Процесс, основанный на сочетании изотопный Tracer экспериментов расследовать микробного метаболизма множественные источники питательных веществ

Резюме

Этот протокол описывает экспериментальная процедура количественно и всесторонне расследовать метаболизм нескольких источников питательных веществ. Этот рабочий процесс, основываясь на комбинации изотопный трассирующими экспериментов и аналитические процедуры, позволяет судьба потребленных питательных веществ и метаболизма происхождение молекул синтезированный микроорганизмами, которые будут определены.

Аннотация

Исследования в области микробиологии полагаться на осуществление широкого круга методологий. В частности разработки надлежащих методов существенно способствует обеспечению обширные знания метаболизма микроорганизмов, растущих в химически определенных носителей, содержащих уникальные азота и углерода источников. В отличие от управления через метаболизм нескольких источников питательных веществ, несмотря на их широкое присутствие в природных и промышленных средах, остается практически неисследованной. Эта ситуация объясняется главным образом отсутствием подходящих методологий, который препятствует расследований.

Мы приводим экспериментальная стратегия количественно и всесторонне исследовать, как метаболизм работает когда питательных предоставляется как смесь различных молекул, т.е., комплекс ресурс. Здесь мы описываем его применения для оценки разделение нескольких источников азота через сеть метаболических дрожжей. Рабочий процесс сочетает в себе информацию, полученную во время экспериментов трассирующими стабильный изотоп с помощью выбранных ¹³C - или ¹⁵N-меченых субстратов. Первый состоит из параллельных и воспроизводимые брожения в той же среде, которая включает в себя смесь N-содержащих молекул; Однако источник выбранного азота помечается каждый раз. Сочетание аналитических процедур (ВЭЖХ, GC-MS) осуществляется для оценки маркировки образцы целевых соединений и количественной оценки потребления и восстановления субстратов в других метаболитов. Комплексный анализ полного набора данных обзор о судьбе потребляемых субстратов внутри клетки. Этот подход требует точной протокол для сбора образцов – способствует робот помощь система онлайн мониторинга брожения – и достижения многочисленных времени анализа. Несмотря на эти ограничения она позволила, понимание, в первый раз, перегородки из нескольких источников азота во всей сети метаболических дрожжей. Мы прояснили перераспределение азота из более обильные источники к другим N-соединений и определяется метаболических происхождение летучих молекул и proteinogenic аминокислоты.

Введение

Понимание как работает микробного метаболизма является ключевым вопросом для разработки эффективных стратегий для улучшения процессов ферментации и модулировать производства бродильных соединений. Достижения в области геномики и функциональной геномики в эти последние два десятилетия в значительной мере способствовали расширение знаний о топологии метаболических сетей в многих микроорганизмов. Доступ к этой информации привело к разработке подходов, которые направлены на всесторонний обзор сотовой функция¹. Эти методологии часто полагаются на основе модели интерпретации измеримых параметров. Эти экспериментальные данные включают, с одной стороны, показатели поглощения и производства метаболит, и, с другой стороны, количественные внутриклеточных информация, которая получена из изотопа трассирующими экспериментов. Эти данные обеспечивают необходимую информацию для вычета в vivo активности различных путей в определенных метаболических сети^2,3,4. В настоящее время имеющиеся аналитические методы только включить точное обнаружение маркировки модели молекул при использовании изотопов одного элемента и, возможно, когда совместно маркировки с двух изотопов элементов. Кроме того в большинстве условий роста, источника углерода состоит только из одного или двух соединений. Следовательно подходы, основанные на ¹³C-изотопные трассеры от углеродных подложках были широко и успешно применяется для полного понимания углерода метаболических сетевых операций^{5,6,7 ,8}.

Напротив во многих природных и промышленных средах, азота ресурс, который поддерживает рост микроорганизмов часто состоит из широкого спектра молекул. Например во время брожения вино или пиво, азота предоставляется как смесь 18 аминокислот и аммония в переменной концентрации⁹. Этот массив N соединений, которые являются доступными для анаболизма делает эти сложные СМИ условия отличаются от тех, которые обычно используются для физиологических исследований, как последний достигаются с помощью уникальный источник азота, обычно аммония.

В целом внутреннюю азотных соединений могут быть непосредственно включены в белки или голодании. Структура сети метаболизма азота у многих микроорганизмов, в том числе дрожжей Saccharomyces cerevisiae, является весьма сложной, в соответствии с разнообразием субстратов. Схематично эта система основана на сочетании центральное ядро метаболизма азота, который катализирует взаимное преобразование глутамина, глутамата и альфа-кетоглутарата^10,11, трансаминазы и деаминазами. Через эту сеть аминов группы аммония или другие аминокислоты собираются и α-кето кислоты выпущено. Эти промежуточные также являются синтезированный через Центральный углерода метаболизм (СКК)^12,13. Это большое количество разветвленных реакций и посредников, участвующих в катаболизм источников внешних азота и анаболизм proteinogenic аминокислоты, выполняет анаболические требования клеток. Деятельность через эти различных взаимосвязанных маршрутов также приводит к выведению метаболитов. В частности α-кето кислоты могут перенаправляться через Эрлих путь для получения высших спиртов и их ацетата эфира производные¹⁴, которые являются важным вклад сенсорные профилей продукции. Впоследствии как работает метаболизма азота играет ключевую роль в производство биомассы и формирования летучих молекул (арома).

Реакции, ферменты и генов, участвующих в метаболизме азота подробно описаны в литературе. Однако еще не рассматривался вопрос о распределении нескольких источников азота в метаболических сети. Есть две основные причины, которые объясняют это отсутствием информации. Во-первых, с учетом важных сложности сети метаболизм азота, большое количество количественных данных не требуется для полного понимания его работы, которая была недоступна до сих пор. Во-вторых, многие экспериментальные ограничения и ограничения аналитических методов помешало реализации подходов, которые ранее использовались для уточнения функции СКК.

Чтобы преодолеть эти проблемы, мы решили разработать системного уровня подход, основанный на сверки данных из серии экспериментов изотопный трассирующими. Процесс включает в себя:
-Набор брожения осуществляется на тех же условиях окружающей среды, в то время как другой источник отдельных питательных веществ (субстрата) помечается каждый раз.
-Сочетание аналитических процедур (ВЭЖХ, GC-MS) для точного определения, на разных стадиях ферментации, остаточная концентрация помечены субстрата и концентрации и изотопного обогащения соединений, которые являются производными от катаболизм помечены молекулы, включая производные биомассы.
-Расчет массы и изотопного равновесия для каждого потребляется помечены молекулы и дальнейшего комплексного анализа набора данных, чтобы получить глобальный обзор управления источниками питательных веществ, микроорганизмов через определение соотношения потока .

Чтобы применить эту методологию, внимание должно уделяться воспроизводимое поведение штамм/микроорганизма между культурами. Кроме того образцы из различных культур должны приниматься в ходе же четко ферментации. В экспериментальной работе в этой рукописи робот помощь система используется для онлайн мониторинг брожения для учета этих ограничений.

Кроме того важно выбрать набор помечены субстратов (соединение, характер и положение маркировки), подходит для решения проблемы научного исследования. Здесь ¹⁵N-меченых аммония, глютамин и аргинина были выбраны в качестве трех основных азота источников в виноградный сок. Это позволило оценить шаблон перераспределение азота из потребляемых соединений для proteinogenic аминокислоты. Мы также стремились исследовать судьбу углерода костяк потребляемых аминокислот и их вклада в производство неустойчивых молекул. Для удовлетворения этой цели, равномерно ¹³C-меченых лейцина, треонин, изолейцин и валин были включены в исследование как аминокислоты, которые являются производными от основных промежуточных Эрлих пути.

В целом мы количественно исследовать, как дрожжи управляет ресурсом комплекс азота перераспределяя источники экзогенной азота выполнить его анаболических требования по всей брожения Кроме того удаляя избыток углерода прекурсоров как летучие молекулы. Экспериментальная процедура, сообщается в настоящем документе может применяться для расследования других множественные источники питательных веществ, используемые другими микроорганизма. Она, как представляется, соответствующий подход для анализа влияния генетический фон или экологических условий на метаболические поведении микроорганизмов.

протокол

1. ферментации и выборки

1. Подготовка средств массовой информации и ферментеров
   Примечание: Все брожения являются осуществляются параллельно, используя же нагрузку и в то же химически определены синтетической среде (SM, композиция, приводятся в таблице 1), которая включает в себя смесь аммония и аминокислоты, как источников азота¹⁵. Для каждого ферментации единый азота соединения предоставляется исключительно в равномерно помечены ¹³C или ¹⁵N форме (100%), в то время как другие остаются без метки. Для каждого источника помечены азота, который используется в наборе экспериментов (здесь: ¹⁵NH₄, U -¹⁵N4-Arg, U -¹⁵N2-Gln, U -¹³C6-лей, U -¹³C5-Валь, U -¹³C6-Иль, U -¹³C4-чет), два Ферментаторы готовятся. Для каждого условия дубликаты ферментации выполняется с использованием только неподписанных молекул (7 контроль брожения).
   1. Для каждого N-источника быть изучены, подготовить 500 мл SM среды, которая содержит все источников азота, перечисленных в таблице 1, за исключением соединения для использования в 100% помечены формы.
      Примечание: Приклеенные этикетку молекулы добавляется в следующих шагах.
   2. Пастеризации каждого носителя в колбе 1 Л (10 мин., 100 ° C) содержащий магнитные перемешивания бар. Взвешивать соответствующее количество помечены молекулы до конечной концентрации, которая приводится в таблице 1 и растворить его в среде.
   3. Стерилизуйте среды с помощью одноразовой вакуумной фильтрации системы (ацетат целлюлозы мембраны, 0,22 мкм). С помощью стерильных Измерительный цилиндр, разделите между двумя предварительно стерилизованные ферментеров (250 мл), которые содержат магнитные перемешивания бар и оснащены брожения блокировки, чтобы избежать вход кислорода, но позволяют выпуска CO₂.
   4. Тепло ферментации колбы до 28 ° C, поместив их в инкубации номер за 1 ночь (температуры, установленной на 28 ° C).
2. Прививки и мониторинг брожения
   1. Растут штамма S. cerevisiae в стерильные пробирки с 10 мл YPD среды на 28 ° C при встряхивании (150 об/мин) для 12 h. Затем, накапайте 1 мл YPD preculture и перенести его на 10 мл среды SM (в 15 мл стерильные трубы). Инкубируйте культуру для 12 ч при 28 ° C при встряхивании (150 об/мин).
   2. В разделе ламинарного потока собирать preculture аликвота и количественно популяции клеток, используя счетчик электронный частиц, который оснащен отверстие 100 мкм. Центрифуга preculture (2000 x g, 15 мин, 4 ° C) и приостановить гранулы в соответствующий объем стерильной водой для получения конечной концентрации 2,5 x 10⁸ клеток/мл. Прививать каждый бродильный аппарат с 1 мл суспензии клеток.
      Примечание: Роботизированная система, используемая для наблюдения за ходом ферментации описана на рисунке 1.
   3. Подготовьте платформы ферментации, установив ферментеров в поддержку руководства, которые должным образом размещаются на перемешивание пластины 21-положение и установить скорость перемешивания на 270 об/мин. Чтобы начать он-лайн мониторинг каждого ферментации, запустите приложение управления роботом, затем нажмите кнопку «Старт пробирного» и выберите том ферментации осуществляться (300 мл).
   4. Отображается интерфейс разрешает указание числа и положение ферментеров на платформе. Чтобы убедиться, что это происходит, щелкните правой кнопкой мыши на папке слот и выберите «Включить», чтобы активировать мониторинг ферментёра, находится в этой позиции.
   5. Инициализируйте вычисления программного обеспечения, постоянно работающих в системе, прежде чем начать приобретение вес. Нажмите на кнопку «Initialiser» и проверить с «ОК». Нажмите на кнопку «Пуск» робот управления приложению начать вес приобретений.
3. Процедура отбора
   Примечание: Для каждого ферментёра, берутся образцы когда производство CO₂ (значение, показанное он-лайн на компьютере программное обеспечение для расчета) достигает требует уставки: 5, 10, 40 и 90 г/Л в этом исследовании.
   1. Отбор проб процедуры для культур с метками соединений.
      1. Центрифугуйте образцы двух 6 мл (2000 x g, 5 мин, 4 ° C). Сохранять и хранить замороженные supernatants в двух аликвоты-80 ° c. Вымойте гранулы дважды с 5 мл дистиллированной воды и хранить при температуре-80 ° C для измерения изотопного обогащения.
   2. Отбор проб процедуры для культур без помечены соединений
      1. Урожай 10 мл культуры, который будет использоваться для определения сухого веса. Пелле клетки из двух образцов 10 мл центрифугированием (2000 x g, 5 мин, 4 ° C). Вымойте гранулы дважды с 10 мл дистиллированной воды и хранить их в-80 ° C для определения содержания белков и аминокислот.

2. Количественная оценка источников потребляемых азота

1. Ферментативный определение концентраций остаточного аммиака
   Примечание: Определение концентрации аммиака в supernatants осуществляется с использованием коммерческих комплект на основе ферментов; Все реагенты предоставляются изготовителем.
   1. Приготовляют раствор Стандартный аммиака (61,4 мг/Л), растворяя 25 мг точно взвешенного (NH₄)₂так₄ в объемный флакон 100 мл.
   2. Для выполнения инструкции производителя, выполните 1:2 разведение образцов, которые были приняты до брожения и 5 г/Л CO₂ выпущена. Отрегулируйте пэ-аш образцов до приблизительно 8, добавив 1 M Кох. Принять к сведению дополнительные тома и принять его во внимание коэффициент разрежения.
   3. В 4 мл Кюветки спектрофотометра смесь 100 мкл пример (разбавленный при необходимости), дистиллированной воды или раствора аммиака Стандартный с 2 мл реактива 1 (0,75 мм ADP и 30 дегидрогеназа глутамата ед/мл в буфере pH 7,8) и 500 мкл реагента 2 (1,3 мм NADH). Инкубируйте 15 мин при комнатной температуре и читать NADH поглощения на 340 Нм (А1).
   4. 500 мкл Реагента 3 (60 мм α-кетоглутарата в буфер рН 8), инкубации образца для 20 мин при комнатной температуре, и читать NADH поглощения на 340 Нм (A2).
   5. Вычислите с помощью концентрации аммиака:
      C_{аммиака} (г/Л) = 0,083 x [(0.839 x A1-A2)_{образца}- (0.839 x A1-A2)_{дистиллированной воды}]
   6. Убедитесь, что правильной концентрации получается с стандартным решением.
2. Хроматографическое определение концентраций остаточного амино кислоты
   Примечание: Определение концентраций аминокислоты в supernatants достигается с помощью системы анализа выделенный аминокислота, которая основана на ионообменной хроматографии с пост колонке деривации N-соединений с Нингидрин, который позволяет их Колориметрическое определение.
   1. Приготовляют раствор ссылки, добавляя 200 мкл коммерческой смеси нейтральные и кислые аминокислоты, промаркированные коммерческой смеси основных аминокислот и 200 мкл глутамина 2,5 мм до 400 мкл 200 мм лития цитрат буфера, рН 2.2. Это химически определенные ссылки решение рассматривается как образец.
   2. 200 мкл 25% (w/v) сульфосалициловой кислоты раствор, содержащий 2,5 мм Норлейцин (внутренний стандарт), до 800 мкл пример для удаления молекул с большим молекулярным весом. Инкубируйте 1 час при 4 ° C, центрифуги (3000 x g, 10 мин, 4 ° C) и фильтр через мембраны нитроцеллюлозы размер пор 0,22 мкм (шприц системы).
   3. В программном обеспечении программист нажмите на кнопку «Запустить», чтобы начать жидкостной хроматографии (LC) анализ с помощью анализатора с катион обменной колонны (литий форма). Элюировать аминокислоты с последовательными литий буферов для создания градиента рН и градиент в борьбе с ионной концентрации в сочетании с градиентом температуры (Таблица 2).
   4. Количественно соединений азота после деривации Нингидрин, спектрофотометрический детектор на 570 Нм (пурпурная окраска: реакция между Нингидрин и амины группы аминокислот) и 440 Нм (желтая окраска: реакция между Нингидрин и Имин группы "ПроЛайн").
   5. Выполните одной точки внутренней калибровки с использованием эталонного решения и Норлейцин как внутренний стандарт для расчета концентрации аминокислот в образцах используя производителя программного обеспечения.

3. Количественная оценка Proteinogenic аминокислот

1. Измерение веса сухих
   1. Фильтр 10 мл культуры через фильтр нитроцеллюлозы (поры размер 0,45 мкм), который предварительно взвешенный в Кубке алюминия, с помощью вакуумного устройства. Мыть дважды с 50 мл дистиллированной воды.
   2. Установите фильтр в чашке алюминия и высушите в духовке тепла при 105 ° C в течение 48 часов (пока не наблюдается никаких дальнейших изменений в весе) перед перевеской фильтр в чашке. Вычислите разницу веса.
   3. Вычислить среднее значение по крайней мере 3 независимых измерений, чтобы точно определить вес сухой клетки культуры дрожжей.
2. Количественная оценка содержания белка клеток
   Примечание: Количественная оценка белковые фракции клеток производится по крайней мере в трех экземплярах с помощью немеченого клеток гранулы, которые были получены, как описано в разделе 1.3.2.
   1. Экстракт белков путем добавления 1 мл ДМСО раствора (50% v/v) замороженных гранул и Инкубируйте на 105 ° C за 1 час в печи сухого тепла.
   2. Количественно содержание белка в ДМСО экстрактов, используя биохимический колориметрические assay, который основывается на сокращение белки Cu⁺⁺ в Cu⁺ ионы, которые осаждаются дальше bicinchoninic кислоты в голубой комплекс (BCA проба).
3. Определение относительного вклада аминокислот в белки
   Примечание: Профиль proteinogenic аминокислот определяется по крайней мере в трех экземплярах от немеченого клеток окатышей (1.3.2.).
   1. Подготовьте выдержку окисленных приостановив Пелле клеток в 200 мкл performic кислоты (90% муравьиной кислоты, 10% перекиси водорода). Проинкубируйте 4 ч при температуре 4 ° C и остановить реакции добавлением 33,6 мг натрия сульфата.
      Примечание: Окисления шаг необходим для преобразования метионина и цистеина в метионин сульфон и cysteic кислоты, которая будет далее количественно методом ионообменной хроматографии. Однако некоторые аминокислоты (тирозин, фенилаланин, гистидина и аргинина) денатурированы во время лечения окисления. Следовательно готовятся два гидролизаты (с и без окисления).
   2. 800 мкл 6N HCl клеток гранул или экстракт окисленный и инкубации образца в герметично закрытой стеклянной трубки для 16 ч при 110 ° C в печи сухого тепла. 200 мкл Норлейцин 2,5 мм и удалить HCl с потоком азота. Помыть (resuspending сушеного экстракта и затем удаления жидкости с потоком азота), дважды с 800 мкл дистиллированной воды, а затем с 800 мкл этанола. Занимают в 800 мкл 200 мм литий ацетат буфера, рН 2.2.
      Примечание: Внимание следует уделять время инкубации для гидролиза как некоторые аминокислоты не являются стабильными в кислых условиях. Триптофан фракция в протеине оценивается от данных, найденных в литературе¹⁶, как это аминокислота полностью денатурированный при гидролизе HCl.
   3. Подготовьте гидролизат стандарт для одноточечной внутренней калибровки. Мкл 160 коммерческого решения гидролизованный аминокислот в 840 мкл 200 мм литий ацетат буфера, рН 2.2, который содержит 625 мкм сульфона метионина, 625 мкм cysteic кислоты и 625 мкм Норлейцин.
   4. Определение относительной концентрации аминокислот в белки, используя хроматографического метода, описанного в разделе 2.2.
4. Расчеты
   1. Рассчитайте процент веса каждой аминокислоты в белки путем деления отмеренное количество каждой аминокислоты (мг/Л), общее количество аминокислота, которая была измерена в белка выдержке (сумма в мг/Л).
   2. Умножьте этот процент концентрации белков в культуре (мг/Л), т.е., продукт между содержание белка биомассы и сухой вес, чтобы оценить концентрацию аминокислот каждый proteinogenic в культуре (мг/Л).

4. Измерение изотопного обогащения Proteinogenic аминокислот

Примечание: Для измерения изотопного обогащения proteinogenic аминокислот, используйте гранулы меткой ячейки. Три различные агенты используются для деривации шаг для количественного определения изотопного обогащения аминокислот. Интенсивностей кассетных ионов измеряются оценить маркировки образцы аминокислот. Сигнал от каждого кластера Ион соответствует обилие массовых isotopomers (m₀ = без маркировки, m_{+ 1} = 1 помечены атома,...) аминокислоты фрагмента. Хроматограмма, которая получается после процедуры DMADMF примера на рисунке 2.

1. Гидролиз биомассы
   1. Гидролизуют ячейки гранулы (соответствует 1-2 мг сухой биомассы), добавляя 1,2 мл 6 М HCl и инкубации образца для 16 ч при 105 ° С в плотно закрытых стеклянных трубок в печи сухого тепла.
   2. Добавьте 1,2 мл дистиллированной воды и центрифуги на 3000 x g 5 мин для удаления сотовой мусора. Распространите супернатант в шести 400 мкл фракции в открытых стеклянных трубок. Сухие фракций в духовке тепла при 105 ° C, до консистенции сиропа (4-5 ч).
2. Ethylchloroformate (ЭШФ) деривации
   1. Распустить сушеные гидролизат в 200 мкл 20 мм HCl; затем 133 мкл пиридина: этаноле (1:4). Добавьте 50 мкл ЭШФ derivatize аминокислоты и подождать до тех пор, пока все CO₂ была выпущена. Передача смеси для центрифуг трубок, содержащих 500 мкл дихлорметан для извлечения derivatized соединений.
   2. Вихревой трубы для 10 s и центрифуги для 4 мин на 10000 x g; Соберите нижней органические фазы с Pasteur накапайте и передачи GC флаконов, содержащих конические стеклянными вставками, что образцы могут вводиться непосредственно в ГХ/МС инструмент.
3. (N, N)-диметилформамид диметил деривации ацеталя (DMFDMA).
   1. Растворите сушеные гидролизат в 50 мкл метанола и 200 мкл ацетонитриле. Добавьте 300 мкл DMFDMA. Вихревой трубе и передачи образцов GC Автоматический пробоотборник ампул содержащие конические стеклянными вставками.
4. N, O-бис (триметилсилиловые) trifluoroacetamide (BSTFA) деривации
   1. Приостановите гидролизат в 200 мкл ацетонитриле. 200 мкл BSTFA, герметично закройте стеклянную трубку и инкубировать в течение 4 часов при 135 ° C перед передачей экстракт непосредственно к GC флаконов.
5. GC-MS анализ
   1. Анализ образцов с газового хроматографа, который оснащен Автоматический пробоотборник инжектор и соединена с масс-спектрометром.
      1. Используйте инструмент конкретной программное обеспечение для управления инструмент и анализировать хроматограммы. В меню «Последовательность» нажмите «образец таблицы журнала» для создания списка образца и нажмите кнопку «Запустить», чтобы начать инъекции.
         Примечание: Газовый хроматограф оснащен 30 м х 0,25 мм apolar кремнезема капиллярной колонки с толщиной 0,15 мкм-фильм. Установите температуру квадрупольный масс-спектрометр при 150 ° C и провести линию передачи при 250 ° C для всех анализов. Используются три аналитические программы, каждый относящийся к каждому агенту деривации.
      2. ЭШФ производные: Использование гелий как подвижная фаза с потоком 1,2 мл/мин температура на входе заход 230 ° C и что из источника на 250 ° C. Программа Автоматический пробоотборник придать 1 мкл образцов с Сплит соотношении 3:1. Запустить анализ, постепенно увеличивая температуру печи следующим: 130 ° C 3 мин; градиент 15 ° C/мин до 260 ° C; поддерживать температуру на 260 ° C в течение 20 мин.
      3. DMFDMA производные: Использование гелий как подвижная фаза с постоянным потоком 1,2 мл/мин температура на входе заход 230 ° C и что из источника на 250 ° C. Программа Автоматический пробоотборник придать 1 мкл образцов с Сплит соотношении 3:1. Запустить анализ, постепенно увеличивая температуру печи следующим: 60 ° C в течение 1 мин; градиент 20 ° C/мин до 130 ° C; второй градиент 4 ° C/мин до 260 ° C; поддерживать температуру на 260 ° C в течение 10 мин.
      4. BSTFA производные: Использование гелий как подвижная фаза с постоянным потоком 1,2 мл/мин температура на входе заход 275 ° C и что из источника при 300 ° C. Запустить анализ (инъекции: 1 мкл), постепенно увеличивая температуру печи следующим: 110 ° C в течение 1 мин; первый градиент 2 ° C/мин до 154 ° C; второй градиент 5 ° C/мин до 300 ° C; поддержание температуры на 300 ° C в течение 10 мин.
      5. Процедура обнаружения: Для каждого режима деривации придать образца (в 1 мкл) в режиме СКАНИРОВАНИЯ с положительный электрон отдачи ионизации в 70 eV и принять к сведению время хранения каждой аминокислоты.
      6. Использовать эти значения для определения времени windows на протяжении Хроматограмма и для различных отдельных ионов, которые являются характерным каждой аминокислоты и перечисленных в таблице 3; Эти значения должны быть включены для каждой аминокислоты. Включить эту информацию в программе обнаружения SIM и запустите анализ в режиме SIM с ионизацией воздействия положительный электрон в 70 eV.
   2. Собирать результаты анализов; а именно для каждой аминокислоты, запись кластера интенсивности, которые соответствуют его различных массовых isotopomers. Обработка данных с использованием dedicatedsoftware¹⁷ исправить для естественных маркировки и рассчитать изотопного обогащения proteinogenic аминокислот (определяемой как помечены фракция аминокислоты в отношении ее сумму в протеине образцы).
      Примечание: Изотопного обогащения молекулы (т.е.), выраженный в процентах, рассчитывается разделительных сумма исправленной интенсивность массовых isotopomers с маркировки (m₁, m₂,...m_n) на сумму исправлениями интенсивностей всех массовых isotopomers (m₀,₁m, m₂,..._nm):
      I. E. = (m₁ + m₂ +... + m_n) / (m₀ +₁m + m₂ +... +_nm)

5. Количественная оценка и изотопного обогащения летучих соединений

1. Извлечение помечены летучих соединений
   1. 10 мкл транс внутренних стандартов до 5 мл супернатант (конечная концентрация транс соединений: 100 мкг/Л) в 15 мл стеклянной трубки. Добавьте 1 mL дихлорметан, плотно закройте трубы и встряхнуть их на качающейся платформе для 20 мин центрифуги для 5 мин на 3000 x g и собирать этапа органических ниже в 15 мл стеклянной трубки. Повторите дихлорметан добычи.
   2. Органический экстракт свыше 500 мг безводный сульфат натрия и собирать жидкой фазы с пипетки Пастера. Концентрат экстракта в четыре раза под флюсом азота и перенести его на флаконе Автоматический пробоотборник GC.
2. GC-MS количественное определение летучих соединений
   1. Оборудовать газовый хроматограф с 30 м х 0,25 мм кварцевое капиллярной колонки пленки толщиной 0,25 мкм и применять постоянно гелиевый поток 1,0 мл/мин удерживайте инжектора и линии передачи на 250 ° C.
   2. Придать 2 мкл пример с Сплит соотношении 10:1 и отделить извлеченные летучих молекул с помощью следующего профиля температуры духовки: держать температуру 3 мин при 40 ° C, увеличить его на 4 ° C/мин до 220 ° C и затем удерживайте духовке при 220 ° C для 20 мин.
   3. Обнаружить соединений с помощью масс-спектрометра с его источник температуры установлен на 230 ° C и температурой квадрупольный масс-спектрометр на 150 ° C. Запись массы спектры в режиме мониторинга выбранных Ион (SIM) с ионизацией положительный электрон воздействия на 70 eV и использование кластеров Ион конкретных летучих соединений, которые приведены в таблице 4.
   4. Использование внешнего 7-точечная калибровка для количественного определения концентрации летучих молекул из сумм интенсивность соответствующего кластера Ион. Подготовка запасов решения каждого комплекса (10 г/Л) в 100% этанола. Затем подготовьте стандартные решения для каждого класса летучих молекул (этиловый эфиры, ацетаты, спирты и кислоты) путем смешивания запасов решения. Наконец разбавляют различное количество стандартных решений в 12% водноспиртовой раствор, содержащий винной кислоты 5 г/Л с pH, скорректированы до 3,3 подготовить калибровочные растворы.
   5. Параллельно исправить для естественной маркировки интенсивности каждого иона кластера и рассчитать изотопного обогащения летучих соединений, которая определяется как Приклеенные этикетку часть молекулы и выражается в процентах, с помощью специализированного программного обеспечения ¹⁷.

6. расчеты для комплексного анализа набора данных

1. Сбор исходных данных
   1. С использованием таблиц, показано в таблицах 5, 6, 7 и 8, введите значения необработанных данных, которые соответствуют концентрации внеклеточного аминокислоты, сухой вес клеток, содержание белка клеток, концентрация летучих молекул и изотопные обогащение proteinogenic аминокислоты и неустойчивых молекул.
      Примечание: Данные, приведенные в таблицах выражается в мм. Все результаты выражаются также в мг/Л путем умножения значения в мм молекулярный вес каждой молекулы или мг N/Л, умножив атомная масса азота millimolar концентрация proteinogenic аминокислоты (14 u) и на количество азота АТО MS, которые предоставляются катаболизма этой молекулы.
   2. Вычислить массовые доли каждой аминокислоты белков путем деления суммы в мг/Л в гидролизат общее количество аминокислот (их сумма в мг/Л).
   3. Расчет средств, стандартных отклонений и стандартные ошибки означают от данных, которые были получены в независимых экспериментах.
   4. Рассчитать proteinogenic концентрация (мг/Л) для каждой аминокислоты путем умножения доли этой аминокислоты в белки (мг АА/g белки), белковых фракций в биомассе (белки г/DW) и содержание сухого веса (биомассы) в Средний (g DW/Л).
2. ¹⁵ N изотопный трассирующими эксперименты
   1. Вычисления с использованием таблиц, которые представлены в таблице 9, маркировку и непомеченного фракции азота, которые присутствуют в proteinogenic аминокислоты (выражается в мг N/Л) от их общей концентрации (выражается в мг N/Л) и их изотопного обогащения. Для каждой аминокислоты обозначенные фракция соответствует продукт между его общая концентрация и изотопного обогащения, и немеченого часть является разница между общей и помечены сумм.
   2. Затем определить долю общего азота в белки, содержащиеся в proteinogenic аминокислоты, количественно суммирования общее количество Ала, Gly, Валь, Asp, Phe, леи, Иль, Чет, Ser, Pro, Lys, его, Glu и Arg (в мг N/Л) и деления общей суммы в этом исследовании Гора азота, содержащихся в белках эту сумму.
   3. Вычислить азота, аргинин, глютамин или аммония, которая была восстановлена в proteinogenic кислот, количественно в этом исследовании путем суммирования помечены фракции (в мг N/Л) proteinogenic аминокислот, которые были количественно в исследовании (Ала, Gly, Валь, Asp, Пластинчатые теплообменники, леи, Иль, Чет, Ser, Pro, Lys, его, Glu и Arg) во время экспериментов в присутствии ¹⁵N-меченых аргинин, глютамин, или аммония и деления этой фракции помечены азота на общее количество азота в количественных proteinogenic аминокислот кислоты.
   4. Оценить вклад 3 наиболее распространенных аминокислот в внутриклеточного пул азота используется для биосинтеза de novo путем объединения данных из ¹³C и ¹⁵N изотоп трассирующими экспериментов (таблицы в таблицу 7).
   5. Из общей суммы (выраженная в мм) proteinogenic вал, леи, Иль или Чет, вычитать часть производная от прямого включения потребляемых соединений (¹³C эксперименты) и та часть, которая была синтезированный de novo с помощью азота от 3 Основные источники для того, чтобы оценить долю, что синтезированный de novo с помощью азота из других аминокислот.
   6. Затем рассчитайте отношение количества аминокислоты de novo синтезированный с помощью азота, предоставляемые Gln, Arg и NH₄⁺ (сумма, выраженная в мм) на общую сумму proteinogenic аминокислот (в мм) для количественной оценки вклада аргинин, глютамин и аммония в внутриклеточного азота пул.
3. ¹³ C изотопный трассирующими эксперименты
   1. Вычислить маркировку и непомеченного фракций proteinogenic аминокислот от концентрации, выраженная в мм и изотопного обогащения proteinogenic аминокислот, которые были получены в ходе экспериментов в присутствии ¹³C-меченых леи, вал, Иль или чет. (см. 6.2.1, Таблица 10).
   2. Вычислить маркировку и непомеченного доли летучих соединений от концентрации, выраженная в мм и изотопного обогащения летучих соединений, которые были получены в ходе экспериментов в присутствии ¹³C-меченых леи, Валь, Иль или чет ( Таблица 10).

Результаты

На рисунке 3 представлена схема рабочего процесса, который был реализован для расследования Управление дрожжей несколько источников азота, которые находятся в процессе брожения вина.
Для различных точек выборки, характеристики биологических параме...

Обсуждение

Количественная оценка разбиения соединений через метаболических сетей с использованием изотопных трассирующими экспериментов является перспективным подходом для понимания функционирования микробного метаболизма. Эта методология, в то время как успешно применяется с одним или дву?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
D-Glucose	PanReac	141341.0416
D-Fructose	PanReac	142728.0416
DL-Malic acid	Sigma Aldrich	M0875
Citric acid monohydrate	Sigma Aldrich	C7129
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P5379
Potassium sulfate	Sigma Aldrich	P0772
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	230391
Calcium chloride dihydrate	Sigma Aldrich	C7902
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S9625
Ammonium chloride	Sigma Aldrich	A4514
Sodium hydroxide	Sigma Aldrich	71690
Manganese sulfate monohydrate	Sigma Aldrich	M7634
Zinc sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	Z4750
Copper (II) sulfate pentahydrate	Sigma Aldrich	C7631
Potassium iodine	Sigma Aldrich	P4286
Cobalt (II) chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	C3169
Boric acid	Sigma Aldrich	B7660
Ammonium heptamolybdate	Sigma Aldrich	A7302
Myo-inositol	Sigma Aldrich	I5125
D-Pantothenic acid hemicalcium salt	Sigma Aldrich	21210
Thiamine, hydrochloride	Sigma Aldrich	T4625
Nicotinic acid	Sigma Aldrich	N4126
Pyridoxine	Sigma Aldrich	P5669
Biotine	Sigma Aldrich	B4501
Ergostérol	Sigma Aldrich	E6510
Tween 80	Sigma Aldrich	P1754
Ethanol absolute	VWR Chemicals	101074F
Iron (III) chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	236489
L-Aspartic acid	Sigma Aldrich	A9256
L-Glutamic acid	Sigma Aldrich	G1251
L-Alanine	Sigma Aldrich	A7627
L-Arginine	Sigma Aldrich	A5006
L-Cysteine	Sigma Aldrich	C7352
L-Glutamine	Sigma Aldrich	G3126
Glycine	Sigma Aldrich	G7126
L-Histidine	Sigma Aldrich	H8000
L-Isoleucine	Sigma Aldrich	I2752
L-Leucine	Sigma Aldrich	L8000
L-Lysine	Sigma Aldrich	L5501
L-Methionine	Sigma Aldrich	M9625
L-Phenylalanine	Sigma Aldrich	P2126
L-Proline	Sigma Aldrich	P0380
L-Serine	Sigma Aldrich	S4500
L-Threonine	Sigma Aldrich	T8625
L-Tryptophane	Sigma Aldrich	T0254
L-Tyrosine	Sigma Aldrich	T3754
L-Valine	Sigma Aldrich	V0500
13C5-L-Valine	Eurisotop	CLM-2249-H-0.25
13C6-L-Leucine	Eurisotop	CLM-2262-H-0.25
15N-Ammonium chloride	Eurisotop	NLM-467-1
ALPHA-15N-L-Glutamine	Eurisotop	NLM-1016-1
U-15N4-L-Arginine	Eurisotop	NLM-396-PK
Ethyl acetate	Sigma Aldrich	270989
Ethyl propanoate	Sigma Aldrich	112305
Ethyl 2-methylpropanoate	Sigma Aldrich	246085
Ethyl butanoate	Sigma Aldrich	E15701
Ethyl 2-methylbutanoate	Sigma Aldrich	306886
Ethyl 3-methylbutanoate	Sigma Aldrich	8.08541.0250
Ethyl hexanoate	Sigma Aldrich	148962
Ethyl octanoate	Sigma Aldrich	W244910
Ethyl decanoate	Sigma Aldrich	W243205
Ethyl dodecanoate	Sigma Aldrich	W244112
Ethyl lactate	Sigma Aldrich	W244015
Diethyl succinate	Sigma Aldrich	W237701
2-methylpropyl acetate	Sigma Aldrich	W217514
2-methylbutyl acetate	Sigma Aldrich	W364401
3-methyl butyl acetate	Sigma Aldrich	287725
2-phenylethyl acetate	Sigma Aldrich	290580
2-methylpropanol	Sigma Aldrich	294829
2-methylbutanol	Sigma Aldrich	133051
3-methylbutanol	Sigma Aldrich	309435
Hexanol	Sigma Aldrich	128570
2-phenylethanol	Sigma Aldrich	77861
Propanoic acid	Sigma Aldrich	94425
Butanoic acid	Sigma Aldrich	19215
2-methylpropanoic acid	Sigma Aldrich	58360
2-methylbutanoic acid	Sigma Aldrich	193070
3-methylbutanoic acid	Sigma Aldrich	W310212
Hexanoic acid	Sigma Aldrich	153745
Octanoic acid	Sigma Aldrich	W279900
Decanoic acid	Sigma Aldrich	W236403
Dodecanoic acid	Sigma Aldrich	L556
Fermentor 1L	Legallais	AT1357	Fermenter handmade for fermentation
Disposable vacuum filtration system	Dominique Deutscher	029311
Fermenters (250 ml)	Legallais	AT1352	Fermenter handmade for fermentation
Sterile tubes	Sarstedt	62.554.502
Fermentation locks	Legallais	AT1356	Fermetation locks handmade for fermentation
BactoYeast Extract	Becton, Dickinson and Company	212750
BactoPeptone	Becton, Dickinson and Company	211677
Incubator shaker	Infors HT
Particle Counter	Beckman Coulter	6605697	Multisizer 3 Coulter Counter
Centrifuge	Jouan		GR412
Plate Butler Robotic system	Lab Services BV	PF0X-MA	Automatic instrument
Plate Butler Software	Lab Services BV		Robot monitor software
RobView			In-house developed calculation software
My SQL			International source database
Cimarec i Telesystem Multipoint Stirrers	Thermo Fisher Scientific	50088009	String Drive 60
BenchBlotter platform rocker	Dutscher	60903
Ammonia enzymatic kit	R-Biopharm AG	5390
Spectrophotometer cuvettes	VWR	634-0678
Spectrophotometer UviLine 9400	Secomam
Amino acids standards physiological - acidics and neutrals	Sigma Aldrich	A6407
Amino acids standards physiological - basics	Sigma Aldrich	A6282
Citrate lithium buffers - Ultra ninhydrin reagent	Biochrom	BC80-6000-06
Sulfosalycilic acid	Sigma Aldrich	S2130
Norleucine	Sigma Aldrich	N1398
Biochrom 30 AAA	Biochrom
EZChrom Elite	Biochrom		Instrument control and Data analysis software
Ultropac 8 resin Lithium	Biochrom	BC80-6002-47	Lithium High Resolution Physiological Column
Filter Millex GV	Merck Millipore	SLGVX13NL	Millex GV 13mm (pore size 0.22 µm)
Membrane filter PALL	VWR	514-4157	Supor-450 47mm 0.45µm
Vacuum pump Millivac Mini	Millipore	XF5423050
Aluminium smooth weigh dish 70mm	VWR	611-1380
Precision balance	Mettler		Specifications AE163
Dimethyl sulfoxid dried	Merck	1029310161	(max. 0.025% H2O) SeccoSolv
Combustion oven	Legallais
Pierce BCA protein assay kit	Interchim	UP40840A
Formic acid	Fluka	94318
Hydrogen peroxide	Sigma Aldrich	H1009
Hydrochloric Acid Fuming 37% Emsure	Merck	1003171000	Grade ACS,ISO,Reag. Ph Eur
Lithium acetate buffer	Biochrom	80-2038-10
Commercial solution of hydrolyzed amino acids	Sigma Aldrich	AAS18
L-Methionine sulfone	Sigma Aldrich	M0876
L-Cysteic acid monohydrate	Sigma Aldrich	30170
Pyrex glass culture tubes	Sigma Aldrich	Z653586
Pyridine	Acros Organics	131780500	99% Extrapure
Ethyl chloroformate	Sigma Aldrich	23131
Dichloromethane	Sigma Aldrich	32222
Vials	Sigma Aldrich	854165
Microinserts for 1.5ml vials	Sigma Aldrich	SU860066
GC/MS	Agilent Technologies	5890 GC/5973 MS
Chemstation	Agilent Technologies		Instrument control and data analysis software
Methanol	Sigma Aldrich	34860	Chromasolv, for HPLC
Acetonitrile	Sigma Aldrich	34998	ChromasolvPlus, for HPLC
N,N-Dimethylformamide dimethyl acetal	Sigma Aldrich	394963
BSTFA	Sigma Aldrich	33024
DB-17MS column	Agilent Technologies	122-4731	30m*0.25mm*0.15µm
Sodium sulfate, anhydrous	Sigma Aldrich	238597
Technical nitrogen	Air products	14629
Zebron ZB-WAX column	Phenomenex	7HG-G007-11	30m*0.25mm*0.25µm
Helium BIP	Air products	26699
Glass Pasteur pipettes	VWR	612-1702