Birden çok besin kaynaklarının mikrobiyal metabolizma araştırmaya izotopik izleyici deneyler kombinasyonuna göre iş akışı

Özet

Bu iletişim kuralı metabolizma birden çok besin kaynaklarının nicelik ve kapsamlı bir şekilde araştırmak için deneysel bir işlem açıklanır. İzotopik izleyici deneyleri ve analitik bir yordam, bir kombinasyonuna göre bu iş akışı, tüketilen besin kaderi ve molekülleri synthetized metabolik kökenli mikroorganizmalar tarafından belirlenecek sağlar.

Özet

Mikrobiyoloji alanında çalışmalar çok çeşitli yöntemleri uygulanması konusunda güveniyor. Özellikle, uygun yöntem geliştirme önemli ölçüde benzersiz azot ve karbon kaynakları içeren kimyasal olarak tanımlanan medya içinde büyüyen mikroorganizmaların metabolizması kapsamlı bilgi sunmak için katkıda bulunur. Buna ek olarak, metabolizma ile yönetimi geniş varlıklarını doğal veya endüstriyel ortamlarda rağmen birden çok besin kaynaklarının hemen hemen keşfedilmemiş kalır. Bu durum hangi soruşturma engel esas olarak uygun yöntemleri nedeniyle olmaması.

Biz nicelik ve kapsamlı bir besin karışımı farklı molekül, Yani, karmaşık bir kaynak olarak sağlandığında metabolizma nasıl çalıştığını keşfetmek için deneysel bir strateji raporu. Burada, Maya metabolik ağ üzerinden birden çok azot kaynakları bölümleme değerlendirmek için uygulanması açıklanmaktadır. İş akışını seçilen ¹³C - ya da ¹⁵N etiketli yüzeylerde kullanarak kararlı izotop izleme deneyleri sırasında elde edilen bilgilerle birleştirir. İlk paralel ve tekrarlanabilir fermentations N içeren moleküllerin karışımı içeren aynı ortamda oluşur; Ancak, seçilen azot kaynağı her zaman taşır. Analitik işlemleri (HPLC, GC-MS) bir arada hedeflenen bileşikler etiketleme şekillerinin değerlendirmek için ve tüketimi ve diğer metabolitler yüzeylerde kurtarılması ölçmek için uygulanır. Tam veri kümesi tümleşik bir analizini tüketilen yüzeylerde hücrelerin içindeki kaderi genel bakış sağlar. Bu yaklaşım doğru bir iletişim kuralı örnekleri – kolaylaştırdı koleksiyon için online fermentations izleme için bir robot destekli sistem tarafından gerektirir- ve çok sayıda zaman alan analizleri başarı. Bu kısıtlamaları rağmen bu anlayış, ilk kez birden fazla azot kaynakları Maya metabolik ağ genelinde bölümleme izin. Biz diğer N-bileşikler doğru daha bol kaynaklardan gelen azot dağıtılması aydınlatılmamıştır ve uçucu moleküllerin ve proteinogenic amino asit metabolik kökenleri belirledi.

Giriş

Mikrobiyal metabolizma çalışır nasıl anlayış fermantasyon süreçlerini geliştirmek ve fermantatif bileşiklerin üretimi modüle için etkili stratejiler tasarımı için önemli bir konudur. Gelişmeler genomik ve fonksiyonel genomik bu son iki yıl içinde büyük ölçüde birçok mikroorganizmaların metabolik ağların topolojisi bilgi genişletilmesi için katkıda bulunmuştur. Bu bilgilere erişimi hücresel işlev¹kapsamlı bir genel bakış için amaç yaklaşımlar gelişmesine yol açtı. Bu metodolojileri çoğunlukla bir modeli tabanlı yorumlanması ölçülebilir parametreler üzerinde kullanır. Bu deneysel veriler, bir yandan metaboliti alımı ve üretim fiyatlarına dahildir ve öte yandan, izotop izleyici elde edilen nicel hücre içi bilgi deneyler. Bu veriler tanımlanmış metabolik ağ^2,3,4farklı yollar içinde vivo aktivitesi kesinti için gerekli bilgileri sağlar. Şu anda, mevcut analitik teknikler sadece bir tek öğeli izotop kullanırken desenleri moleküllerin etiketleme, doğru algılamasını etkinleştirmek ve muhtemelen iki izotopik öğelerle birlikte etiketleme zaman. Ayrıca, çoğu büyüme koşullar altında karbon kaynağı yalnızca bir veya iki-bileşikler oluşur. Sonuç olarak, ¹³C-izotopik izleyiciler karbon yüzeyler üzerinden göre yaklaşımlar yaygın ve başarılı bir şekilde karbon metabolik ağ işlemleri^{5,6,7 tam bir anlayış geliştirmek için uygulanan ,8}.

Buna ek olarak, pek çok doğal ve endüstriyel ortamlarda, mikrobiyal büyüme destekler kullanılabilir azot kaynağı kez molekülleri çok çeşitli oluşur. Örneğin, şarap ya da bira fermantasyon sırasında azot 18 amino asitler ve amonyum değişken konsantrasyonları⁹karışımı sağlanır. Bu dizi anabolizma için erişilebilir N bileşiklerin ikinci azot, genellikle amonyum benzersiz bir kaynak kullanarak elde edilir bu karmaşık medya koşullar büyük ölçüde yaygın olarak fizyolojik çalışmaları için kullanılan farklı yapar.

Genel olarak, azot bileşikleri olabilir doğrudan proteinlerin dahil ya da catabolized içselleştirilmiş. Maya Saccharomyces cerevisiae' de dahil olmak üzere birçok mikroorganizmalar azot metabolizması ağ yapısını yüzeylerde çeşitlilik uygun olarak çok karmaşıktır. Şematik, glutamin, Glutamat ve α-ketoglutarate^10,11, enzimleri ve deaminases şekilde tromboksan azot metabolizması merkezi çekirdek bu sistem dayanmaktadır. Bu ağ üzerinden amonyum veya diğer amino asitlerin Amin grupları bir araya geldik ve α-keto asit serbest. Bu ara da synthetized Merkezi karbon metabolizması (CCM)^12,13arası vardır. Bu sayıda dallı reaksiyonlar ve ara ürün, eksojen azot kaynakları katabolizma ve proteinogenic amino asitler, anabolizma dahil hücreleri anabolik gereklerini yerine getirir. Aktivite bu farklı birbirine bağlı yolları da metabolitleri atılımı sonuçlanır. Özellikle, α-keto asit yüksek alkoller ve onların asetat ester türevleri¹⁴, önemli katkıda bulunan ürünlerin duyusal profiller üretmeye Ehrlich yolu aracılığıyla yönlendirilebilirsiniz. Daha sonra çalışma şeklini azot metabolizması biyokütle üretimi ve uçucu moleküllerin (aroma) oluşumu içinde önemli bir rol oynar.

Tepkiler, enzim ve gen azot üretimiyle literatürde yaygın olarak açıklanmıştır. Ancak, birden fazla azot kaynakları metabolik bir ağ genelinde dağılımı sorunu henüz giderilmiş değil. Bu bilgi eksikliği açıklamak iki ana nedeni vardır. İlk olarak, azot metabolizması ağ önemli karmaşıklığı içinde görüş-in, nicel veri büyük miktarda kullanılamaz faaliyete tam bir anlayış için gerekli şimdiye kadar. İkinci, birçok deneysel kısıtlamaları ve sınırlamaları analitik yöntemleri CCM işlevi aydınlatma için daha önce kullanılan yaklaşımların uygulanması engelledi.

Bu sorunların üstesinden gelmek için mutabakat veri izotopik izleyici deneyler bir dizi dayalı bir sistem düzeyinde yaklaşım geliştirmek seçtik. İş akışı içeren:
-Her seferinde farklı bir seçili besin kaynağı (substrat) etiketli iken fermentations kümesi aynı çevre koşullarında yürütülmüştür.
-Bir arada etiketli substrat ve konsantrasyonu kalan konsantrasyon ve izotopik zenginlik üzerinden elde edilen bileşiklerin fermantasyon farklı aşamalarında bir doğru belirlenmesi için analitik işlemleri (HPLC, GC-MS) katabolizma etiketli molekülünün türetilmiş biyokütle dahil olmak üzere.
-Bir hesaplama her kitle ve izotopik dengesinin etiketli molekül ve akı oranları belirlenmesi yoluyla mikroorganizmalar tarafından birden çok besin kaynaklarının yönetimi genel bir bakış elde etmek için veri kümesi bir daha fazla entegre analiz tüketilen .

Bu yöntemi uygulamak için dikkat zorlanma/mikroorganizma kültürler arası tekrarlanabilir davranışındaki ödenmelidir. Ayrıca, farklı kültürlerden gelen örnekleri aynı iyi tanımlanmış fermantasyon devam ederken alınması gerekir. Bu el yazması bildirdi deneysel çalışmalarında bir robot destekli sistem fermentations online izlemek için bu kısıtlamalar için hesap için kullanılır.

Ayrıca, çalışmanın bilimsel sorunla ilgili olarak uygun etiketli yüzeylerde (bileşik, doğa ve konumu maddelerinin etiketlenmesi) kümesi seçmek önemlidir. Burada, ¹⁵N etiketli amonyum, glutamin ve arginin üzüm suyu bulunan üç büyük azot kaynağı olarak seçilmiştir. Bu üzerinden tüketilen bileşikler azot yeniden dağıtım proteinogenic amino asitler için desen değerlendirmek izin verdi. Ayrıca tüketilen amino asitler ve uçucu moleküllerin üretimini yaptıkları katkı karbon omurgası kaderi araştırmak amaçladık. Bu amaç, liflerin düzenli bir biçimde ¹³lösin C harfiyle karşılamak için isoleucine, treonin ve Valin çalışmada Ehrlich yolu büyük ara ürün elde edilen amino asitler olarak dahil edilmiştir.

Genel olarak, biz kantitatif Maya fermantasyon Ayrıca karbon öncüleri fazlalığı çıkarmadan süre boyunca anabolik gereksinimleri yerine getirmek için eksojen azot kaynakları yeniden dağıtma tarafından bir karmaşık azot kaynağı nasıl yönettiğini araştırdı uçucu moleküllerin. Bu gazetede bildirdi deneysel işlemin diğer mikroorganizma tarafından kullanılan diğer birden çok besin kaynaklarını araştırmak için uygulanabilir. Bu mikroorganizmaların metabolik davranışını genetik arka plan veya çevre koşullarının etkisi analizi için uygun bir yaklaşım gibi görünüyor.

Protokol

1. fermantasyon ve örnekleme

1. Medya ve fermenters hazırlanması
   Not: Tüm fermentations taşınan dışarı aynı soy kullanarak paralel ve aynı kimyasal sentetik orta (SM, Tablo 1' de sağlanan kompozisyon), tanımlanan¹⁵azot kaynakları olarak amonyum ve amino asitler içerir. Diğerleri etiketsiz kalır her fermantasyon için sadece bir düzgün etiketli ¹³C veya ¹⁵N form (% 100), bir tek azot bileşik sağlanır. Deney grubunda kullanılan her etiketli azot kaynağı için (burada: ¹⁵NH₄, U -¹⁵N4-Arg, U -¹⁵N2-Gln, U -¹³C6-Ley, U -¹³C5-Val, U -¹³C6-Ile, U -¹³C4-Thr), iki fermenters hazırlanır. Her koşul için yinelenen fermantasyon sadece etiketlenmemiş molekülleri (7 kontrol fermentations) kullanılarak gerçekleştirilir.
   1. Her N-belirlenmesi için 500 mL SM hazırlamak için kaynak Tablo 1' de, % 100 kullanılmak üzere bileşik dışında listelenen tüm azot kaynakları içeren orta form etiketli.
      Not: Sonraki adımda etiketli molekül eklenir.
   2. Her ortamda (10 min, 100 ° C) bir 1 L şişe pastörize bir manyetik karıştırma çubuğunu içeren. Tablo 1 ' de rapor son toplama ulaşmak için etiketli molekül uygun miktarda tartmak ve ortamda çözülür.
   3. Bir tek kullanımlık vakum filtrasyon sistemi (selüloz asetat membran, 0,22 µm) kullanarak orta sterilize. Steril bir ölçüm silindir kullanarak, CO₂sürümü izin ama oksijen girişini önlemek için fermantasyon kilitleri ile donatılmıştır ve manyetik bir karıştırma çubuğu içeren önceden sterilize iki fermenters (250 mL) arasında orta bölün.
   4. Fermantasyon şişeler 28 ° C için 1 gecelik (sıcaklık 28 ° C'de ayarla) kuluçka odasında yerleştirerek ısı.
2. Aşılama ve fermentations izleme
   1. S. cerevisiae zorlanma YPD orta 28 ° c (150 devir/dakika) için 12 h sallayarak ile 10 mL içeren steril tüpler içinde büyümek. Sonra YPD 1 mL damlalıklı preculture ve SM ortamda (15 mL steril tüpler) 10 mL transfer. Kültür 28 ° c (150 devir/dakika) sallayarak ile 12 h için kuluçkaya.
   2. Laminar akış altında bir preculture aliquot toplamak ve 100 µm diyafram ile donatılmış bir elektronik parçacık sayaç kullanarak hücre nüfus ölçmek. Preculture (2.000 x g, 15 dk, 4 ° C) santrifüj kapasitesi ve Pelet steril su 2.5 x 10⁸ hücre/mL nihai bir konsantrasyon elde etmek için uygun bir hacim içinde askıya alma. Her fermenterler hücre süspansiyon 1 mL ile aşılamak.
      Not: fermantasyon ilerlemesini izlemek için kullanılan Robotik sistem şekil 1' de anlatılan.
   3. Fermantasyon platformu düzgün 21-pozisyon karıştırma Tabaklarda girdiği ve 270 rpm'de karıştırma oranını ayarlamak destek kılavuzları fermenters yükleyerek hazırlayın. On-line her fermantasyon izlemeye başlamak için robot-denetim uygulamayı başlatmak sonra "Başlat tahlil" düğmesini tıklatın ve (300 mL) yapılacak fermantasyon birimini seçin.
   4. Görüntülenen arabirim numarası göstergesi ve fermenters konumunu platformda izin verir. Bunun gerçekleşmesini sağlamak için yuvası konumu sağ tıklatın ve "Bu konumda bulunan fermenterler izleme etkinleştirmek için etkinleştir" seçin.
   5. Kalıcı olarak kilo alma başlamadan önce sistemde çalışan hesaplama yazılımı başlatmak. "Initialiser" butonuna tıklayın ve "ok" sağlam temele oturtulmuş. "" Kilo alımları başlatmak için robot kontrol uygulamasının tıkırtı üstünde başlamak düğme.
3. Örnekleme yordamı
   Not: CO₂ üretim (hesaplama yazılımı çalıştıran bilgisayar üzerinde on-line gösterilen değer) gerekli ayar noktası ulaştığında her fermenterler için örnekler alınır: 5, 10, 40 ve 90 g/L Bu çalışmada.
   1. Yordam etiketli bileşikler ile kültürler için örnekleme.
      1. İki 6 mL örnek (2.000 x g, 5 dk, 4 ° C) santrifüj kapasitesi. Kaydedin ve donmuş supernatants iki aliquots-80 ° C'de depolayın Granül iki kez 5 mL distile su ve mağaza izotopik enrichments ölçümü için-80 ° C'de ile yıkayın.
   2. Yordam etiketli bileşikler olmadan kültürler için örnekleme
      1. 10 mL kuru ağırlığı tayini için kullanılan kültür hasat. Santrifüjü (2.000 x g, 5 dk, 4 ° C) tarafından iki 10 mL örnek hücrelerden cips. Granül iki kez 10 mL distile su ile yıkama ve-80 ° c protein ve amino asit içeriği tayini için stok onları.

2. miktar tüketilen azot kaynakları

1. Enzimatik kalan amonyak konsantrasyonu tayini
   Not: Ticari bir enzim tabanlı kiti kullanılarak supernatants amonyak konsantrasyonu tayini yapılır; tüm reaktifler üreticisi tarafından sağlanır.
   1. Bir standart amonyak çözüm (61,4 mg/L) tam olarak tartılır (NH₄)₂25 mg kadar çözülerek hazırlamak₄ ' te 100 mL volumetric flask.
   2. Üreticinin yönergelerini yerine getirmek için fermantasyon öncesi ve 5 g/L CO₂ serbest bırakmak, alınan örneklerin bir 1:2 seyreltme gerçekleştirin. Yaklaşık 8 örnekleri pH 1 M KOH ekleyerek ayarlayın. Eklenen birim dikkat ve seyreltme faktörü dikkate almak.
   3. 4 mL Spektrofotometre cuvettes, (gerekirse seyreltilmiş) örneğinin mix 100 µL distile su veya standart amonyak çözüm ile 2 mL reaktif 1 (0,75 mM ADP ve 30 U/mL Glutamat dehidrojenaz pH 7.8 arabelleği) ve reaktif 2 (1.3 mM NADH) 500 µL. 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya ve 340 Absorbans NADH okumak nm (A1).
   4. Reaktif 3 (60 mM pH 8 arabelleği α-ketoglutarate) 500 µL eklemek, oda sıcaklığında 20 dk için örnek kuluçkaya ve 340 NADH Absorbans okuma nm (A2).
   5. Amonyak konsantrasyonu kullanarak hesaplama:
      C_amonyak (g/L) = 0,083 x [(0.839 x A1-A2)_örnek- (0.839 x A1-A2)_{distile su}]
   6. Kontrol doğru konsantrasyon ile standart çözüm elde edilir.
2. Kromatografik kalan amino asit konsantrasyonu tayini
   Not: Supernatants konsantrasyonlarda amino asit tayini sağlar ninhydrin ile yazı sütun derivatization N-bileşikler ile iyon değiştirme Kromatografi dayalı bir özel amino asit analiz sistemi kullanılarak elde onların Renkölçer algılama.
   1. Bir başvuru çözüm 200 µL tarafsız ve asidik amino asitlerin ticari bir karışımı, 200 µL temel amino asitler ticari bir karışımı ve 2.5 mM glutamin 200 µL 200 mM lityum sitrat arabellek, pH 2.2 400 µL için ekleyerek hazırlayın. Bu kimyasal olarak tanımlanmış başvuru çözüm bir örnek olarak kabul edilir.
   2. 2.5 mM norleucine (iç standart) içeren % 25 (w/v) sulfosalicylic asit solüsyonu 200 µL 800 µL molekülleri ile yüksek moleküler ağırlık kaldırmak için örnek ekleyin. 4 ° C, santrifüj (3000 x g, 10 min, 4 ° C) ve 0,22-µm gözenek boyutu nitroselüloz membran (şırınga sistemi) filtreden 1 h için kuluçkaya.
   3. Programcı yazılım, katyon değişim sütun (lityum formu) ile donatılmış analyzer ile (LC) analizleri sıvı Kromatografi başlatmak için "Run" butonuna tıklayın. Amino asitler ile Counter iyonu konsantrasyonu sıcaklık değişimi (Tablo 2) ile birlikte bir pH degrade ve degrade oluşturmak için art arda gelen lityum tampon elute.
   4. 570, spektrofotometrik bir Dedektör tarafından ninhydrin derivatization sonra azotlu bileşikler ölçmek nm (mor rengi: amino asitler ninhydrin ve Amin grubu arasındaki reaksiyon) ve 440 nm (sarı rengi: ninhydrin ve aldehit grubu arasındaki reaksiyon prolin).
   5. Tek-noktaya iç kalibrasyon referans çözüm ve norleucine üreticinin yazılımını kullanarak örnekleri amino asitlerin konsantrasyonları hesaplamak için bir iç standart olarak kullanarak gerçekleştirin.

3. miktar Proteinogenic Amino asit

1. Kuru hücre kalınlığı ölçümü
   1. 10 mL kültürünün bir alüminyum Kupası, bir vakum cihazı kullanarak önceden asılı bir nitroselüloz filtre (gözenek boyutu 0.45 µm) filtre. İki kez 50 mL distile su yıkayın.
   2. Filtre alüminyum Kupası'na yerleştirin ve filtre Kupası'nda reweighing önce 48 (ağırlık daha fazla bir değişiklik yok kutlanan kadar) h için 105 ° C ısı fırında kuru. Ağırlık farkı hesaplamak.
   3. Doğru Maya kültür kuru hücre ağırlığını belirlemek için bağımsız en az 3 ölçüm ortalamasını hesaplamak.
2. Miktar hücrelerin protein içeriğinin
   Not: Hücrelerin protein fraksiyonu miktar en az nüsha 1.3.2 bölümünde açıklandığı gibi elde edilmiştir etiketlenmemiş hücre topakları kullanarak gerçekleştirilir.
   1. Proteinler buna ek olarak 1 mL DMSO çözeltisi (% 50 v/v) tarafından dondurulmuş granül özü ve 105 ° c kuru sıcak fırında 1 saat için kuluçkaya.
   2. Cu⁺⁺ proteinlerin içine bicinchoninic asit mavi Kompleks (BCA tahlil) içinde daha fazla çöktürülmüş Cu⁺ iyonlar tarafından azaltılmasına dayanan biyokimyasal Renkölçer tahlil kullanarak DMSO özleri protein içeriğinde ölçmek.
3. Amino asitler proteinler içinde göreli katkılarıyla belirlenmesi
   Not: Profil proteinogenic amino asitlerin en az nüsha etiketlenmemiş hücre granül (1.3.2.) üzerinden belirlenir.
   1. Performic asit (%90 formik asit, % 10 hidrojen peroksit) 200 µL içinde hücre Pelet askıya tarafından okside ekstresi hazırlayın. 4 h 4 ° C'de için kuluçkaya ve reaksiyon 33.6 mg sodyum sülfat eklenmesi tarafından durdurmak.
      Not: Oksidasyon adım iyon değiştirme Kromatografi tarafından sayısal daha fazla metiyonin sulfone ve cysteic asit, sistein ve metionin dönüştürmek için gereklidir. Ancak, bazı amino asitler (tirozin, fenilalanin, histidin ve arginin) oksidasyon tedavi sırasında denatüre. Sonuç olarak, iki hidrolizatlarının (ve oksidasyon olmadan) hazırlanır.
   2. 6N HCL 800 µL hücre topakları eklemek veya okside özü ve örnek bir hermetik kapatılmış cam tüp 16 h 110 ° c kuru sıcak fırında için kuluçkaya. 2.5 mM norleucine 200 µL ekleyin ve HCl azot bir akışı ile kaldırın. (Kurutulmuş özü resuspending ve sıvı azot akışı kaldırma) ve daha sonra 800 µL etanol ile iki kez 800 µL distile su ile yıkayın. 200 mM lityum asetat arabellek, pH 2.2 800 µL içinde hallet.
      Not: bazı amino asitler asitli koşullarda kararlı değil gibi dikkat hidroliz kuluçka süresine ödenmesi gerekmektedir. Bu amino asit HCl hidroliz sırasında tamamen denatüre gibi protein triptofan kesir Edebiyat '¹⁶, bulundu verilerinden tahmin edilmektedir.
   3. Bir hidrolizat standart tek-noktaya iç kalibrasyon için hazırlayın. Amino asitlerin hidrolize ticari bir çözümün 160 µL 200 mM lityum asetat arabellek, 625 µM metiyonin sulfone, 625 µM cysteic asit ve 625 µM norleucine içeren pH 2.2, 840 µL için ekleyin.
   4. Amino asitler proteinler 2.2 bölümünde açıklanan Kromatografik yöntemle içinde göreli konsantrasyonları belirlemek.
4. Hesaplamalar
   1. Her amino asit proteinlerde ağırlık yüzdesi her amino asit (mg/L) ölçülen miktarı bölerek amino asit protein özü (mg/L Özetle) ölçülen toplam miktarı hesaplamak.
   2. Bu yüzde konsantrasyon (mg/L) kültür, Yani, biyokütle protein içeriği ve konsantrasyon (mg/L) kültüründe her proteinogenic amino asitin değerlendirmek için Kuru ağırlığı arasında ürün proteinlerin tarafından çarpın.

4. Proteinogenic Amino asitlerin izotopik zenginleştirme ölçümü

Not: proteinogenic amino asitlerin izotopik zenginleştirme ölçüm için etiketli hücre topakları kullanın. Üç farklı ajanlar için derivatization adım amino asitlerin izotopik zenginleştirme ölçmek için kullanılır. Küme iyonları yoğunluklarda amino asitler etiketleme şekillerinin tahmin etmek için ölçülür. Her küme iyon sinyalini kitle isotopomers bereket için karşılık gelen (m₀ etiketleme olmadan, m_{+ 1} = 1 etiketli atom, =...) bir amino asit parçasının. DMADMF işlem sonrası elde edilen bir Kromatografik örneği Şekil 2' de verilmiştir.

1. Biyokütle hidroliz
   1. 1.2 mL 6 M HCL ekleyerek ve örnek bir kuru ısı fırın sıkıca kapalı cam tüplerde 105 ° C'de 16 h için kuluçka (1-2 mg kurutulmuş biyokütle karşılık gelen) hücre topakları hidrolize.
   2. 1.2 mL distile su ve santrifüj 3000 x g hücresel enkaz kaldırmak 5 min için ekleyin. Süpernatant altı 400 µL kesirler açık cam tüpler içine dağıtmak. Onlar şurubu (4-5 h) tutarlılığını ulaşana kadar kesirler 105 ° C ısı fırında kuru.
2. Ethylchloroformate (ECF) derivatization
   1. 20 mm HCl 200 µL kurutulmuş hidrolizat dağıtılması; daha sonra pyridine: etanol (1:4) 133 µL ekleyin. ECF amino asitler derivatize ve tüm CO₂ serbest kadar beklemek için 50 µL ekleyin. Derivatized bileşikleri ayıklamak için diklorometan 500 µL içeren tüpler santrifüj kapasitesi karışımı aktarın.
   2. Girdap 10 s ve santrifüj tüpleri 10.000 x g; de 4 dk için onlara Böylece örnekleri doğrudan GC/MS araç enjekte konik cam ekler içeren GC şişeleri için daha düşük organik faz Pasteur damlalıklı ve transferi ile toplanır.
3. (N, N)-Dimethylformamide Dimetil asetal (DMFDMA) derivatization.
   1. Metanol 50 µL ve Asetonitril 200 µL kurutulmuş hidrolizat geçiyoruz. DMFDMA 300 µL ekleyin. Girdap tüp ve transfer konik cam ekler içeren sulandırıldığında GC otomatik örnekleyici için örnekler.
4. N, O-Bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamide (BSTFA) derivatization
   1. Hidrolizat Asetonitril 200 µL içinde askıya alma. Cam tüp sıkıca kapatın ve özü doğrudan GC şişeleri aktarmadan önce 4 h 135 ° c için kuluçkaya BSTFA 200 µL ekleyin.
5. GC-MS analizi
   1. Bir Otomatik Örnekleyici enjektör ile donatılmış ve bir Kütle Spektrometre birleştiğinde bir gaz Kromatograf örnekleriyle analiz.
      1. Araç kontrol etmek ve chromatograms analiz aracı özel yazılımı kullanın. "Sequence" menüsünde, "Örnek günlük örnek liste oluşturmak için tablo"'ı tıklatın ve enjeksiyonları başlatmak için "Çalıştır" düğmesini tıklatın.
         Not: Gaz Kromatograf bir 30 m x 0,25 mm apolar silika Kapiler sütun 0.15 mikron film kalınlığı ile donatılmıştır. 150 ° C'de Kütle Spektrometre quadrupole sıcaklığı ayarlamak ve transfer satırı 250 ° c tüm analizleri için basılı tutun. Üç analitik programları, her bir özel her derivatization aracı için kullanılır.
      2. ECF türevleri: 230 ° C ve bu 250 ° C'de kaynağının giriş sıcaklık kullanım helyum 1.2 mL/dak bir akış ile mobil faz olarak ayarlayın Örnekleri 1 µL split oranı 3:1 ile enjekte etmek için Otomatik Örnekleyici programı. Aşağıdaki gibi Fırın Sıcaklık yavaş yavaş artan analizleri, çalıştırın: 130 ° C 3 dakika; Degrade 15 ° C/dk 260 ° c; sıcaklık 20 dk için 260 ° C'de muhafaza.
      3. DMFDMA türevleri: 230 ° C ve bu 250 ° C'de kaynağının giriş sıcaklık kullanım helyum 1.2 mL/dak sürekli bir akış ile mobil faz olarak ayarlayın Örnekleri 1 µL split oranı 3:1 ile enjekte etmek için Otomatik Örnekleyici programı. Aşağıdaki gibi Fırın Sıcaklık yavaş yavaş artan analizleri, çalıştırın: 60 ° C için 1 dk; Degrade 20 ° C/dk 130 ° c; İkinci gradyan 4 ° C/dk 260 ° c; Sıcaklık 10 min için 260 ° C'de muhafaza.
      4. BSTFA türevleri: 275 ° C ve bu 300 ° C'de kaynağının giriş sıcaklık kullanım helyum 1.2 mL/dak sürekli bir akış ile mobil faz olarak ayarlayın Analizleri çalıştırmak (enjeksiyon: 1 µL), yavaş yavaş aşağıdaki gibi fırın sıcaklığı artan: 110 ° C için 1 dk; ilk gradyan 2 ° C/dk 154 ° c; İkinci gradyan 5 ° C/dk ila 300 ° C; Sıcaklık 10 min için 300 ° C'de muhafaza.
      5. Algılama yordamı: Derivatization her modu, bir örnek (1 µL) pozitif elektron etkisi iyonlaşma 70 eV, tarama modunda enjekte ve tutma zamanı her amino asitin dikkat ediniz.
      6. Zaman pencereleri Kromatografik boyunca tanımlamak için bu değerler kullanın ve her amino asitin karakteristik ve Tablo 3' te listelenen farklı seçili iyonları için olan; Bu değerler her amino asit için dahil edilmelidir. Bu bilgiler SIM algılama programa ekleyin ve analizleri pozitif elektron etkisi iyonlaşma 70 eV, SIM modunda çalıştırmak.
   2. Analizlerin sonuçlarını toplamak; Yani, her amino asit için farklı onun kitle isotopomers kümesine karşılık gelen yoğunluklarını kaydedin. Doğal etiketleme için düzeltmek ve proteinogenic amino asitler (protein onun toplam tutarı ile ilgili olarak bir amino asitin etiketli kesir olarak tanımlanmış izotopik zenginleştirme hesaplamak için dedicatedsoftware¹⁷ kullanarak verileri işlemek örnekleri).
      Not: Bir molekül izotopik zenginleştirme (yani), yüzde ifade edilen, kitle isotopomers etiketleme ile düzeltilmiş yoğunluklarda toplamı bölen hesaplanır (m₁, m₂,.. anladım_n) düzeltilmiş toplamına kitle isotopomers yoğunluklarda (m₀, m₁, m₂,... m_n):
      I. E. = (m₁ + m₂ +... + m_n) / (m₀ + m₁+ m₂ +... + m_n)

5. miktar ve uçucu bileşiklerin izotopik zenginleştirme

1. Etiketli uçucu bileşikler çıkarımı
   1. Deuterated iç standartların 10 µL süpernatant için 5 mL ekleyin (deuterated bileşiklerin son konsantrasyonu: 100 µg/L) 15 mL cam tüp içinde. Diklorometan 1 mL ekleyin, sıkıca tüpler kapatın ve 20 dakika santrifüj 3000 x g de 5 dk süreyle sallanan bir platformda sallamak ve 15 mL cam tüp organik alt aşamasında toplamak. Diklorometan ayıklama yineleyin.
   2. Organik özü üzerinde 500 mg susuz sodyum sülfatın kuru ve sıvı faz Pasteur damlalıklı ile toplamak. Dört azot akı altında bir faktörle özü konsantre ve GC otomatik örnekleyici şişe aktar.
2. GC-MS miktar uçucu bileşiklerin
   1. Bir 30 m x 0,25 mm erimiş silis kapiller sütunla gaz Kromatograf 0,25 mikron film kalınlığı ile donatmak ve enjektör ve transfer satırı 250 ° C'de sabit helyum akışı 1.0 mL/dk. tutun, uygulama
   2. Örnek 2 µL split oranı 10:1 ile enjekte ve ayıklanan uçucu moleküllerin aşağıdaki Fırın Sıcaklık profili kullanarak ayrı: 40 ° C'de 3 dk için sıcaklık tutun, 4 ° C/min tarafından artış 220 ° C'ye kadar ve sonra 20 dk bekleyin 220 ° C fırında.
   3. 230 ° C ve 150 ° C'de ayarla Kütle Spektrometre quadrupole sıcaklık ayarlanan kaynak sıcaklık ile bir Kütle Spektrometre kullanarak bileşikler tespit Kitle spectra ile pozitif elektron etkisi iyonlaşma 70 eV ve Tablo 4' te rapor edilen uçucu bileşikler için belirli iyon kümelerini kullanarak seçili iyon izleme (SIM) modunda kaydedin.
   4. Bir dış 7-nokta kalibrasyon yoğunluklarda karşılık gelen iyon kümesinin toplamı üzerinden uçucu moleküllerin konsantrasyonları ölçmek için kullanın. Hisse senedi çözümler her bileşik (10 g/M) % 100 etanol hazırlayın. O zaman, standart çözümler hisse senedi çözümleri karıştırılarak uçucu moleküllerin (etil esterler, asetatlar, alkoller ve asitler) her sınıf için hazır olun. Son olarak, bir % 12 hydroalcoholic çözüm pH kalibrasyon çözüm hazırlamak için 3,3 düzeltilmiş ile 5 g/L tartarik asit içeren standart çözümlerinde farklı miktarlarda oranında seyreltin.
   5. Paralel, doğal her iyon küme yoğunluklarını etiketleme için düzeltmek ve uçucu bileşiklerin molekülleri etiketli kesir olarak tanımlanmış ve özel yazılım kullanarak bir yüzde olarak ifade edilen izotopik zenginleştirme hesaplamak ¹⁷.

6. veri kümesi tümleşik bir analizini hesaplamalarını

1. Ham veri toplama
   1. Tablo 5, 6, 7 ve 8, gösterilen elektronik tablolarını kullanarak hücre dışı amino asit, hücre kuru ağırlığı, protein içeriği hücre, konsantrasyon uçucu moleküllerin ve izotopik konsantrasyonu için karşılık gelen ham veri değerleri girin proteinogenic amino asitler ve uçucu moleküllerin zenginleştirme.
      Not: tablolarda gösterilen veriler mM olarak ifade edilir. Tüm sonuçlar de mM değerleri ile molekül ağırlığı her molekül veya mg N/M tarafından atom ağırlığı azot proteinogenic amino asit millimolar konsantrasyonu çarparak çarparak mg/L ifade edilir (14 u) ve azot ato sayısına göre Bu molekül katabolizma tarafından sağlanan ms.
   2. Amino asitler (mg/L olarak bunların toplamı) toplam tutarı, tutar ın mg/L hidrolizat içinde bölünerek her amino asit proteinlerde kitle yüzdesini hesaplamak.
   3. Anlamına gelir, standart sapma ve standart hataları verilerden bağımsız deneylerde elde edilmiştir ortalamaya hesaplamak.
   4. Her amino asit proteinogenic konsantrasyon (mg/L) proteinler (mg aa/g protein) bu amino asit yüzdesi çarparak biyokütle (g protein/g DW) protein fraksiyonu ve kuru ağırlık içerik (biyokütle üretimi) tarafından içinde hesaplamak Orta (g DW/M).
2. ¹⁵ N izotopik izleyici deneyler
   1. Tablo 9' da sunulan elektronik tablolarını kullanarak hesaplamak proteinogenic amino asitler (mg N/M ifade) onların toplam konsantrasyon (mg N/M ifade) üzerinden mevcut etiketli ve etiketsiz kesirler azot ve onların izotopik enrichments. Her amino asit için etiketli kesir onun toplam konsantrasyon ve onun izotopik zenginleştirme arasında ürün karşılık gelir ve etiketsiz bölümü toplam etiketli tutarları arasındaki farktır.
   2. O zaman, proteinler (mg içinde N/M) Ala, Gly, Val, Asp, Phe, Leyi, Ile, Thr, Ser, Pro, Lys toplam miktarı, onun, Glu ve Arg özetliyor ve toplam bölen bu çalışmada sayısal proteinogenic amino asitler içeren toplam azot kısmını belirlemek bir Bu miktar tarafından proteinler arasında bulunan azot monte edin.
   3. Arginin, glutamin veya proteinogenic amino asit (Ala, Gly, Val, Asp, çalışmada sayılabilir (içinde mg N/M) kesir etiketli toplayarak bu çalışmada sayısal proteinogenic asitler kurtarıldı amonyum tarafından sağlanan azot hesaplamak Phe, Leyi, Ile, Thr, Ser, Pro, Lys, onun, Glu ve Arg) ¹⁵N etiketli arginin, glutamin, veya amonyum ve azot quantified proteinogenic amino toplam miktarı ile bu etiketli-azot kesir bölen huzurunda deneyler sırasında asitler.
   4. 3 en bol bulunan amino asitler de novo sentezi için ¹³C ve ¹⁵N izotop izleyici deneyler (elektronik tabloda Tablo 7) veri birleştirerek kullanılan azot hücre içi havuzuna katkısı değerlendirmek.
   5. Tüketilen bileşikler (¹³C deneyler) doğrudan birleşme ve azot 3 kullanarak de novo synthetized yapıldı kesiminde elde edilen bölümü (mM ifade) toplam tutarı proteinogenic Val, Leyi, Ile veya Thr, düşeriz diğer amino asitler azot kullanarak de novo synthetized yapıldı kesir değerlendirmek için büyük kaynaklar.
   6. Sonra amino asit de novo synthetized azot proteinogenic amino asitler (mM) cinsinden toplam tutarı için Gln, Arg ve NH₄⁺ (mM olarak ifade edilen toplam) tarafından sağlanan kullanarak miktarı oranını hesaplamak katkısını ölçmek için arginin, glutamin ve amonyum hücre içi azot havuzuna.
3. ¹³ C izotopik izleyici deneyler
   1. MM ve ¹³C harfiyle Ley, Val huzurunda deneyler sırasında elde edilmiştir proteinogenic amino asitlerin izotopik enrichments ifade konsantrasyonları proteinogenic amino asitlerden etiketli ve etiketsiz kesirler hesaplama, Ile veya Thr. (bkz: 6.2.1, Tablo 10).
   2. Etiketli ve etiketsiz kesirler konsantrasyonları mM ve ¹³C harfiyle Ley, Val, Ile veya Thr ( huzurunda deneyler sırasında elde edilen uçucu bileşiklerin izotopik enrichments ifade edilen uçucu bileşiklerin hesaplamak Tablo 10).

Sonuçlar

Şekil 3 şematik diyagramı yönetimi araştırmak için maya şarap fermantasyon sırasında bulunan birden fazla azot kaynakları tarafından uygulanan iş akışı sunar.
Örnekleme, biyolojik parametreler-büyüme özellikleri, azot tüketim kalıpları ve gösterinin proteinogenic amino asitler – fermentations (şekil 4) arasında yüksek bir tekrarlanabilirlik profil farklı noktaları için. Bu tutarlılık 14 bağı...

Tartışmalar

Bileşikler metabolik ağlarına izotopik izleyici deneyler kullanarak bölümleme miktarının mikrobiyal metabolizma işleyişini anlamak için umut verici bir yaklaşımdır. Bu yöntemi başarıyla uygulanan bir ya da iki etiketli yüzeyler ile iken şu anda birden çok etiketli elemental izotoplar (Yani, birden fazla iki yüzeylerde) kullanarak çeşitli kaynaklardan metabolizma çalışmaya uygulanması olamaz. Nitekim, mevcut analitik teknikler etiketleme desenleri proteinogenic amino asitler ve moleküll...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
D-Glucose	PanReac	141341.0416
D-Fructose	PanReac	142728.0416
DL-Malic acid	Sigma Aldrich	M0875
Citric acid monohydrate	Sigma Aldrich	C7129
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P5379
Potassium sulfate	Sigma Aldrich	P0772
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	230391
Calcium chloride dihydrate	Sigma Aldrich	C7902
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S9625
Ammonium chloride	Sigma Aldrich	A4514
Sodium hydroxide	Sigma Aldrich	71690
Manganese sulfate monohydrate	Sigma Aldrich	M7634
Zinc sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	Z4750
Copper (II) sulfate pentahydrate	Sigma Aldrich	C7631
Potassium iodine	Sigma Aldrich	P4286
Cobalt (II) chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	C3169
Boric acid	Sigma Aldrich	B7660
Ammonium heptamolybdate	Sigma Aldrich	A7302
Myo-inositol	Sigma Aldrich	I5125
D-Pantothenic acid hemicalcium salt	Sigma Aldrich	21210
Thiamine, hydrochloride	Sigma Aldrich	T4625
Nicotinic acid	Sigma Aldrich	N4126
Pyridoxine	Sigma Aldrich	P5669
Biotine	Sigma Aldrich	B4501
Ergostérol	Sigma Aldrich	E6510
Tween 80	Sigma Aldrich	P1754
Ethanol absolute	VWR Chemicals	101074F
Iron (III) chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	236489
L-Aspartic acid	Sigma Aldrich	A9256
L-Glutamic acid	Sigma Aldrich	G1251
L-Alanine	Sigma Aldrich	A7627
L-Arginine	Sigma Aldrich	A5006
L-Cysteine	Sigma Aldrich	C7352
L-Glutamine	Sigma Aldrich	G3126
Glycine	Sigma Aldrich	G7126
L-Histidine	Sigma Aldrich	H8000
L-Isoleucine	Sigma Aldrich	I2752
L-Leucine	Sigma Aldrich	L8000
L-Lysine	Sigma Aldrich	L5501
L-Methionine	Sigma Aldrich	M9625
L-Phenylalanine	Sigma Aldrich	P2126
L-Proline	Sigma Aldrich	P0380
L-Serine	Sigma Aldrich	S4500
L-Threonine	Sigma Aldrich	T8625
L-Tryptophane	Sigma Aldrich	T0254
L-Tyrosine	Sigma Aldrich	T3754
L-Valine	Sigma Aldrich	V0500
13C5-L-Valine	Eurisotop	CLM-2249-H-0.25
13C6-L-Leucine	Eurisotop	CLM-2262-H-0.25
15N-Ammonium chloride	Eurisotop	NLM-467-1
ALPHA-15N-L-Glutamine	Eurisotop	NLM-1016-1
U-15N4-L-Arginine	Eurisotop	NLM-396-PK
Ethyl acetate	Sigma Aldrich	270989
Ethyl propanoate	Sigma Aldrich	112305
Ethyl 2-methylpropanoate	Sigma Aldrich	246085
Ethyl butanoate	Sigma Aldrich	E15701
Ethyl 2-methylbutanoate	Sigma Aldrich	306886
Ethyl 3-methylbutanoate	Sigma Aldrich	8.08541.0250
Ethyl hexanoate	Sigma Aldrich	148962
Ethyl octanoate	Sigma Aldrich	W244910
Ethyl decanoate	Sigma Aldrich	W243205
Ethyl dodecanoate	Sigma Aldrich	W244112
Ethyl lactate	Sigma Aldrich	W244015
Diethyl succinate	Sigma Aldrich	W237701
2-methylpropyl acetate	Sigma Aldrich	W217514
2-methylbutyl acetate	Sigma Aldrich	W364401
3-methyl butyl acetate	Sigma Aldrich	287725
2-phenylethyl acetate	Sigma Aldrich	290580
2-methylpropanol	Sigma Aldrich	294829
2-methylbutanol	Sigma Aldrich	133051
3-methylbutanol	Sigma Aldrich	309435
Hexanol	Sigma Aldrich	128570
2-phenylethanol	Sigma Aldrich	77861
Propanoic acid	Sigma Aldrich	94425
Butanoic acid	Sigma Aldrich	19215
2-methylpropanoic acid	Sigma Aldrich	58360
2-methylbutanoic acid	Sigma Aldrich	193070
3-methylbutanoic acid	Sigma Aldrich	W310212
Hexanoic acid	Sigma Aldrich	153745
Octanoic acid	Sigma Aldrich	W279900
Decanoic acid	Sigma Aldrich	W236403
Dodecanoic acid	Sigma Aldrich	L556
Fermentor 1L	Legallais	AT1357	Fermenter handmade for fermentation
Disposable vacuum filtration system	Dominique Deutscher	029311
Fermenters (250 ml)	Legallais	AT1352	Fermenter handmade for fermentation
Sterile tubes	Sarstedt	62.554.502
Fermentation locks	Legallais	AT1356	Fermetation locks handmade for fermentation
BactoYeast Extract	Becton, Dickinson and Company	212750
BactoPeptone	Becton, Dickinson and Company	211677
Incubator shaker	Infors HT
Particle Counter	Beckman Coulter	6605697	Multisizer 3 Coulter Counter
Centrifuge	Jouan		GR412
Plate Butler Robotic system	Lab Services BV	PF0X-MA	Automatic instrument
Plate Butler Software	Lab Services BV		Robot monitor software
RobView			In-house developed calculation software
My SQL			International source database
Cimarec i Telesystem Multipoint Stirrers	Thermo Fisher Scientific	50088009	String Drive 60
BenchBlotter platform rocker	Dutscher	60903
Ammonia enzymatic kit	R-Biopharm AG	5390
Spectrophotometer cuvettes	VWR	634-0678
Spectrophotometer UviLine 9400	Secomam
Amino acids standards physiological - acidics and neutrals	Sigma Aldrich	A6407
Amino acids standards physiological - basics	Sigma Aldrich	A6282
Citrate lithium buffers - Ultra ninhydrin reagent	Biochrom	BC80-6000-06
Sulfosalycilic acid	Sigma Aldrich	S2130
Norleucine	Sigma Aldrich	N1398
Biochrom 30 AAA	Biochrom
EZChrom Elite	Biochrom		Instrument control and Data analysis software
Ultropac 8 resin Lithium	Biochrom	BC80-6002-47	Lithium High Resolution Physiological Column
Filter Millex GV	Merck Millipore	SLGVX13NL	Millex GV 13mm (pore size 0.22 µm)
Membrane filter PALL	VWR	514-4157	Supor-450 47mm 0.45µm
Vacuum pump Millivac Mini	Millipore	XF5423050
Aluminium smooth weigh dish 70mm	VWR	611-1380
Precision balance	Mettler		Specifications AE163
Dimethyl sulfoxid dried	Merck	1029310161	(max. 0.025% H2O) SeccoSolv
Combustion oven	Legallais
Pierce BCA protein assay kit	Interchim	UP40840A
Formic acid	Fluka	94318
Hydrogen peroxide	Sigma Aldrich	H1009
Hydrochloric Acid Fuming 37% Emsure	Merck	1003171000	Grade ACS,ISO,Reag. Ph Eur
Lithium acetate buffer	Biochrom	80-2038-10
Commercial solution of hydrolyzed amino acids	Sigma Aldrich	AAS18
L-Methionine sulfone	Sigma Aldrich	M0876
L-Cysteic acid monohydrate	Sigma Aldrich	30170
Pyrex glass culture tubes	Sigma Aldrich	Z653586
Pyridine	Acros Organics	131780500	99% Extrapure
Ethyl chloroformate	Sigma Aldrich	23131
Dichloromethane	Sigma Aldrich	32222
Vials	Sigma Aldrich	854165
Microinserts for 1.5ml vials	Sigma Aldrich	SU860066
GC/MS	Agilent Technologies	5890 GC/5973 MS
Chemstation	Agilent Technologies		Instrument control and data analysis software
Methanol	Sigma Aldrich	34860	Chromasolv, for HPLC
Acetonitrile	Sigma Aldrich	34998	ChromasolvPlus, for HPLC
N,N-Dimethylformamide dimethyl acetal	Sigma Aldrich	394963
BSTFA	Sigma Aldrich	33024
DB-17MS column	Agilent Technologies	122-4731	30m*0.25mm*0.15µm
Sodium sulfate, anhydrous	Sigma Aldrich	238597
Technical nitrogen	Air products	14629
Zebron ZB-WAX column	Phenomenex	7HG-G007-11	30m*0.25mm*0.25µm
Helium BIP	Air products	26699
Glass Pasteur pipettes	VWR	612-1702