Workflow basiert auf der Kombination der isotopischen Tracer Experimente zu untersuchen, mikrobiellen Stoffwechsel von mehreren Nährstoffquellen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein experimentelles Verfahren, um den Stoffwechsel von mehreren Nährstoffquellen quantitativ und umfassend zu untersuchen. Dieser Workflow, basierend auf einer Kombination von isotopischen Tracer Experimente und ein Analyseverfahren ermöglicht das Schicksal der konsumierten Nährstoffe und die metabolische Herkunft der Moleküle können durch Mikroorganismen bestimmt werden.

Zusammenfassung

Studien auf dem Gebiet der Mikrobiologie verlassen sich auf die Umsetzung einer Vielzahl von Methoden. Insbesondere trägt die Entwicklung geeigneter Methoden wesentlich zur bietet umfangreiche Kenntnisse des Stoffwechsels von Mikroorganismen in chemisch definierten Medien mit einzigartigen Stickstoff und Kohlenstoffquellen wachsen. Im Gegensatz dazu bleibt die Verwaltung durch den Stoffwechsel von mehreren Nährstoffquellen, trotz ihrer breite Präsenz in natürlichen oder industriellen Bereichen nahezu unerforscht. Diese Situation ist vor allem der Mangel an geeigneten Methoden, der Ermittlungen zu behindern.

Wir berichten über eine experimentelle Strategie, quantitativ und umfassend zu erforschen wie Stoffwechsel funktioniert, wenn eine Nährstoff als eine Mischung aus verschiedenen Moleküle, d. h., eine komplexe Ressource bereitgestellt wird. Hier beschreiben wir die Anwendung für die Beurteilung der Partitionierung von mehreren Quellen von Stickstoff durch die Hefe metabolischen Netzwerkes. Der Workflow kombiniert bei stabiler Isotope Tracers Experimente mit ausgewählten ¹³C- oder ¹⁵N-markierten Substraten. Es besteht zunächst parallel und reproduzierbare Fermentationen in demselben Medium, beinhaltet eine Mischung aus N-haltige Moleküle; ausgewählten Stickstoffquelle ist jedoch jedes Mal beschriftet. Eine Kombination von analytischen Verfahren (HPLC, GC-MS) erfolgt die Kennzeichnung Muster gezielt Verbindungen zu bewerten und den Verbrauch und die Wiederherstellung von Substraten in anderen Metaboliten zu quantifizieren. Eine integrierte Analyse des kompletten Datensatzes gibt einen Überblick über das Schicksal der verbrauchten Substrate innerhalb der Zellen. Dieser Ansatz erfordert eine genaueste Protokoll für die Sammlung von Proben – erleichtert durch ein Roboter-gestützte System zur Online-Überwachung von Fermentationen – und die Erreichung der zahlreichen zeitaufwendige Analysen. Trotz dieser Einschränkungen erlaubt es, Verständnis, zum ersten Mal die Partitionierung von mehreren Quellen von Stickstoff in der Hefe metabolischen Netzwerkes. Wir aufgeklärt die Umverteilung von Stickstoff aus reichlicher Quellen gegenüber anderen N-Verbindungen und die metabolische Ursprünge des flüchtigen Molekülen und proteinogene Aminosäuren bestimmt.

Einleitung

Verständnis wie mikrobiellen Stoffwechsel funktioniert, ist ein zentrales Thema für die Gestaltung von effizienten Strategien zur Gärungsprozesse zu verbessern und die Produktion von fermentativen Verbindungen zu modulieren. Fortschritte in der Genomik und funktionelle Genomik in den letzten zwei Jahrzehnten weitgehend zur Erweiterung der Kenntnisse über die Topologie des metabolischen Netze in vielen Mikroorganismen beigetragen. Zugang zu diesen Informationen führten zu die Entwicklung von Konzepten, die für einen umfassenden Überblick über die Zellfunktionen¹abzielen. Diese Methoden setzen häufig auf eine modellbasierte Interpretation von messbaren Parametern. Diese experimentellen Daten beinhalten einerseits Metabolit Aufnahme und Produktion Preise und auf der anderen Seite quantitative intrazellulärer Informationen, der von Isotop Tracer vorliegt Experimente. Diese Daten liefern wichtige Informationen für den Abzug von der in-Vivo -Aktivität der verschiedenen Bahnen in einem definierten metabolischen Netzwerkes^2,3,4. Derzeit verfügbaren analytische Techniken ermöglichen nur die präzise Erkennung von Mustern von Molekülen beschriften, wenn ein Single-Element-Isotop mit und eventuell bei der Beschriftung mit zwei Isotopen Elementen zusammen. Darüber hinaus unter den meisten Wachstumsbedingungen besteht die Kohlenstoffquelle nur aus ein oder zwei Verbindungen. Infolgedessen wurden Ansätze beruhen auf ¹³C-isotopischen Tracer aus Kohlenstoff Substraten weit verbreitet und erfolgreich eingesetzt, um entwickeln ein umfassendes Verständnis der Kohlenstoff metabolischen Netzwerkes Operationen^{5,6,7 ,8}.

Im Gegensatz dazu in vielen natürlichen und industriellen Umgebungen, die verfügbarer Stickstoff-Ressource, die mikrobielles Wachstum unterstützt oft eine Vielzahl von Molekülen besteht aus. Zum Beispiel wird während der Gärung von Wein oder Bier, Stickstoff als eine Mischung aus 18 Aminosäuren und Ammonium bei variablen Konzentrationen⁹bereitgestellt. Dieses Array von N-Verbindungen, die zugänglich für Anabolismus sind macht diese komplexe Medien Bedingungen erheblich unterscheiden sich von denen üblicherweise für physiologische Untersuchungen, wie Letzteres erreicht werden mit einer einzigartigen Quelle von Stickstoff, in der Regel Ammonium.

Alles in allem verinnerlicht Stickstoff Verbindungen können direkt integriert in Proteine oder catabolized. Die Netzwerkstruktur des Stickstoff-Stoffwechsels in vielen Mikroorganismen, einschließlich der Hefe Saccharomyces Cerevisiae, ist sehr komplex, im Einklang mit der Vielfalt von Substraten. Schematisch, basiert dieses System auf die Kombination von den zentralen Kern des Stickstoff-Stoffwechsels fußenden von Glutamin, Glutamat und α-Ketoglutarate^10,11, Transaminasen und Deaminases katalysiert. Durch dieses Netzwerk Amin Gruppen aus Ammonium oder anderen Aminosäuren werden gesammelt und α-Keto-Säuren freigesetzt. Diese Zwischenprodukte sind auch dazu durch zentralen Kohlenstoff-Stoffwechsel (CCM)^12,13. Diese große Anzahl von verzweigten Reaktionen und Zwischenprodukte, beteiligt, der Abbau von exogenen Stickstoff Quellen und Anabolismus proteinogene Aminosäuren, erfüllt die anabole Anforderungen der Zellen. Die Aktivität durch diese miteinander verbundenen Routen führt auch die Ausscheidung von Stoffwechselprodukten. Insbesondere können α-Keto-Säuren umgeleitet werden, durch die Ehrlich Weg, höhere Alkohole und ihre Acetat Ester Derivate¹⁴, die wesentliche Mitwirkende zu den sensorischen Profile von Produkten sind zu produzieren. Anschließend spielt Funktionsweise Stickstoff-Stoffwechsel eine Schlüsselrolle bei der Erzeugung von Biomasse und die Bildung von flüchtigen Molekülen (Aroma).

Die Reaktionen, Enzyme und Genen, die im Stickstoff-Stoffwechsel sind in der Literatur ausführlich beschrieben. Jedoch ist die Frage der Verteilung von mehreren Quellen von Stickstoff in einem metabolischen Netzwerk noch nicht angesprochen worden. Es gibt zwei Hauptgründe, die erklären, dieser Mangel an Informationen. Zunächst wichtig angesichts der Stickstoff-Stoffwechsel-Netzwerk, eine große Menge von quantitativen Daten ist erforderlich für ein umfassendes Verständnis ihrer Tätigkeit, die nicht verfügbar war bis jetzt. Zweitens viele experimentelle Einschränkungen und Grenzen der analytischen Methoden verhindert die Umsetzung von Ansätzen, die zuvor für die Aufklärung der CCM-Funktion verwendet wurden.

Um diese Probleme zu überwinden, haben wir einen System-Ebenen-Ansatz zu entwickeln, der auf die Vereinbarkeit von Daten aus einer Reihe von isotopischen Tracer Experimenten basiert. Der Workflow enthält:
-Eine Reihe von Fermentationen durchgeführt, unter gleichen Umweltbedingungen, während eine andere ausgewählte Nährstoffe-Quelle (Substrat) jeweils gekennzeichnet ist.
-Eine Kombination von analytischen Verfahren (HPLC, GC-MS) für eine genaue Bestimmung, in verschiedenen Stadien der Gärung Restkonzentration von beschrifteten Substrat und die Konzentration und die Isotopen Anreicherung von Verbindungen, die von abgeleitet werden der Katabolismus der beschrifteten Molekül, einschließlich abgeleitete Biomasse.
-Eine Berechnung der Masse und Isotopen Waage für jede verbrauchte beschrifteten Molekül und eine weitere integrierte Analyse des Datasets, einen globalen Überblick über die Verwaltung von mehreren Nährstoffquellen durch Mikroorganismen durch die Bestimmung der Flux-Verhältnisse zu erhalten .

Um diese Methode anzuwenden, muss das reproduzierbare Verhalten des Stamm/Mikroorganismus zwischen den Kulturen Aufmerksamkeit geschenkt werden. Darüber hinaus müssen Proben aus verschiedenen Kulturen während der gleichen wohldefinierte Gärung Fortschritt entnommen werden. In der experimentellen Arbeit berichtet in dieser Handschrift dient ein Roboter-gestützte System zur Online-Überwachung von Fermentationen, um diese Einschränkungen zu berücksichtigen.

Darüber hinaus ist es wichtig, eine Reihe von beschrifteten Substrate (Verbindung, Natur und Position der Beschriftung) zu wählen, die an die wissenschaftliche Fragestellung der Studie geeignet ist. Hier wurden ¹⁵N beschriftet Ammonium, Glutamin und Arginin als die drei wichtigsten Stickstoff Quellen gefunden in Traubensaft ausgewählt. Dies ermöglichte es bewerten das Muster der Stickstoff Umverteilung von verbrauchten Verbindungen zu den proteinogene Aminosäuren. Wir wollten auch das Schicksal des Kohlenstoff-Backbones der verbrauchten Aminosäuren und deren Beitrag zur Produktion von flüchtigen Moleküle zu untersuchen. Um zu erreichen dieses Ziel, einheitlich ¹³C beschriftet Leucin, Isoleucin, Threonin und Valin in der Studie als Aminosäuren gehörten, die wichtige Zwischenprodukte des Ehrlich-Signalwegs abgeleitet sind.

Alles in allem, erkundeten wir quantitativ wie Hefe eine komplexe Stickstoff-Ressource verwaltet, durch eine exogene Stickstoff Quellen zur Erfüllung seiner anabolen Anforderungen während der Gärung beim zusätzlich entfernen das überschüssige Kohlenstoff Grundstoffe als Umverteilung flüchtige Moleküle. Die Versuchsdurchführung berichtet in diesem Papier kann angewendet werden, um andere mehrere Nährstoffquellen verwendet von anderen Mikroorganismus zu untersuchen. Es scheint ein geeigneter Ansatz für die Analyse der Auswirkungen der genetischen Hintergrund oder Umweltbedingungen auf die metabolischen Verhalten der Mikroorganismen zu sein.

Protokoll

1. Gärung und Probenahme

1. Erstellung von Medien und Fermenter
   Hinweis: Alle die Fermentationen sind parallel mit dem gleichen Stamm und durchgeführt in der gleichen chemisch definiert synthetisches Medium (SM, Zusammensetzung, die in Tabelle 1zur Verfügung gestellt), die enthält einer Mischungaus aus Ammonium und Aminosäuren als Stickstoff¹⁵Quellen. Für jede Gärung erfolgt eine einzelne Stickstoff-Verbindung ausschließlich in einem einheitlich beschrifteten ¹³C oder ¹⁵N Form (100 %), während die anderen unbeschriftet bleiben. Für jede beschriftete Stickstoffquelle, die in der Reihe von Experimenten verwendet wird (hier: ¹⁵NH₄, U -¹⁵N4-Arg, U -¹⁵N2-Gln, U -¹³C6-Leu, U -¹³C5-Val, U -¹³C6-Ile, U -¹³C4-Thr), zwei Fermenter werden vorbereitet. Für jede Kondition ist doppelte Gärung mit nur unbeschriftete Moleküle (7 Steuerung Fermentationen) durchgeführt.
   1. Für jede N-Quelle studiert werden, bereiten 500 mL SM beschriftet Medium, das alle Stickstoff-Quellen mit Ausnahme der Verbindung in 100 % verwendet werden in Tabelle 1aufgeführten enthält Form.
      Hinweis: Das beschriftete Molekül wird in den nächsten Schritten hinzugefügt.
   2. Pasteurisieren jedes Medium in eine 1 L Flasche (10 min., 100 ° C), enthält einen magnetischen Rührstab. Wiegen Sie die entsprechende Menge an beschrifteten Molekül, die letztendliche Konzentration zu erreichen, die in Tabelle 1 gemeldet wird und in dem Medium auflösen.
   3. Sterilisieren Sie das Medium mit einem Einweg-Vakuumfiltration System (Cellulose-Acetat-Membran, 0,22 µm). Mit einer sterilen Messzylinder, teilen Sie das Medium zwischen zwei vorsterilisierten Fermenter (250 mL), die enthalten einen magnetischen Rührstab und sind ausgestattet mit Gärung sperren zu vermeiden den Eintrag von Sauerstoff aber können die Freisetzung von CO₂.
   4. Erhitzen Sie die Gärung Kolben 28 ° c indem man sie in der Inkubation Zimmer für 1 Nacht (Temperatur bei 28 ° C).
2. Impfung und Überwachung von Fermentationen
   1. Wachsen Sie S. Cerevisiae -Stamm in sterilen Röhrchen mit 10 mL YPD Medium bei 28 ° C mit schütteln (150 u/min) für 12 h. Dann 1 mL der YPD Pipettieren preculture und überträgt es auf 10 mL SM Medium (15 mL steriles Röhrchen). Inkubieren Sie die Kultur für 12 h bei 28 ° C mit schütteln (150 u/min).
   2. Unter Laminar-Flow sammeln eine Vorkultur aliquoten und Quantifizierung der Zellpopulation, die mit einem elektronischen Partikelzähler, das mit einer 100 µm Blende ausgestattet ist. Zentrifugieren Sie der Vorkultur (2.000 x g, 15 min, 4 ° C) und hängen Sie das Pellet in einem entsprechenden Volumen von sterilem Wasser, eine Endkonzentration von 2,5 x 10⁸ Zellen/mL zu erhalten. Impfen Sie jedem Fermenter mit 1 mL Zellsuspension.
      Hinweis: Das Robot-System verwendet, um den Fortschritt der Gärung überwachen ist in Abbildung 1beschrieben.
   3. Bereiten Sie die Gärung-Plattform durch die Installation der Fermenter in den Support-Führern, die richtig auf die 21-Position rühren Platten gelegt und die mitreißende Rate bei 270 u/min eingestellt. Zum Starten der Online-Überwachung von jeder Gärung, starten Sie die Robotersteuerung Anwendung dann klicken Sie auf "Start-Assay" und wählen Sie das Volume Gärung (300 mL) durchgeführt werden.
   4. Die angezeigten-Schnittstelle erlaubt die Angabe der Anzahl und die Position der Fermenter auf der Plattform. Um sicherzustellen, dass dies der Fall ist, einen Rechtsklick auf die Slot-Position und wählen Sie "aktivieren" Aktivieren der Überwachung des Fermenters befindet sich an dieser Stelle.
   5. Initialisieren Sie die Berechnungssoftware, dauerhaft auf dem System ausgeführt, bevor Sie beginnen mit dem Gewicht. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Initialiser" und bestätigen Sie mit "Ok". Klicken Sie auf die Schaltfläche"Start" der Robotersteuerung Anwendung Gewicht Akquisitionen zu starten.
3. Stichprobenverfahren
   Hinweis: Für jede Fermenter werden Proben genommen wenn die CO₂ -Produktion (auf dem Computer mit der Berechnungssoftware online angezeigte Wert) den gewünschten Sollwert erreicht: 5, 10, 40 und 90 g/L in dieser Studie.
   1. Stichprobenverfahren für Kulturen mit beschrifteten Verbindungen.
      1. Zentrifugieren Sie zwei 6 mL Proben (2.000 x g, 5 min, 4 ° C). Speichern Sie und die gefrorenen Überstände in zwei Aliquote bei-80 ° C. Waschen Sie die Pellets zweimal mit 5 mL destilliertem Wasser und Store bei-80 ° C für die Messung von Isotopen Bereicherungen.
   2. Stichprobenverfahren für Kulturen ohne markierten Verbindungen
      1. Ernte 10 mL der Kultur, die für trockene Gewichtsermittlung verwendet wird. Pellet-die Zellen von zwei 10 mL Proben durch Zentrifugieren (2.000 x g, 5 min, 4 ° C). Die Pellets zweimal mit 10 mL destilliertem Wasser zu waschen und bei-80 ° C für die Bestimmung von Protein und Aminosäuren-Inhalte zu speichern.

2. Quantifizierung der verbrauchte Stickstoff Quellen

1. Enzymatische Bestimmung des restlichen Ammoniak-Konzentrationen
   Hinweis: Die Bestimmung des Ammoniak-Konzentration im Überstände erfolgt mit einem kommerziellen Enzymbasis Kit; alle Reagenzien sind vom Hersteller zur Verfügung gestellt.
   1. Bereiten Sie eine standard-Ammoniak-Lösung (61,4 mg/L) durch Auflösen von 25 mg genau gewogen (NH₄)₂SO₄ in einem 100 mL volumetrischen Kolben.
   2. Um den Anweisungen des Herstellers zu erfüllen, führen Sie eine 1:2 Verdünnung der Proben, die vor der Gärung und bei 5 g/L CO₂ freigesetzt wurden. Stellen Sie den pH-Wert der Proben bis ca. 8 durch Zugabe von 1 M KOH. Beachten Sie die zusätzlichen Volumen und bei den Verdünnungsfaktor berücksichtigen.
   3. In 4 mL Spektrofotometer Küvetten Mix 100 µL Probe (ggf. verdünnt), destilliertes Wasser oder standard Ammoniak-Lösung mit 2 mL Reagenz 1 (0,75 mM ADP und 30 U/mL Glutamat-Dehydrogenase in Puffer pH 7,8) und 500 µL Reagenz 2 (1,3 mM NADH). 15 min bei Raumtemperatur inkubieren und lesen NADH Absorption bei 340 nm (A1).
   4. Hinzufügen 500 µL Reagenz 3 (60 mM α-Ketoglutarate in Puffer pH 8), die Probe für 20 min bei Raumtemperatur inkubieren und lesen die NADH-Absorption bei 340 nm (A2).
   5. Berechnen Sie Ammoniak Konzentration verwenden:
      C_Ammoniak (g/L) = 0.083 x [(0.839 x A1-A2)_Probe- (0,839 x A1-A2)_{destilliertem Wasser}]
   6. Überprüfen Sie, dass die richtige Konzentration bei der standard-Lösung erzielt wird.
2. Chromatographische Bestimmung der verbleibenden Aminosäure-Konzentrationen
   Hinweis: Die Bestimmung der Konzentrationen der Aminosäure in Überstände erfolgt über eine spezielle Aminosäure-Analyse-System, das auf Ionenaustausch Chromatographie mit Post Spalte Derivatisierung von N-Verbindungen mit Ninhydrin-, wodurch ihre farbmetrische Erkennung.
   1. Bereiten Sie eine Referenzlösung durch Zugabe von 200 µL einer kommerziellen Mischung aus neutralen und sauren Aminosäuren, 200 µL einer kommerziellen Mischung von basischen Aminosäuren und 200 µL 2,5 mM Glutamin zu 400 µL 200 mM Lithium-Citrat-Puffer, pH 2.2. Diese chemisch definierten Referenzlösung wird als eine Probe behandelt.
   2. Hinzu kommt 200 µL 25 % (w/V) Sulfosalicylic saure Lösung, die 2,5 mM Norleucin (interner Standard) enthält 800 µL der Probe, Moleküle mit hoher Molmasse zu entfernen. Inkubation für 1 h bei 4 ° C, Zentrifuge (3.000 x g, 10 min, 4 ° C) und Filter durch ein 0,22 µm Porengröße Nitrozellulose-Membran (Spritzensystem).
   3. Klicken Sie in der Programmierer Software auf die Schaltfläche "Ausführen" zu beginnen, die liquide Chromatography (LC) Analysen mit dem Analyzer, ausgestattet mit einer Kationenaustausch Spalte (Lithium-Form). Eluieren Sie Aminosäuren mit aufeinanderfolgenden Lithium Puffern erstelle ich einen pH-Gradienten und einen Farbverlauf in Counter Ionenkonzentration in Kombination mit einem Temperaturgradienten (Tabelle 2).
   4. Quantifizieren der Stickstoffverbindungen nach Ninhydrin-Derivatisierung von einem spektralfotometrische Detektor bei 570 nm (lila Färbung: Reaktion zwischen Ninhydrin- und Amin Gruppe von Aminosäuren) und 440 nm (gelbe Färbung: Reaktion zwischen Ninhydrin- und Imin Gruppe von Prolin).
   5. Führen Sie eine Einzelpunkt-interne Kalibrierung mit der Referenzlösung und Norleucin als interner Standard um zu berechnen, die Konzentrationen der Aminosäuren in den Proben, die mit der Software des Herstellers.

3. Quantifizierung der proteinogene Aminosäuren

1. Messung der Trockenzelle Gewicht
   1. Filtern Sie 10 mL der Kultur durch einen Nitrozellulose-Filter (Pore Größe 0,45 µm), der vorgewogene in eine Aluminium-Schale ist mit einem Vakuum-Gerät. Zweimal mit 50 mL destilliertem Wasser waschen.
   2. Setzen Sie den Filter in der Aluminium-Cup und trocknen im Backofen bei 105 ° C für 48 h (bis keine weitere Änderung im Gewicht beobachtet wird) Rückwägung des Filters in der Tasse. Der Gewichtsunterschied zu berechnen.
   3. Berechnen Sie den Mittelwert von mindestens 3 unabhängige Messungen der Trockenzelle Gewicht die Hefekultur genau zu bestimmen.
2. Quantifizierung der Eiweißgehalt der Zellen
   Hinweis: Die Quantifizierung der Proteinfraktion der Zellen erfolgt mindestens in dreifacher Ausfertigung mit unbeschrifteten Zelle Pellets, die erzielt wurden, wie im Abschnitt 1.3.2 beschrieben.
   1. Extrahieren Sie Proteine durch Zugabe von 1 mL DMSO-Lösung (50 % V/V) zu gefrorenen Pellets zu und inkubieren Sie bei 105 ° C 1 h im Ofen eine trockene Hitze.
   2. Quantifizieren Sie den Proteingehalt in der DMSO-Extrakte mit biochemischen farbmetrischen Assays, die auf die Reduzierung von Proteinen Cu⁺⁺ in Cu⁺ Ionen basiert, die weiter durch Bicinchoninic Säure in einem blauen Komplex (BCA Assay) ausgefällt werden.
3. Bestimmung der relativen Beiträge von Aminosäuren in Proteinen
   Hinweis: Das Profil des proteinogene Aminosäuren wird mindestens in dreifacher Ausfertigung aus unbeschrifteten Zelle Pellets (1.3.2.) bestimmt.
   1. Bereiten Sie oxidierten Auszug durch Aussetzung der Zelle Pellet in 200 µL Performic Säure (Ameisensäure 90 %, 10 % Wasserstoffperoxid vor). 4 h bei 4 ° C inkubieren und die Reaktion durch die Zugabe von 33,6 mg Natrium Sulfat zu stoppen.
      Hinweis: Die Oxidationsschritt ist verpflichtet, Cystein und Methionin umwandeln in Methionin Sulfon und Cysteic Säure, die weiter durch Ionenaustausch Chromatographie quantifiziert werden. Jedoch sind einige Aminosäuren (Tyrosin, Phenylalanin Histidin und Arginin) während Oxidationsbehandlung denaturiert. Folglich sind zwei Hydrolysate (mit und ohne Oxidation) bereit.
   2. Zelle Pellets 800 µL 6N HCl hinzu oder oxidiert Extrakt und inkubieren Sie die Probe in einer hermetisch geschlossenen Glasröhre für 16 h bei 110 ° C im Ofen eine trockene Hitze. 200 µL 2,5 mM Norleucin hinzufügen und Entfernen von HCl mit einem Strom von Stickstoff. Waschen Sie (resuspending des getrockneten Extraktes und entfernen dann die Flüssigkeit mit einem Stickstoff-Strom), zweimal mit 800 µL destilliertes Wasser und dann mit 800 µL Ethanol. In 800 µL 200 mM Lithium-Acetat-Puffer pH 2.2 aufnehmen.
      Hinweis: Um die Inkubationszeit für die Hydrolyse achten wie einige Aminosäuren nicht unter sauren Bedingungen stabil sind. Der Tryptophan-Anteil an Eiweiß ist von Daten in der Literatur¹⁶, geschätzt, da diese Aminosäure bei HCl Hydrolyse völlig denaturiert ist.
   3. Die Einpunkt-interne Kalibrierung Hydrolysat Standard vorbereiten. 840 µL 200 mM Lithium-Acetat-Puffer pH 2.2, die 625 µM Methionin Sulfon, 625 µM Cysteic Säure und 625 µM Norleucin enthält fügen Sie 160 µL einer kommerziellen Lösung von hydrolysierten Aminosäuren hinzu.
   4. Bestimmen Sie die relativen Konzentrationen von Aminosäuren in Proteinen die chromatographische Methode im Abschnitt 2.2 beschrieben.
4. Berechnungen
   1. Berechnen der Gewichtsanteil der einzelnen Aminosäuren in Proteinen durch die Aufteilung der gemessenen Menge von einzelnen Aminosäuren (mg/L) durch die Gesamtmenge der Aminosäure, die in den Proteinextrakt (Summe in mg/L) gemessen wurde.
   2. Multiplizieren Sie diesen Prozentsatz durch die Konzentration der Proteine in der Kultur (mg/L), d. h., das Produkt zwischen der Proteingehalt der Biomasse und das Trockengewicht, die Konzentration der einzelnen proteinogene Aminosäuren in der Kultur (mg/L) zu beurteilen.

4. Messung der isotopischen Anreicherung von proteinogene Aminosäuren

Hinweis: Für die Messung der isotopischen Anreicherung von proteinogene Aminosäuren, verwenden Sie die markierte Zelle Pellets. Drei verschiedene Wirkstoffe werden für die Derivatisierung Schritt zur isotopische Bereicherung der Aminosäuren zu quantifizieren. Die Intensitäten der Cluster-Ionen werden gemessen, um die Kennzeichnung Muster der Aminosäuren zu schätzen. Das Signal aus jedem Cluster Ion entspricht die Fülle der Masse Isotopomers (m₀ = ohne Kennzeichnung, m_{+ 1} = 1 beschriftete Atom...) von einer Aminosäure-Fragment. Ein Beispiel für ein Chromatogramm, die nach dem DMADMF Verfahren erworben wird ist in Abbildung 2angegeben.

1. Biomasse-Hydrolyse
   1. Hydrolyseneigung die Zelle-Pellets (entsprechend 1 bis 2 mg von getrockneten Biomasse) durch Hinzufügen von 1,2 mL 6 M HCl und Inkubation der Probe 16 h bei 105 ° C in dicht verschlossenen Glasröhrchen im trockenen Hitze gebacken.
   2. Fügen Sie 1,2 mL destilliertem Wasser und Zentrifuge bei 3.000 X g für 5 min, Zelltrümmer zu entfernen. Verteilen Sie den Überstand in sechs 400 µL Fraktionen in offener Glasröhren. Trocknen Sie die Fraktionen in einem Ofen bei 105 ° C, bis sie die Konsistenz von Sirup (4-5 Std.) erreichen.
2. Ethylchloroformate (ECF) Derivatisierung
   1. Lösen Sie die getrockneten Hydrolysat in 200 µL 20 mm HCl; Fügen Sie 133 µL von Pyridin: Ethanol (1:4). Fügen Sie 50 µL ECF derivatize Aminosäuren und warten, bis alle CO₂ ist erschienen. Übertragen Sie die Mischung um Rohre, die enthalten 500 µL von Dichlormethan derivatisierte Verbindungen extrahiert zentrifugieren.
   2. Wirbel der Rohre für 10 s und Zentrifuge für 4 min bei 10.000 x g; sammeln Sie die untere organische Phase mit Pasteur pipettieren und Transfer GC-Fläschchen, die konische Glaseinsätzen enthalten, so dass die Proben direkt in GC/MS-Instrument injiziert werden können.
3. (N, N)-Dimethylformamid Dimethyl Acetal (DMFDMA) Derivatisierung.
   1. Lösen Sie die getrockneten Hydrolysat in Methanol 50 µL und 200 µL Acetonitril. 300 µL der DMFDMA hinzufügen. Vortex Rohr und Transfer Proben GC Autosampler vials, die konische Glaseinsätzen enthalten.
4. N, O-BIZ (Trimethylsilyl) Trifluoroacetamide (BSTFA) Derivatisierung
   1. Das Hydrolysat in 200 µL Acetonitril auszusetzen. Fügen Sie 200 µL BSTFA, schließen Sie hermetisch das Glasrohr und vor der Übertragung des Extrakts direkt an GC Vials für 4 h bei 135 ° C inkubieren.
5. GC-MS-Analyse
   1. Analysieren Sie Proben mit einem Gaschromatographen, der mit einem Autosampler Injektor ausgestattet ist mit einem Massenspektrometer gekoppelt.
      1. Verwenden Sie gerätespezifischen Software, um das Instrument zu kontrollieren und analysieren die Chromatogramme. Klicken Sie im Menü "Sequence" auf die "Probe-Log-Tabelle" um die Beispielliste zu erstellen, und klicken Sie auf die Schaltfläche "Ausführen", um die Injektionen zu starten.
         Hinweis: Gaschromatographen ist ausgestattet mit einem 30 m x 0,25 mm apolaren Silica Kapillare Spalte mit einer 0,15 µm Schichtdicke. Die Massenspektrometer Quadrupol-Temperatur bei 150 ° C eingestellt und halten der Transferstraße bei 250 ° C für die Analysen. Drei analytische Programme, jeweils ein bestimmtes jeden Derivatisierung Agent dienen.
      2. ECF Derivate: Verwendung Helium als der mobilen Phase mit einem Fluss von 1,2 mL/min stellen Sie die Temperatur des Einlasses bei 230 ° C und von der Quelle bei 250 ° C. Programmieren Sie den Autosampler 1 µL der Proben mit einem Split-Verhältnis von 3:1 zu injizieren. Analysen, schrittweise Erhöhung der Ofentemperatur wie folgt ausführen: 130 ° C für 3 min; Gefälle von 15 ° C/min bis 260 ° C; Temperatur bei 260 ° C für 20 Minuten zu halten.
      3. DMFDMA Derivate: Verwendung Helium als der mobilen Phase mit einem konstanten Fluss von 1,2 mL/min stellen Sie die Temperatur des Einlasses bei 230 ° C und von der Quelle bei 250 ° C. Programmieren Sie den Autosampler 1 µL der Proben mit einem Split-Verhältnis von 3:1 zu injizieren. Die Analysen, schrittweise Erhöhung der Ofentemperatur wie folgt: 60 ° C für 1 min; Gradient von 20 ° C/min bis 130 ° C; zweiten Steigung von 4 ° C/min bis 260 ° C; Temperatur bei 260 ° C für 10 min zu halten.
      4. BSTFA Derivate: Verwendung Helium als der mobilen Phase mit einem konstanten Fluss von 1,2 mL/min stellen Sie die Temperatur des Einlasses bei 275 ° C und von der Quelle bei 300 ° C. Die Analysen (Injektion: 1 µL), allmählich die Ofentemperatur wie folgt erhöht: 110 ° C für 1 min; ersten Steigung von 2 ° C/min bis 154 ° C; zweiten Gradienten von 5 ° C/min bis 300 ° C; Temperatur bei 300 ° C für 10 min zu halten.
      5. Nachweisverfahren: Injizieren Sie für jeden Modus der Derivatisierung eine Probe (1 µL) im SCAN-Modus mit positiven Elektrons Auswirkungen Ionisation bei 70 eV und beachten Sie die Verweilzeit der einzelnen Aminosäuren.
      6. Verwenden Sie diese Werte definieren die Zeitfenster während das Chromatogramm und für die verschiedenen ausgewählten Ionen, die charakteristisch für jede Aminosäure und in Tabelle 3aufgeführt sind; Diese Werte sollten für jede Aminosäure enthalten sein. Enthalten Sie diese Informationen in das SIM-Erkennung-Programm und führen Sie die Analysen im SIM-Modus mit positiven Elektrons Auswirkungen Ionisation bei 70 eV.
   2. Die Ergebnisse der Analysen zu sammeln; nämlich für jede Aminosäure zeichnen Sie eine Ansammlung von Intensitäten, die entsprechen, seine verschiedenen Masse Isotopomers auf. Die Daten mit Hilfe der Dedicatedsoftware¹⁷ für natürliche Kennzeichnung korrigieren und berechnen die isotopische Bereicherung der proteinogene Aminosäuren (definiert als die beschrifteten Bruch eine Aminosäure in Bezug auf die Gesamtmenge des Proteins zu verarbeiten Proben).
      Hinweis: Die isotopischen Bereicherung eines Moleküls (dh), ausgedrückt als Prozentsatz, errechnet sich die Summe der korrigierten Intensitäten von der Masse Isotopomers mit Beschriftung (m₁, m₂,... m-_n) durch die Summe der den korrigierten Intensitäten von der Masse Isotopomers (m₀, m₁, m₂,... m_n):
      I. E. = (m₁ und m₂ +... + m_n) / (m₀ + m₁m₂ +... + m_n)

(5) Quantifizierung und Isotopen Bereicherung der flüchtigen Verbindungen

1. Gewinnung von beschrifteten flüchtige Verbindungen
   1. Fügen Sie 10 µL deuterierte internen Standards bis 5 mL des Überstandes (Endkonzentration deuterierte Verbindungen: 100 µg/L) in einer Glasröhre 15 mL. Fügen Sie 1 mL Dichlormethan, dicht schließen Sie die Röhren und schütteln Sie sie auf einer rockigen Plattform für 20 min. Zentrifuge für 5 min bei 3.000 x g und sammeln Sie die organischen untere Phase in einer Glasröhre 15 mL. Wiederholen Sie die Dichlormethan-Extraktion.
   2. Trocknen Sie die Bio Extrakt über 500 mg wasserfreiem Natriumsulfat und sammeln Sie die flüssige Phase mit einer Pasteur pipettieren. Den Extrakt mit einem Faktor von vier unter Stickstoff Flussmittel zu konzentrieren und zu einem GC Autosampler Fläschchen übertragen werden.
2. GC-MS Quantifizierung von flüchtigen Verbindungen
   1. Gaschromatographen mit einem 30 m x 0,25 mm Fused-Silica Kapillaren Spalte mit 0,25 μm Schichtdicke auszustatten und einer Konstante Helium Strömung von 1,0 mL/min halten den Injektor und Transferstraße bei 250 ° c anwenden
   2. 2 µL der Probe mit einem Split-Verhältnis von 10:1 zu injizieren und die extrahierten flüchtige Moleküle unter Verwendung der folgenden Ofen Temperaturprofil zu trennen: die Temperatur für 3 min bei 40 ° C zu halten, um 4 ° C/min erhöht bis zu 220 ° C und dann halt den Ofen bei 220 ° C für 20 Minuten.
   3. Erkennen Sie die Verbindungen mit einem Massenspektrometer mit seiner Quelltemperatur bei 230 ° C und seine Massenspektrometer Quadrupol-Temperatur auf 150 ° c eingestellt Notieren Sie die Massenspektren in ausgewählten Ion Monitoring (SIM) Modus mit positiven Elektrons Auswirkungen Ionisation zu 70 eV und mit der Ionen-Cluster bestimmte flüchtigen Verbindungen, die in Tabelle 4gemeldet werden.
   4. Verwenden Sie eine externe 7-Punkt-Kalibrierung, um die Konzentrationen der flüchtigen Moleküle aus den Summen der Intensitäten des entsprechenden Ionen-Clusters zu quantifizieren. Stammlösungen von jeder Verbindung (10 g/L) in 100 % igem Ethanol vorbereiten. Dann bereiten Sie Standardlösungen für jede Klasse von flüchtigen Molekülen (Ethyl ester, Acetate, Alkohole und Säuren) durch Mischen auf Lagerlösungen. Zu guter Letzt verdünnen Sie unterschiedliche Mengen an Standardlösungen in einer 12 % wässrige Lösung mit 5 g/L Weinsäure mit der pH-Wert eingestellt auf 3.3 Kalibrierlösungen vorzubereiten.
   5. Parallel zur natürlichen Kennzeichnung der Intensitäten der einzelnen Ionen-Cluster zu korrigieren und Isotopen Bereicherung der flüchtige Verbindungen, die ist definiert als die beschrifteten Bruchteil der Moleküle und wird als Prozentwert mit Hilfe der speziellen Software ausgedrückt zu berechnen ¹⁷.

(6) Berechnungen für eine integrierte Analyse des Datasets

1. Sammlung der Rohdaten
   1. Mit Hilfe von Tabellen, die in den Tabellen 5, 6, 7 und 8 gezeigt geben Sie die raw-Daten-Werte, die die Konzentration der extrazellulären Aminosäuren, Zelle Trockengewicht, Protein-Inhalt von Zellen, Konzentration der flüchtigen Moleküle und Isotopen entsprechen, Anreicherung von proteinogene Aminosäuren und flüchtige Moleküle.
      Hinweis: Die Daten in Tabellen sind in mM angegeben. Die Ergebnisse werden auch ausgedrückt in mg/L multipliziert die Werte in mM durch das Molekulargewicht von jedem Molekül oder in mg N/L durch Multiplikation der millimolaren Konzentration eine proteinogene Aminosäure mit der Atommasse von Stickstoff (14 u) und durch die Anzahl der Stickstoff Ato MS, die durch den Abbau dieses Moleküls bereitgestellt werden.
   2. Berechnen der Massenanteil der einzelnen Aminosäuren in Proteine durch die Aufteilung seiner Menge in mg/L in dem Hydrolysat durch den Gesamtbetrag der Aminosäuren (ihre Summe in mg/L).
   3. Berechnen Sie Mittel und Standardabweichung Standardfehler des Mittelwertes aus den Daten, die in der unabhängigen Experimenten gewonnen wurden.
   4. Berechnen die proteinogene Konzentration (mg/L) für jede Aminosäure durch Multiplikation den Anteil dieser Aminosäure in einem Protein (mg-aa/g-Proteine) durch die Proteinfraktion in der Biomasse (g Proteine/g DW) und das Trockengewicht Inhalt (Biomasse-Produktion) in die Medium (g DW/L).
2. ¹⁵ N isotopischen Tracer Experimente
   1. Die beschriftete und unbeschriftete Anteile an Stickstoff, die in die proteinogene Aminosäuren (ausgedrückt in mg N/L) aus ihrer gesamten Konzentrationen (ausgedrückt in mg N/L) berechnen mit Hilfe von Tabellen, die in Tabelle 9dargestellt werden und ihre Isotopen Bereicherungen. Für jede Aminosäure beschriftete Bruchteil entspricht das Produkt zwischen seine volle Konzentration und seinen Isotopen Bereicherung und der unbeschriftete Teil ist die Differenz zwischen der Summe und die beschrifteten Beträge.
   2. Bestimmen Sie anschließend den Bruchteil der Gesamt-Stickstoff in den Proteinen, die in die proteinogene Aminosäuren, die in dieser Studie quantifiziert durch Summierung der Gesamtbetrag der Ala, GJ, Val, Asp, Phe, Leu, Ile, Thr, Ser, Pro, Lys, His, Glu und Arg (in mg N/L) und teilt die Summe enthalten ist eine Montage von dieser Summe in Proteinen enthaltenen Stickstoff.
   3. Berechnen Sie den Stickstoff zur Verfügung gestellt von Arginin, Glutamin oder Ammonium, die wiederhergestellt wurde, in die proteinogene Säuren durch Summierung den beschrifteten Bruchteil (in mg N/L) proteinogene Aminosäuren, die in der Studie (Ala, GJ, Val, Asp, quantifiziert wurden in dieser Studie quantifiziert Phe, Leu, Ile, Thr, Ser, Pro, Lys, His, Glu und Arg) während der Experimente in Anwesenheit von ¹⁵N beschriftet Arginin, Glutamin, oder Ammonium und Teilung dieser beschriftet-Stickstoff-Anteil durch die Gesamtmenge an Stickstoff in der quantifizierten proteinogene Aminosäuren Säuren.
   4. Bewerten Sie den Beitrag der die 3 am häufigsten vorkommende Aminosäuren in den intrazellulären Pool von Stickstoff zur de-Novo -Biosynthese durch die Kombination von Daten aus den ¹³C und ¹⁵N Isotop Tracer Experimente (Tabelle in Tabelle 7).
   5. Vom Gesamtbetrag (ausgedrückt in mM) der proteinogene Val, Leu, Ile oder Thr, ziehen Sie den Teil die direkte Einbindung von verbrauchten Verbindungen (¹³C-Experimente) und der Teil, das de Novo können mit Stickstoff aus den 3 wurde abgeleitet ab Hauptquellen um den Bruch zu bewerten, die de Novo können mit Stickstoff aus den anderen Aminosäuren.
   6. Berechnen Sie das Verhältnis der Menge der Aminosäure de Novo können mit Stickstoff zur Verfügung gestellt von Gln, Arg und NH₄⁺ (Summe in mM ausgedrückt) auf den Gesamtbetrag von proteinogene Aminosäuren (in mM) Quantifizierung des Beitrags der Arginin, Glutamin und Ammonium in den intrazellulären Stickstoff-Pool.
3. ¹³ C isotopischen Tracer Experimente
   1. Berechnen Sie die beschriftete und unbeschriftete Brüche der proteinogene Aminosäuren aus Konzentrationen ausgedrückt in mM und Isotopen Bereicherungen proteinogene Aminosäuren, die während der Experimente im Beisein von ¹³C beschriftet Leu, Val erzielt wurden, Ile oder Thr. (siehe 6.2.1, Tabelle 10).
   2. Berechnen Sie die beschriftete und unbeschriftete Bruchteile von flüchtigen Verbindungen von Konzentrationen ausgedrückt in mM und Isotopen Bereicherungen der flüchtige Verbindungen, die während der Experimente im Beisein von ¹³C beschriftet Leu, Val, Ile oder Thr ( gewonnen wurden Tabelle 10).

Ergebnisse

Abbildung 3 zeigt eine schematische Darstellung des Workflows, die implementiert wurde zur Untersuchung der Verwaltungs durch Hefe der Stickstoff mehrere Quellen, die während der Weingärung gefunden werden.
Für verschiedene Punkte der Probenahme, der biologischen Parameter – Wuchsmerkmalen, Stickstoff Konsummuster und das Profil der proteinogene Aminosäuren – zeigen eine hohe Reproduzierbarkeit unter Fermentationen (Abbildung 4...

Diskussion

Quantifizierung der Partitionierung von Verbindungen durch metabolische Netzwerke mit isotopischen Tracer Experimente ist ein vielversprechender Ansatz für die Funktionsweise des mikrobiellen Stoffwechsels verstehen. Diese Methode kann nicht während erfolgreich mit ein oder zwei beschriftete Substraten angewendet derzeit implementiert werden, um Stoffwechsel von verschiedenen Quellen mit Hilfe mehrere beschriftete elementare Isotope (d.h. mehr als zwei Substrate) zu studieren. In der Tat, verfügbaren analytis...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
D-Glucose	PanReac	141341.0416
D-Fructose	PanReac	142728.0416
DL-Malic acid	Sigma Aldrich	M0875
Citric acid monohydrate	Sigma Aldrich	C7129
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P5379
Potassium sulfate	Sigma Aldrich	P0772
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	230391
Calcium chloride dihydrate	Sigma Aldrich	C7902
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S9625
Ammonium chloride	Sigma Aldrich	A4514
Sodium hydroxide	Sigma Aldrich	71690
Manganese sulfate monohydrate	Sigma Aldrich	M7634
Zinc sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	Z4750
Copper (II) sulfate pentahydrate	Sigma Aldrich	C7631
Potassium iodine	Sigma Aldrich	P4286
Cobalt (II) chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	C3169
Boric acid	Sigma Aldrich	B7660
Ammonium heptamolybdate	Sigma Aldrich	A7302
Myo-inositol	Sigma Aldrich	I5125
D-Pantothenic acid hemicalcium salt	Sigma Aldrich	21210
Thiamine, hydrochloride	Sigma Aldrich	T4625
Nicotinic acid	Sigma Aldrich	N4126
Pyridoxine	Sigma Aldrich	P5669
Biotine	Sigma Aldrich	B4501
Ergostérol	Sigma Aldrich	E6510
Tween 80	Sigma Aldrich	P1754
Ethanol absolute	VWR Chemicals	101074F
Iron (III) chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	236489
L-Aspartic acid	Sigma Aldrich	A9256
L-Glutamic acid	Sigma Aldrich	G1251
L-Alanine	Sigma Aldrich	A7627
L-Arginine	Sigma Aldrich	A5006
L-Cysteine	Sigma Aldrich	C7352
L-Glutamine	Sigma Aldrich	G3126
Glycine	Sigma Aldrich	G7126
L-Histidine	Sigma Aldrich	H8000
L-Isoleucine	Sigma Aldrich	I2752
L-Leucine	Sigma Aldrich	L8000
L-Lysine	Sigma Aldrich	L5501
L-Methionine	Sigma Aldrich	M9625
L-Phenylalanine	Sigma Aldrich	P2126
L-Proline	Sigma Aldrich	P0380
L-Serine	Sigma Aldrich	S4500
L-Threonine	Sigma Aldrich	T8625
L-Tryptophane	Sigma Aldrich	T0254
L-Tyrosine	Sigma Aldrich	T3754
L-Valine	Sigma Aldrich	V0500
13C5-L-Valine	Eurisotop	CLM-2249-H-0.25
13C6-L-Leucine	Eurisotop	CLM-2262-H-0.25
15N-Ammonium chloride	Eurisotop	NLM-467-1
ALPHA-15N-L-Glutamine	Eurisotop	NLM-1016-1
U-15N4-L-Arginine	Eurisotop	NLM-396-PK
Ethyl acetate	Sigma Aldrich	270989
Ethyl propanoate	Sigma Aldrich	112305
Ethyl 2-methylpropanoate	Sigma Aldrich	246085
Ethyl butanoate	Sigma Aldrich	E15701
Ethyl 2-methylbutanoate	Sigma Aldrich	306886
Ethyl 3-methylbutanoate	Sigma Aldrich	8.08541.0250
Ethyl hexanoate	Sigma Aldrich	148962
Ethyl octanoate	Sigma Aldrich	W244910
Ethyl decanoate	Sigma Aldrich	W243205
Ethyl dodecanoate	Sigma Aldrich	W244112
Ethyl lactate	Sigma Aldrich	W244015
Diethyl succinate	Sigma Aldrich	W237701
2-methylpropyl acetate	Sigma Aldrich	W217514
2-methylbutyl acetate	Sigma Aldrich	W364401
3-methyl butyl acetate	Sigma Aldrich	287725
2-phenylethyl acetate	Sigma Aldrich	290580
2-methylpropanol	Sigma Aldrich	294829
2-methylbutanol	Sigma Aldrich	133051
3-methylbutanol	Sigma Aldrich	309435
Hexanol	Sigma Aldrich	128570
2-phenylethanol	Sigma Aldrich	77861
Propanoic acid	Sigma Aldrich	94425
Butanoic acid	Sigma Aldrich	19215
2-methylpropanoic acid	Sigma Aldrich	58360
2-methylbutanoic acid	Sigma Aldrich	193070
3-methylbutanoic acid	Sigma Aldrich	W310212
Hexanoic acid	Sigma Aldrich	153745
Octanoic acid	Sigma Aldrich	W279900
Decanoic acid	Sigma Aldrich	W236403
Dodecanoic acid	Sigma Aldrich	L556
Fermentor 1L	Legallais	AT1357	Fermenter handmade for fermentation
Disposable vacuum filtration system	Dominique Deutscher	029311
Fermenters (250 ml)	Legallais	AT1352	Fermenter handmade for fermentation
Sterile tubes	Sarstedt	62.554.502
Fermentation locks	Legallais	AT1356	Fermetation locks handmade for fermentation
BactoYeast Extract	Becton, Dickinson and Company	212750
BactoPeptone	Becton, Dickinson and Company	211677
Incubator shaker	Infors HT
Particle Counter	Beckman Coulter	6605697	Multisizer 3 Coulter Counter
Centrifuge	Jouan		GR412
Plate Butler Robotic system	Lab Services BV	PF0X-MA	Automatic instrument
Plate Butler Software	Lab Services BV		Robot monitor software
RobView			In-house developed calculation software
My SQL			International source database
Cimarec i Telesystem Multipoint Stirrers	Thermo Fisher Scientific	50088009	String Drive 60
BenchBlotter platform rocker	Dutscher	60903
Ammonia enzymatic kit	R-Biopharm AG	5390
Spectrophotometer cuvettes	VWR	634-0678
Spectrophotometer UviLine 9400	Secomam
Amino acids standards physiological - acidics and neutrals	Sigma Aldrich	A6407
Amino acids standards physiological - basics	Sigma Aldrich	A6282
Citrate lithium buffers - Ultra ninhydrin reagent	Biochrom	BC80-6000-06
Sulfosalycilic acid	Sigma Aldrich	S2130
Norleucine	Sigma Aldrich	N1398
Biochrom 30 AAA	Biochrom
EZChrom Elite	Biochrom		Instrument control and Data analysis software
Ultropac 8 resin Lithium	Biochrom	BC80-6002-47	Lithium High Resolution Physiological Column
Filter Millex GV	Merck Millipore	SLGVX13NL	Millex GV 13mm (pore size 0.22 µm)
Membrane filter PALL	VWR	514-4157	Supor-450 47mm 0.45µm
Vacuum pump Millivac Mini	Millipore	XF5423050
Aluminium smooth weigh dish 70mm	VWR	611-1380
Precision balance	Mettler		Specifications AE163
Dimethyl sulfoxid dried	Merck	1029310161	(max. 0.025% H2O) SeccoSolv
Combustion oven	Legallais
Pierce BCA protein assay kit	Interchim	UP40840A
Formic acid	Fluka	94318
Hydrogen peroxide	Sigma Aldrich	H1009
Hydrochloric Acid Fuming 37% Emsure	Merck	1003171000	Grade ACS,ISO,Reag. Ph Eur
Lithium acetate buffer	Biochrom	80-2038-10
Commercial solution of hydrolyzed amino acids	Sigma Aldrich	AAS18
L-Methionine sulfone	Sigma Aldrich	M0876
L-Cysteic acid monohydrate	Sigma Aldrich	30170
Pyrex glass culture tubes	Sigma Aldrich	Z653586
Pyridine	Acros Organics	131780500	99% Extrapure
Ethyl chloroformate	Sigma Aldrich	23131
Dichloromethane	Sigma Aldrich	32222
Vials	Sigma Aldrich	854165
Microinserts for 1.5ml vials	Sigma Aldrich	SU860066
GC/MS	Agilent Technologies	5890 GC/5973 MS
Chemstation	Agilent Technologies		Instrument control and data analysis software
Methanol	Sigma Aldrich	34860	Chromasolv, for HPLC
Acetonitrile	Sigma Aldrich	34998	ChromasolvPlus, for HPLC
N,N-Dimethylformamide dimethyl acetal	Sigma Aldrich	394963
BSTFA	Sigma Aldrich	33024
DB-17MS column	Agilent Technologies	122-4731	30m*0.25mm*0.15µm
Sodium sulfate, anhydrous	Sigma Aldrich	238597
Technical nitrogen	Air products	14629
Zebron ZB-WAX column	Phenomenex	7HG-G007-11	30m*0.25mm*0.25µm
Helium BIP	Air products	26699
Glass Pasteur pipettes	VWR	612-1702