת שבגינו החומצה bicinchoninic במתחם כחול (BCA assay).
3. קביעת התרומה של חומצות אמינו בתוך חלבונים
   הערה: פרופיל חומצות אמינו proteinogenic נקבע לפחות שהפקידים מן התא ללא תווית כדורי (1.3.2.).
   1. להכין תמצית חמצון על ידי השעיית בגדר תא ב 200 µL של חומצה performic (חומצה פורמית 90%, 10% חמצן). תקופת דגירה של 4 שעות ב 4 ° C ולהפסיק את התגובה על ידי התוספת של 33.6 מ ג נתרן גופרתי.
      הערה: השלב חמצון נדרש כדי להמיר מתיונין sulfone ו- cysteic חומצה, אשר ניתן לכמת עוד יותר על ידי יונים כרומטוגרפיה ציסטאין ומתיונין. עם זאת, כמה חומצות אמיניות (טירוזין פנילאלנין, היסטידין, ארגינין) הם שפגע בסימני במהלך הטיפול חמצון. כתוצאה מכך, שני hydrolysates (עם ובלי חמצון) מוכנות.
   2. להוסיף µL 800 של 6N HCl תא כדורי או מחומצן תמצית, דגירה המדגם שפופרת זכוכית הרמטית עבור h 16 ב 110 מעלות צלזיוס בתנור חום יבש. להוסיף 200 µL של 2.5 מ מ norleucine ולהסיר HCl עם זרם של חנקן. לשטוף (resuspending את תמצית יבשים ולאחר מכן להסיר את הנוזל עם זרם חנקן) פעמיים עם 800 µL של מים מזוקקים ולאחר מכן עם 800 µL של אתנול. לקחת µL 800 200 מ"מ ליתיום אצטט מאגר, pH 2.2.
      הערה: תשומת הלב צריך להיות משולם את זמן הדגירה הידרוליזה כמה חומצות אמיניות אינם יציבים בתנאים חומציים. השבר טריפטופן חלבון מוערך מהנתונים שנמצאו בספרות¹⁶, כמו זו חומצת אמינו לחלוטין שפגע בסימני במהלך HCl הידרוליזה.
   3. להכין תקן hydrolysate כיול פנימי של נקודה אחת. להוסיף µL 160 של פתרון מסחרי של חומצות אמינו הידרוליזה µL 840 200 מ"מ ליתיום אצטט מאגר, pH 2.2, המכיל 625 מיקרומטר מתיונין sulfone, 625 חומצה cysteic מיקרומטר, 625 norleucine מיקרומטר.
   4. לקבוע את הריכוזים היחסיים של חומצות אמינו בתוך חלבונים בשיטת כרומטוגרפי המתוארות בסעיף 2.2.
4. חישובים
   1. לחשב את אחוז משקל כל חומצת אמינו בחלבונים על-ידי חלוקת כמות כל חומצה אמינית (mg/L) נמדד לפי הסכום הכולל של חומצת אמינו נמדד תמצית חלבון (סכום ב- mg/L).
   2. אחוז זה להכפיל הריכוז של חלבונים התרבות (mg/L), כלומר, המוצר בין התוכן חלבון של ביומסה משקל יבש, כדי להעריך את הריכוז של כל חומצת אמינו proteinogenic בתרבות (mg/L).

4. מדידה של העשרת איזוטרופי של חומצות אמינו Proteinogenic

הערה: עבור המידה של העשרת איזוטרופי של חומצות אמינו proteinogenic, השתמש כדורי תאים עם תוויות. שלושה סוכנים שונים משמשים עבור השלב derivatization לכמת את העשרת איזוטרופי של חומצות אמינו. עוצמות אשכול יונים נמדדים כדי להעריך את דפוסי תיוג חומצות אמינו. האות של כל יון אשכול מקביל השפע isotopomers המונית (m₀ = ללא תיוג, מ'₊₁ = 1 אטום עם תוויות,...) של קטע חומצה אמינית. דוגמה chromatogram המתקבל לאחר ההליך DMADMF מסופק באיור2.

1. ביומסה הידרוליזה
   1. Hydrolyze כדורי תא (תואם ל- 1-2 מ"ג של ביומסה מיובשים) על ידי הוספת 1.2 מ ל 6 M HCl המקננת המדגם עבור h 16 ב 105 ° C בצינורות זכוכית סגורים היטב בתנור חום יבש.
   2. להוסיף 1.2 מ ל מים מזוקקים, צנטריפוגה x 3000 g עבור 5 דקות כדי הסרת לכלוך הסלולר. להפיץ את תגובת שיקוע לתוך שברים µL 400 ששה צינורות זכוכית פתוח. יבש השברים בתנור החום ב 105 ° C עד שיגיעו מרקם של סירופ (4-5 שעות).
2. Derivatization Ethylchloroformate (ECF)
   1. להמיס את hydrolysate יבשים ב 200 µL של 20 מ מ HCl; לאחר מכן, להוסיף µL 133 פירידין: אתנול (1:4). הוסף µL 50 של ECF derivatize של חומצות אמינו ולהמתין עד כל CO₂ שוחררה. להעביר את התערובת צנטריפוגה צינורות המכילות 500 µL של דיכלורומתאן לסחוט את תרכובות derivatized.
   2. מערבולת הצינורות עבור 10 s ו צנטריפוגה אותם במשך 4 דקות ב 10,000 x g; לאסוף את השלב אורגני התחתון עם פסטר pipet, העברה ל- GC בקבוקונים המכילים זכוכית חרוט מוסיף כך הדגימות עשוי להיות מוזרק ישירות לתוך הכלי GC/MS.
3. (N, N)-Dimethylformamide דימתיל אצטל (DMFDMA) derivatization.
   1. להמיס את hydrolysate מיובשים 50 µL של מתנול, 200 µL של acetonitrile. להוסיף 300 µL של DMFDMA. מערבולת הצינור ולהעביר הדוגמאות כדי GC תעשיה שבקבוקי המכילים זכוכית חרוט מוסיף.
4. N, O-Bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamide (BSTFA) derivatization
   1. להשעות את hydrolysate ב 200 µL של acetonitrile. להוסיף 200 µL של BSTFA, לסגור הרמטית את מבחנה, דגירה במשך 4 שעות ב 135 ° C לפני העברת התמצית ישירות GC בקבוקונים.
5. ניתוח GC-MS
   1. לנתח דגימות עם שמוצאים את זה מצויד עם מזרק תעשיה, מצמידים ספקטרומטר מסה.
      1. השתמש בתוכנה כלי ספציפי לשלוט המכשיר ולנתח את chromatograms. בתפריט "רצף", לחץ על "בטבלה יומן לדוגמה" כדי ליצור את רשימת הדגימה ולחץ על לחצן "הפעל" כדי להתחיל את הזריקות.
         הערה: שמוצאים מצויד עם 30 מ' x 0.25 מ"מ apolar סיליקה נימי עמודה עם עובי הסרט μm 0.15. השוכן הטמפרטורה פאול ספקטרומטר מסה 150 ° C והחזק את הקו העברה ב 250 מעלות צלזיוס במשך כל הבדיקות. שלוש תוכניות אנליטית, כל אחד ספציפי לכל סוכן derivatization, משמשים.
      2. ECF נגזרים: שימוש הליום כשלב ניידים עם קיבולת של 1.2 מ ל לדקה השוכן הטמפרטורה של הים 230 ° C ושל המקור ב- 250 מעלות צלזיוס. תוכנית של תעשיה להחדיר µL 1 דוגמאות של פיצול יחס של 3:1. להפעיל את הבדיקות, והגדילו בהדרגה את טמפרטורת התנור כדלקמן: 130 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות; שיפוע של 15 ° C/min 260 מעלות; לשמור על הטמפרטורה ב 260 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
      3. נגזרים DMFDMA: שימוש הליום כשלב ניידים עם זרם קבוע של 1.2 מ ל לדקה השוכן הטמפרטורה של הים 230 ° C ושל המקור ב- 250 מעלות צלזיוס. תוכנית של תעשיה להחדיר µL 1 דוגמאות של פיצול יחס של 3:1. להפעיל את הבדיקות, והגדילו בהדרגה את טמפרטורת התנור כדלקמן: 60 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה; שיפוע של 20 ° C/דקה עד 130 מעלות צלזיוס; הדרגה השנייה של 4 ° C/min 260 מעלות; לשמור על הטמפרטורה ב 260 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
      4. נגזרים BSTFA: הליום שימוש כמו השלב ניידים עם זרם קבוע של 1.2 מ ל לדקה השוכן הטמפרטורה של הים 275 מעלות צלזיוס ושל המקור ב 300 º C. להפעיל את הבדיקות (הזרקת: 1 µL), בהדרגה להגדיל את טמפרטורת התנור כדלקמן: 110 ° C עבור 1 דקות; הדרגה הראשונה של 2 ° C/min 154 מעלות; הדרגה השנייה של 5 ° C/דקה עד 300 ° C; לשמור על הטמפרטורה ב 300 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
      5. להליך זיהוי: עבור כל מצב של derivatization, להזריק מדגם (1 µL) במצב סריקה עם אלקטרון חיובית השפעה יינון-70 eV ו לרשום משך הזמן של כל חומצת אמינו.
      6. השתמש בערכים אלה כדי להגדיר החלונות. הזמן ברחבי chromatogram את ועבור היונים שנבחר שונה, אשר אופיינית לכל חומצה אמינית המפורטים בטבלה 3; ערכים אלה צריך להיות כלולות עבור כל חומצת אמינו. לכלול מידע זה בתוכנית זיהוי ה-SIM, להפעיל את הבדיקות במצב ה-SIM עם אלקטרון חיובית השפעה יינון-70 eV.
   2. לאסוף את התוצאות של הבדיקות; כלומר, עבור כל חומצת אמינו, להקליט מקבץ של עוצמות המתאימות כדי שלה isotopomers מסה שונה. לעבד נתונים באמצעות ה-dedicatedsoftware¹⁷ לתקן עבור תיוג טבעי, לחשב את העשרת איזוטרופי חומצות אמינו proteinogenic (כהגדרתו השבר שכותרתו של חומצת אמינו ביחס שלה הסכום הכולל חלבון דוגמאות).
      הערה: את העשרת איזוטרופי של מולקולה (קרי), המבוטא באחוזים, חישוב חלוקת הסכום של עוצמות המתוקן isotopomers המוני עם תיוג (ז₁, m₂,. קובי ב_n) בסכום המתוקן עוצמות של כל isotopomers המוני (m₀, מ'₁, m₂,. m_n):
      כלומר אני = (ז₁ + m₂ +... + m_n) / (m₀ + m₁+ m₂ +... + m_n)

5. כמת והעשרה איזוטרופי של תרכובות נדיפות

1. מיצוי של תרכובות נדיפות שכותרתו
   1. להוסיף 10 µL של סטנדרטים פנימיים deuterated 5 מ של תגובת שיקוע (הריכוז הסופי של תרכובות deuterated: µg 100/L) שפופרת זכוכית 15 מ"ל. להוסיף 1 מ"ל של דיכלורומתאן, בחוזקה לסגור את הצינורות ואת לנער אותם בפלטפורמה נדנדה 20 דק צנטריפוגה למשך 5 דקות ב g x 3000 ולאסוף השלב התחתון אורגני שפופרת זכוכית 15 מ"ל. חזור על החילוץ דיכלורומתאן.
   2. יבש את תמצית אורגנית מעל 500 מ"ג נתרן גופרתי נטול מים ולאסוף את שלב נוזלי עם pipet פסטר. לרכז את התמצית בפקטור של ארבעה מתחת שטף חנקן, להעביר אותו בקבוקון תעשיה GC.
2. GC-MS כימות של תרכובות נדיפות
   1. לצייד את הדגימות עם עמודה נימי של סיליקה fused 30 מ' x 0.25 מ"מ עם עובי הסרט μm 0.25 ולהחיל זרם קבוע הליום של 1.0 מ"ל לדקה להחזיק את מזרק לבין הקו העברה ב- 250 מעלות צלזיוס.
   2. להזריק µL 2 מדגם עם יחס פיצול של 10:1 ויש להפריד בין מולקולות נדיפות חילוץ באמצעות הפרופיל טמפרטורת התנור הבא: להחזיק את הטמפרטורה למשך 3 דקות ב 40 מעלות צלזיוס, להגדיל אותו על ידי 4 ° C/דקה עד 220 ° C, ולאחר מכן הקש התנור ב 220 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
   3. לזהות את תרכובות באמצעות ספקטרומטר מסה עם הטמפרטורה שלו המקור שוכן בגובה 230 ° C ו את הטמפרטורה פאול ספקטרומטר המסה שלו, שוכן בגובה 150 ° C. שיא מסת ספקטרום במצב נבחר יון ניטור (SIM) עם אלקטרון חיובית השפעה יינון-70 eV ושימוש האשכולות יון ספציפיים כדי תרכובות נדיפות המדווחות בטבלה4.
   4. השתמש כיול חיצוני של 7 נקודות כדי לכמת את ריכוזי מולקולות נדיפות מן הסכומים של עוצמות של האשכול יון המתאימים. להכין מלאי פתרונות של כל המתחם (10 גרם/ליטר) ב- 100% אתנול. לאחר מכן, הכן פתרונות סטנדרטיים עבור כל מחלקה של מולקולות נדיפות (אסטרים אתיל, מיוצרות, כהלים וחומצות) על ידי ערבוב פתרונות מניות. לבסוף, לדלל כמויות שונות של פתרונות סטנדרטיים בפתרון hydroalcoholic 12% המכיל חומצה טרטרית 5 g/L עם ה-pH להתאים ל- 3.3 להכין כיול פתרונות.
   5. במקביל, לתקן עבור תיוג הטבעי של עוצמות של כל אשכול יון, לחשב את העשרת איזוטרופי של תרכובות נדיפות, אשר מוגדר השבר שכותרתו של המולקולות ומבוטא כאחוז שימוש בתוכנה ייעודית ¹⁷.

6. חישובים עבור ניתוח משולב של הנתונים (dataset)

1. איסוף הנתונים הגולמיים
   1. באמצעות הפירוט המוצגת טבלאות 5, 6, 7, ו- 8, הזן את ערכי הנתונים הגולמיים התואמים ריכוז חומצות אמינו חוץ-תאית, משקל יבש של תאים, חלבון התוכן של תאים, ריכוז של מולקולות נדיפות, ואת איזוטרופי העשרה של חומצות אמינו proteinogenic ומולקולות נדיף.
      הערה: הנתונים המוצגים בטבלאות מבוטאים מ מ. כל התוצאות מתבטאים גם ב- mg/L על ידי הכפלת הערכים מ מ משקל מולקולרי של כל מולקולה או ב- mg N/L על ידי הכפלת ריכוז חומצת אמינו proteinogenic millimolar המסה האטומית של חנקן (14 u) ועל -ידי המספר של חנקן ato ms המסופקים על-ידי קטבוליזם של מולקולה זו.
   2. לחשב את אחוז מסת כל חומצת אמינו בחלבונים על-ידי חלוקת הכמות שלו ב- mg/L ב- hydrolysate לפי הסכום הכולל של חומצות אמינו (סכומן ב- mg/L).
   3. לחשב את האמצעים, סטיות תקן, תקן שגיאות של הממוצע מן הנתונים התקבלו בניסויים עצמאית.
   4. לחשב את ריכוז proteinogenic (mg/L) עבור כל חומצת אמינו על-ידי הכפלת האחוז של זו חומצת אמינו בחלבונים (mg aa/g חלבונים) על-ידי השבר חלבון ביומסה (גרם חלבונים/g DW) ואת תוכן משקל יבש (ביומסה ייצור) ב- בינוני (g DW/L).
2. ¹⁵ N מעקב איזוטרופי ניסויים
   1. באמצעות הפירוט המוצגים בטבלה 9, לחשב שברים שכותרתו, ללא תווית של חנקן הקיימים חומצות אמינו proteinogenic (מבוטא במ ג N/L) של ריכוזי הכולל שלהם (מבוטא במ ג N/L) שלהם enrichments איזוטרופי. עבור כל חומצת אמינו, השבר עם תוויות מקביל המוצר בין הריכוז שלו את העשרת איזוטרופי, החלק ללא תווית הוא ההפרש בין סך הכמויות המסומנות בתווית.
   2. לאחר מכן, לקבוע את השבר של חנקן הכולל בחלבונים מכילה חומצות אמינו את proteinogenic לכמת במחקר זה מסכם את הסכום הכולל של Ala, Gly, וואל, Asp, Phe, Leu, איל, חמישי, Ser, Pro, ליס, שלו, Glu, Arg (ב מ ג N/L), חלוקת סה כ הר של חנקן הכלול חלבונים על ידי סכום זה.
   3. לחשב את החנקן שסופקו על-ידי ארגינין, גלוטמין או אמוניום זה שוחזר בחומצות proteinogenic לכמת במחקר זה על-ידי סיכום השבר שכותרתו (ב מ ג N/L) של חומצות אמינו proteinogenic אשר היו לכמת במחקר (Ala, Gly, וואל, Asp, Phe, Leu, איל, חמישי, Ser, Pro, ליס, שלו, Glu ו Arg) במהלך הניסויים בנוכחות ¹⁵התווית על-ידי N ארגינין, גלוטמין, או אמוניום, חילוק שבר החנקן בתווית זו הסכום הכולל של חנקן ב proteinogenic כימות אמינו חומצות.
   4. להעריך את התרומה 3 חומצות אמינו הנפוץ ביותר לבריכה תאיים של חנקן משמש דה נובו ביוסינטזה על-ידי שילוב נתונים מן ¹³C ו ¹⁵N איזוטופ מעקב ניסויים (גיליון אלקטרוני, טבלה מס ' 7).
   5. מתוך הסכום הכולל (מבוטא במ מ) של proteinogenic ואל, Leu, איל או חמישי, לנכות את החלק נגזר שיתוף ישיר של תרכובות נצרך (¹³C ניסויים), החלק synthetized דה נובו באמצעות חנקן מן 3 מקורות עיקריים כדי להעריך את השבר היה synthetized דה נובו באמצעות חנקן מחומצות אמינו אחרות.
   6. לאחר מכן, לחשב את היחס שבין כמות חומצת אמינו דה נובו synthetized באמצעות חנקן שמספק זאת שוב Arg, NH₄⁺ (סכום לידי ביטוי מ"מ) לסכום הכולל של proteinogenic חומצות אמינו (במ מ) לכמת את התרומה של ארגינין, גלוטמין ו אמוניום לבריכה חנקן תאיים.
3. ¹³ C מעקב איזוטרופי ניסויים
   1. לחשב שברים שכותרתו, ללא תווית של חומצות האמינו את proteinogenic של ריכוזי לידי ביטוי מ"מ ו איזוטרופי enrichments של חומצות אמינו proteinogenic אשר התקבלו במהלך הניסויים בנוכחות ¹³התווית על-ידי C Leu, ואל, איל או חמישי. (ראה 6.2.1, טבלה 10).
   2. לחשב שברים שכותרתו, ללא תווית של תרכובות נדיפות של ריכוזי לידי ביטוי מ"מ ו איזוטרופי enrichments של תרכובות נדיפות התקבלו במהלך הניסויים בנוכחות ¹³התווית על-ידי C Leu, וואל, איל או חמישי ( טבלה 10).

תוצאות

תרשים 3 מציג תרשים סכימטי של זרימת העבודה שיושמה כדי לחקור את הניהול על ידי שמרים של מקורות חנקן מרובות שנמצאו במהלך התסיסה היין.
עבור נקודות שונות של הדגימה, המאפיינים ביולוגי פרמטרי – צמיחה, דפוסי צריכת החנקן לפרופיל של proteinogenic חומצות אמינו – הצג הפאר?...

Discussion

לכימות חלוקת תרכובות דרך רשתות מטבוליות באמצעות מעקב איזוטרופי הניסויים היא גישה מבטיחה להבנת פעולת חילוף החומרים מיקרוביאלי. מתודולוגיה זו, בעוד הוחלו בהצלחה עם מצעים עם תוויות אחד או שניים, כעת אפשרות ליישם ללמוד מטבוליזם של מקורות שונים באמצעות מספר איזוטופים אלמנטלים שכותרתו (קרי<...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
D-Glucose	PanReac	141341.0416
D-Fructose	PanReac	142728.0416
DL-Malic acid	Sigma Aldrich	M0875
Citric acid monohydrate	Sigma Aldrich	C7129
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P5379
Potassium sulfate	Sigma Aldrich	P0772
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	230391
Calcium chloride dihydrate	Sigma Aldrich	C7902
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S9625
Ammonium chloride	Sigma Aldrich	A4514
Sodium hydroxide	Sigma Aldrich	71690
Manganese sulfate monohydrate	Sigma Aldrich	M7634
Zinc sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	Z4750
Copper (II) sulfate pentahydrate	Sigma Aldrich	C7631
Potassium iodine	Sigma Aldrich	P4286
Cobalt (II) chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	C3169
Boric acid	Sigma Aldrich	B7660
Ammonium heptamolybdate	Sigma Aldrich	A7302
Myo-inositol	Sigma Aldrich	I5125
D-Pantothenic acid hemicalcium salt	Sigma Aldrich	21210
Thiamine, hydrochloride	Sigma Aldrich	T4625
Nicotinic acid	Sigma Aldrich	N4126
Pyridoxine	Sigma Aldrich	P5669
Biotine	Sigma Aldrich	B4501
Ergostérol	Sigma Aldrich	E6510
Tween 80	Sigma Aldrich	P1754
Ethanol absolute	VWR Chemicals	101074F
Iron (III) chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	236489
L-Aspartic acid	Sigma Aldrich	A9256
L-Glutamic acid	Sigma Aldrich	G1251
L-Alanine	Sigma Aldrich	A7627
L-Arginine	Sigma Aldrich	A5006
L-Cysteine	Sigma Aldrich	C7352
L-Glutamine	Sigma Aldrich	G3126
Glycine	Sigma Aldrich	G7126
L-Histidine	Sigma Aldrich	H8000
L-Isoleucine	Sigma Aldrich	I2752
L-Leucine	Sigma Aldrich	L8000
L-Lysine	Sigma Aldrich	L5501
L-Methionine	Sigma Aldrich	M9625
L-Phenylalanine	Sigma Aldrich	P2126
L-Proline	Sigma Aldrich	P0380
L-Serine	Sigma Aldrich	S4500
L-Threonine	Sigma Aldrich	T8625
L-Tryptophane	Sigma Aldrich	T0254
L-Tyrosine	Sigma Aldrich	T3754
L-Valine	Sigma Aldrich	V0500
13C5-L-Valine	Eurisotop	CLM-2249-H-0.25
13C6-L-Leucine	Eurisotop	CLM-2262-H-0.25
15N-Ammonium chloride	Eurisotop	NLM-467-1
ALPHA-15N-L-Glutamine	Eurisotop	NLM-1016-1
U-15N4-L-Arginine	Eurisotop	NLM-396-PK
Ethyl acetate	Sigma Aldrich	270989
Ethyl propanoate	Sigma Aldrich	112305
Ethyl 2-methylpropanoate	Sigma Aldrich	246085
Ethyl butanoate	Sigma Aldrich	E15701
Ethyl 2-methylbutanoate	Sigma Aldrich	306886
Ethyl 3-methylbutanoate	Sigma Aldrich	8.08541.0250
Ethyl hexanoate	Sigma Aldrich	148962
Ethyl octanoate	Sigma Aldrich	W244910
Ethyl decanoate	Sigma Aldrich	W243205
Ethyl dodecanoate	Sigma Aldrich	W244112
Ethyl lactate	Sigma Aldrich	W244015
Diethyl succinate	Sigma Aldrich	W237701
2-methylpropyl acetate	Sigma Aldrich	W217514
2-methylbutyl acetate	Sigma Aldrich	W364401
3-methyl butyl acetate	Sigma Aldrich	287725
2-phenylethyl acetate	Sigma Aldrich	290580
2-methylpropanol	Sigma Aldrich	294829
2-methylbutanol	Sigma Aldrich	133051
3-methylbutanol	Sigma Aldrich	309435
Hexanol	Sigma Aldrich	128570
2-phenylethanol	Sigma Aldrich	77861
Propanoic acid	Sigma Aldrich	94425
Butanoic acid	Sigma Aldrich	19215
2-methylpropanoic acid	Sigma Aldrich	58360
2-methylbutanoic acid	Sigma Aldrich	193070
3-methylbutanoic acid	Sigma Aldrich	W310212
Hexanoic acid	Sigma Aldrich	153745
Octanoic acid	Sigma Aldrich	W279900
Decanoic acid	Sigma Aldrich	W236403
Dodecanoic acid	Sigma Aldrich	L556
Fermentor 1L	Legallais	AT1357	Fermenter handmade for fermentation
Disposable vacuum filtration system	Dominique Deutscher	029311
Fermenters (250 ml)	Legallais	AT1352	Fermenter handmade for fermentation
Sterile tubes	Sarstedt	62.554.502
Fermentation locks	Legallais	AT1356	Fermetation locks handmade for fermentation
BactoYeast Extract	Becton, Dickinson and Company	212750
BactoPeptone	Becton, Dickinson and Company	211677
Incubator shaker	Infors HT
Particle Counter	Beckman Coulter	6605697	Multisizer 3 Coulter Counter
Centrifuge	Jouan		GR412
Plate Butler Robotic system	Lab Services BV	PF0X-MA	Automatic instrument
Plate Butler Software	Lab Services BV		Robot monitor software
RobView			In-house developed calculation software
My SQL			International source database
Cimarec i Telesystem Multipoint Stirrers	Thermo Fisher Scientific	50088009	String Drive 60
BenchBlotter platform rocker	Dutscher	60903
Ammonia enzymatic kit	R-Biopharm AG	5390
Spectrophotometer cuvettes	VWR	634-0678
Spectrophotometer UviLine 9400	Secomam
Amino acids standards physiological - acidics and neutrals	Sigma Aldrich	A6407
Amino acids standards physiological - basics	Sigma Aldrich	A6282
Citrate lithium buffers - Ultra ninhydrin reagent	Biochrom	BC80-6000-06
Sulfosalycilic acid	Sigma Aldrich	S2130
Norleucine	Sigma Aldrich	N1398
Biochrom 30 AAA	Biochrom
EZChrom Elite	Biochrom		Instrument control and Data analysis software
Ultropac 8 resin Lithium	Biochrom	BC80-6002-47	Lithium High Resolution Physiological Column
Filter Millex GV	Merck Millipore	SLGVX13NL	Millex GV 13mm (pore size 0.22 µm)
Membrane filter PALL	VWR	514-4157	Supor-450 47mm 0.45µm
Vacuum pump Millivac Mini	Millipore	XF5423050
Aluminium smooth weigh dish 70mm	VWR	611-1380
Precision balance	Mettler		Specifications AE163
Dimethyl sulfoxid dried	Merck	1029310161	(max. 0.025% H2O) SeccoSolv
Combustion oven	Legallais
Pierce BCA protein assay kit	Interchim	UP40840A
Formic acid	Fluka	94318
Hydrogen peroxide	Sigma Aldrich	H1009
Hydrochloric Acid Fuming 37% Emsure	Merck	1003171000	Grade ACS,ISO,Reag. Ph Eur
Lithium acetate buffer	Biochrom	80-2038-10
Commercial solution of hydrolyzed amino acids	Sigma Aldrich	AAS18
L-Methionine sulfone	Sigma Aldrich	M0876
L-Cysteic acid monohydrate	Sigma Aldrich	30170
Pyrex glass culture tubes	Sigma Aldrich	Z653586
Pyridine	Acros Organics	131780500	99% Extrapure
Ethyl chloroformate	Sigma Aldrich	23131
Dichloromethane	Sigma Aldrich	32222
Vials	Sigma Aldrich	854165
Microinserts for 1.5ml vials	Sigma Aldrich	SU860066
GC/MS	Agilent Technologies	5890 GC/5973 MS
Chemstation	Agilent Technologies		Instrument control and data analysis software
Methanol	Sigma Aldrich	34860	Chromasolv, for HPLC
Acetonitrile	Sigma Aldrich	34998	ChromasolvPlus, for HPLC
N,N-Dimethylformamide dimethyl acetal	Sigma Aldrich	394963
BSTFA	Sigma Aldrich	33024
DB-17MS column	Agilent Technologies	122-4731	30m*0.25mm*0.15µm
Sodium sulfate, anhydrous	Sigma Aldrich	238597
Technical nitrogen	Air products	14629
Zebron ZB-WAX column	Phenomenex	7HG-G007-11	30m*0.25mm*0.25µm
Helium BIP	Air products	26699
Glass Pasteur pipettes	VWR	612-1702