Flux de travail basé sur la combinaison de traceur isotopique des expériences pour étudier le métabolisme microbien de multiples Sources d’éléments nutritifs

Résumé

Ce protocole décrit une procédure expérimentale pour quantitativement et complètement étudier le métabolisme de plusieurs sources d’éléments nutritifs. Ce flux de travail, basé sur une combinaison d’expériences de traceur isotopique et une méthode d’analyse, permet le sort des nutriments consommés et l’origine métabolique des molécules synthétisée par des microorganismes à déterminer.

Résumé

Études dans le domaine de la microbiologie s’appuient sur la mise en œuvre d’un large éventail de méthodes. En particulier, le développement de méthodes appropriées contribue substantiellement à fournir une connaissance approfondie du métabolisme des microorganismes qui poussent dans des milieux chimiquement définis contenant l’azote unique et sources de carbone. En revanche, la gestion par le métabolisme de plusieurs sources d’éléments nutritifs, malgré leur large présence dans des environnements naturels ou industriels, demeure pratiquement inexplorée. Cette situation est principalement due au manque de méthodologies appropriées, qui entrave les enquêtes.

Nous rapportons une stratégie expérimentale quantitativement et complètement explorer comment le métabolisme fonctionne lorsqu’un nutriment est fourni comme un mélange de molécules différentes, par exemple, une ressource complexe. Nous décrivons ici son application pour l’évaluation de la répartition des multiples sources d’azote à travers le réseau métabolique de la levure. Le flux de travail combine l’information obtenue au cours d’expériences de traceur isotopique à l’aide de sélectionné ¹³C - ou des substrats marqués au N ¹⁵. Tout d’abord, il se compose des fermentations parallèles et reproductibles dans le même milieu, qui comprend un mélange de molécules contenant du N ; Toutefois, une source d’azote sélectionné est étiquetée chaque fois. Une combinaison des méthodes analytiques (HPLC, GC-MS) est mis en place pour évaluer les modèles étiquetage des composés ciblés et de quantifier la consommation et la récupération des substrats dans les autres métabolites. Une analyse intégrée de l’ensemble de données complet donne un aperçu du sort des substrats consommés dans les cellules. Cette approche nécessite un protocole précis pour la collecte d’échantillons – facilité par un système assistée par robot de surveillance en ligne des fermentations – et la réalisation de nombreuses analyses fastidieuses. Malgré ces contraintes, elle a permis de comprendre, pour la première fois, la séparation des multiples sources d’azote dans tout le réseau métabolique de la levure. Nous avons élucidé la redistribution d’azote provenant de sources plus abondantes vers autres composés N et déterminé l’origine métabolique des molécules volatiles et acide aminé.

Introduction

Comprendre comment opère de métabolisme microbien est une question clé pour la conception de stratégies efficaces pour améliorer les procédés de fermentation et de moduler la production de composés par fermentation. Progrès de la génomique et de la génomique fonctionnelle dans ces deux dernières décennies a largement contribué à étendre la connaissance de la topologie des réseaux métaboliques de nombreux micro-organismes. Accès à ces informations a conduit à l’élaboration d’approches qui visent pour un aperçu complet de la fonction cellulaire¹. Ces méthodes reposent souvent sur une interprétation basée sur des modèles de paramètres mesurables. Ces données expérimentales comprennent, d’une part, le taux d’absorption et de la production métabolite et, d’autre part, des renseignements quantitatifs intracellulaires qui sont obtenus à partir de traceur isotopique expériences. Ces données fournissent des renseignements essentiels pour la déduction de l’activité in vivo des voies différentes dans un réseau métabolique défini^2,3,4. Actuellement, les techniques analytiques disponibles uniquement permettent la détection précise de l’étiquetage des modèles de molécules lors de l’utilisation d’un isotope de l’élément unique et, éventuellement, lors de l’étiquetage conjointement avec deux éléments isotopiques. En outre, dans la plupart des conditions de croissance, la source de carbone se compose uniquement d’un ou de deux composés. Par conséquent, les approches fondées sur les traceurs isotopiques-C ¹³de substrats carbonés ont été largement et avec succès appliquées pour développer une compréhension complète du carbone réseau métabolique opérations^{5,6,7 ,},⁸.

En revanche, dans de nombreux environnements naturels et industriels, la ressource d’azote disponible qui prend en charge la croissance microbienne est souvent composée d’une large gamme de molécules. Par exemple, au cours de la fermentation de la bière ou vin, azote est fournie comme un mélange de 18 acides aminés et d’ammonium à concentrations variables⁹. Cet éventail de composés azotés qui sont accessibles pour l’anabolisme rend ces conditions de milieux complexes considérablement différentes de celles utilisées pour les études physiologiques, comme ces derniers sont réalisés à l’aide d’une unique source d’azote, généralement d’ammonium.

Dans l’ensemble, intériorisé azote composés peuvent être directement incorporés dans les protéines ou catabolisés. La structure du réseau du métabolisme de l’azote dans beaucoup de micro-organismes, y compris la levure Saccharomyces cerevisiae, est très complexe selon la diversité des substrats. Schématiquement, ce système repose sur la combinaison du noyau central du métabolisme de l’azote qui catalyse l’interconversion de glutamine, glutamate et^10,α-cétoglutarate¹¹, avec les transaminases et DÉSAMINASES. Grâce à ce réseau, groupes amines d’ammonium ou d’autres acides aminés sont regroupés et acides α-cétoniques libérés. Ces intermédiaires sont également synthétisée par le carbone central du métabolisme (CCM)^12,13. Ce grand nombre de réactions ramifiées et intermédiaires, intervenant dans le catabolisme des sources d’azote exogène et l’anabolisme de l’acide aminé, remplit les exigences anaboliques des cellules. L’activité à travers ces différentes routes interconnectées se traduit également par l’excrétion des métabolites. En particulier, les acides α-cétoniques sont redirigés par la voie d’Ehrlich pour produire des alcools supérieurs et leur acétate ester dérivés¹⁴, qui contribuent de façon essentielle aux profils sensoriels des produits. Par la suite, le fonctionne du métabolisme de l’azote joue un rôle clé dans la production de biomasse et de la formation de molécules volatiles (arôme).

Les réactions, les enzymes et les gènes impliqués dans le métabolisme de l’azote sont largement décrits dans la littérature. Toutefois, la question de la répartition des multiples sources d’azote dans l’ensemble un réseau métabolique n’a pas encore été abordée. Il y a deux raisons principales qui expliquent ce manque d’information. Tout d’abord, compte tenu de la complexité importante du réseau du métabolisme d’azote, une grande quantité de données quantitatives est nécessaire pour une compréhension complète de son fonctionnement qui n’était pas disponible jusqu’ici. Deuxième, nombreuses contraintes expérimentales et les limitations des méthodes d’analyse ont empêché la mise en œuvre des approches qui ont déjà été utilisées pour l’élucidation de la fonction CCM.

Pour résoudre ces problèmes, nous avons choisi de développer une approche au niveau du système qui repose sur le rapprochement des données d’une série d’expériences de traceur isotopique. Le workflow comporte :
-Un ensemble de fermentations effectué dans les mêmes conditions environnementales, alors qu’une autre source de nutriments sélectionnée (substrat) est étiquetée chaque fois.
-Une combinaison des méthodes analytiques (HPLC, GC-MS) pour une détermination précise, à différentes étapes de la fermentation, de la concentration résiduelle de substrat marqué et la concentration et l’enrichissement isotopique de composés dérivés de le catabolisme de la molécule marquée, y compris les dérivés de la biomasse.
-Un calcul du solde pour chaque masse et isotopique consommé molécule marquée et une analyse intégrée de l’objet dataset afin d’obtenir une vision globale de la gestion de multiples sources d’éléments nutritifs par les microorganismes grâce à la détermination des ratios de flux .

Pour appliquer cette méthode, il faut au comportement reproductible du micro-organisme/souche entre les cultures. En outre, les échantillons provenant de cultures différentes doivent être prises pendant le déroulement de la fermentation bien définis même. Dans les travaux expérimentaux rapporté dans ce manuscrit, un système assistée par robot est utilisé pour le suivi en ligne des fermentations pour tenir compte de ces contraintes.

En outre, il est essentiel de choisir une série de substrats marqués (composé, nature et position de l’étiquette) qui est appropriée régler le problème scientifique de l’étude. Ici, arginine, glutamine et ¹⁵N-étiqueté d’ammonium ont été sélectionnés comme les trois sources principales d’azote trouvés dans du jus de raisin. Cela a permis d’évaluer le modèle de redistribution d’azote de composés consommés à l’acide aminé. L’étude visait aussi à enquêter sur le sort de l’épine dorsale de carbone des acides aminés consommés et leur contribution à la production de molécules volatiles. Pour atteindre cet objectif, uniformément ¹³C marqué leucine, isoleucine, thréonine et valine ont été inclus dans l’étude comme les acides aminés dérivés de grands intermédiaires de la voie de Ehrlich.

Dans l’ensemble, nous avons étudié quantitativement comment levure gère une ressource complexe d’azote en redistribuant les sources d’azote exogène pour satisfaire ses exigences anabolisants pendant toute la fermentation tout en éliminant en outre l’excès de précurseurs de carbone comme molécules volatiles. La procédure expérimentale présentée dans cet article peut être appliquée afin d’étudier les autres sources d’éléments nutritifs multiples utilisés par tout autre micro-organisme. Il semble être une approche appropriée pour l’analyse de l’impact du bagage génétique ou des conditions environnementales sur le comportement métabolique des micro-organismes.

Protocole

1. la fermentation et l’échantillonnage

1. Préparation des supports et des fermenteurs
   Remarque : Toutes les fermentations sont effectuées en parallèle, à l’aide de la même souche et dans le même chimiquement définies milieu synthétique (SM, composition fournie dans le tableau 1), qui comprend un mélange d’ammonium et d’acides aminés comme sources d’azote¹⁵. Pour chaque fermentation, un composé unique d’azote est fourni exclusivement dans un uniforme marqué ¹³C ou formulaire ¹⁵N (100 %), tandis que les autres restent sans étiquette. Pour chaque source d’azote marqué qui est utilisé dans la série d’expériences (ici : ¹⁵NH₄, U -¹⁵N4-Arg, U -¹⁵N2-Gln, U -¹³C6-Leu, U -¹³C5-Val, U -¹³C6-Ile, U -¹³C4-Thr), deux fermenteurs sont préparés. Pour chaque condition, double fermentation est effectuée en utilisant seulement des molécules non étiquetés (fermentations contrôle 7).
   1. Pour chaque source d’azote étudier, de préparer 500 mL de SM moyen qui contient toutes les sources d’azote répertoriés dans le tableau 1, à l’exception du composé qui serviront au 100 % étiquetés forme.
      Remarque : La molécule marquée est ajoutée dans les prochaines étapes.
   2. Pasteuriser chaque média dans un ballon jaugé de 1 L (10 min, 100 ° C) contenant une barre magnétique. Peser la quantité appropriée de la molécule marquée pour atteindre la concentration finale indiquée dans le tableau 1 et les dissoudre dans le milieu.
   3. Stériliser le milieu à l’aide d’un système de filtration sous vide jetables (membrane de l’acétate de cellulose, 0,22 µm). À l’aide d’une éprouvette graduée stérile, diviser le milieu entre deux préstérilisés fermenteurs (250 mL) qui contiennent une barre magnétique et sont équipées de serrures de fermentation pour éviter l’entrée d’oxygène mais de permettre la libération de CO₂.
   4. Faire chauffer les fioles de fermentation à 28 ° C en les plaçant dans la salle d’incubation pour 1 nuit (température réglée à 28 ° C).
2. L’inoculation et le suivi des fermentations
   1. Cultiver la souche de S. cerevisiae dans des tubes stériles contenant 10 mL de milieu YPD à 28 ° C sous agitation (150 tr/min) pendant 12 h. Puis, pipette de 1 mL de la DPJ préculture et transférez-la à 10 mL de milieu SM (dans des tubes stériles 15 mL). Incuber la culture pendant 12 h à 28 ° C sous agitation (150 tr/min).
   2. Sous flux laminaire, recueillir une préculture aliquote et quantifier la population de cellules à l’aide d’un compteur de particules électronique qui est muni d’une ouverture de µm 100. Centrifuger la préculture (2 000 x g, 15 min, 4 ° C) et suspendre le culot dans un volume approprié d’eau stérile pour obtenir une concentration finale de 2. 5 x 10⁸ cellules/mL. Inoculer chaque fermenteur avec 1 mL de la suspension cellulaire.
      Remarque : Le système robotisé utilisé pour surveiller la progression de la fermentation est décrite à la Figure 1.
   3. Préparer la plateforme de fermentation en installant les fermenteurs dans les guides de prise en charge qui sont correctement placés sur les plaques en remuant 21 broches et fixer le taux d’agitation à 270 t/mn. Pour démarrer le contrôle en ligne de chaque fermentation, lancez l’application robot-contrôle, puis cliquez sur le bouton « start test » et sélectionnez le volume de fermentation à effectuer (300 mL).
   4. L’interface affichée permet l’indication du nombre et la position des fermenteurs sur la plate-forme. Afin d’assurer dans ce cas, faites un clic droit sur l’emplacement de la fente et choisir « activer » pour activer le suivi de la cuve de fermentation que se trouvant à cet emplacement.
   5. Initialiser le logiciel de calcul, en permanence en cours d’exécution sur le système, avant de commencer l’acquisition de poids. Cliquez sur le bouton « Initialiser », puis validez avec « OK ». Cliquez sur le bouton « Start » de la demande de robot-contrôle pour démarrer l’acquisition de poids.
3. Procédure d’échantillonnage
   Remarque : Pour chaque cuve, échantillons sont prélevés lors de la production de₂ CO (mis en ligne sur l’ordinateur exécutant le logiciel de calcul de valeur) atteint la consigne obligatoire : 5, 10, 40 et 90 g/L dans cette étude.
   1. Procédure pour les cultures avec des composés marqués d’échantillonnage.
      1. Centrifuger les deux échantillons de 6 mL (2 000 x g, 5 min, 4 ° C). Enregistrer et de stocker les surnageants surgelées en deux parties aliquotes à-80 ° C. Laver les granules deux fois avec 5 mL d’eau distillée et conserver à-80 ° C pour la mesure de l’enrichissement isotopique.
   2. Procédure pour les cultures sans composés marqués d’échantillonnage
      1. Récolte 10 mL de la culture, qui sera utilisée pour la détermination de la masse sèche. Les cellules provenant de deux échantillons de 10 mL de granule par centrifugation (2 000 x g, 5 min, 4 ° C). Laver les granules deux fois avec 10 mL d’eau distillée et les stocker à-80 ° C pour la détermination de la teneur en protéines et acides aminés.

2. quantification des Sources d’azote consommé

1. Dosage enzymatique des concentrations résiduelles d’ammoniac
   NOTE : La détermination de la concentration d’ammoniac dans les surnageants s’effectue à l’aide d’une trousse commerciale axée sur l’enzyme ; tous les réactifs sont fournis par le fabricant.
   1. Préparer une solution d’ammoniaque standard (61,4 mg/L) en dissolvant 25 mg de précisément pesée (NH₄)₂donc₄ dans une fiole jaugée de 100 mL.
   2. Afin de respecter les instructions du fabricant, effectuer une dilution de 1 / 2 des échantillons qui ont été prises avant la fermentation et à 5 g/L de CO₂ sorti. Ajuster le pH des échantillons pour environ 8 en ajoutant 1 M KOH. Prendre note du volume ajouté et en tenir compte dans le facteur de dilution.
   3. Dans des cuvettes de spectrophotomètre de 4 mL, mélanger 100 µL de l’échantillon (diluer si nécessaire), l’eau distillée ou ammoniaque standard avec 2 mL de réactif 1 (0,75 mM ADP et glutamate déshydrogénase de 30 U/mL dans le tampon pH 7,8) et 500 µL de réactif 2 (NADH 1,3 mM). Incuber pendant 15 min à température ambiante et lire NADH absorbance à 340 nm (A1).
   4. Ajouter 500 µL de réactif 3 (60 mM α-cétoglutarate en tampon pH 8), incuber l’échantillon pendant 20 min à température ambiante, et lire l’absorbance du NADH à 340 nm (A2).
   5. Calculer à l’aide de la concentration de l’ammoniac :
      C_l’ammoniac (g/L) = 0,083 x [(0.839 x A1-A2)_échantillon- (0,839 x A1-A2)_{de l’eau distillée}]
   6. Vérifier que la concentration correcte est obtenue avec la solution étalon.
2. À toute détermination chromatographique des concentrations résiduelles d’acides aminés
   Remarque : La détermination des concentrations d’acides aminés dans les surnageants est réalisée en utilisant un système d’analyse dédié d’acides aminés qui repose sur la chromatographie échangeuse d’ions avec dérivation de colonne post de N-composés avec la ninhydrine, ce qui permet leur détection colorimétrique.
   1. Préparer une solution de référence en ajoutant 200 µL d’un mélange commercial d’acides aminés neutres et acides, 200 µL d’un mélange commercial d’acides aminés basiques et 200 µL de 2,5 mM de glutamine à 400 µL de tampon de 200 mM au lithium citrate, pH 2.2. Cette solution de référence chimiquement défini est considérée comme un échantillon.
   2. Ajouter 200 µL de solution d’acide sulfosalicylique 25 % (p/v) contenant 2,5 mM norleucine (étalon interne) à 800 µL de l’échantillon pour éliminer les molécules de hauts poids moléculaire. Incuber pendant 1 h à 4 ° C, centrifugeuse (3 000 x g, 10 min, 4 ° C) et le filtre à travers une membrane de nitrocellulose de pores de 0,22 µm (système de seringue).
   3. Dans le logiciel de programmeur, cliquez sur le bouton « Exécuter » pour commencer la chromatographie liquide analyses (LC) avec l’analyseur équipé d’une colonne échangeuse de cations (forme de lithium). Éluer les acides aminés avec tampons successifs au lithium pour créer un gradient de pH et du gradient de concentration contre-ion en combinaison avec un gradient de température (tableau 2).
   4. Quantifier les composés d’azote après dérivatisation de ninhydrine par un détecteur spectrophotométrique à 570 nm (violet coloration : réaction entre le groupe de ninhydrine et amine des acides aminés) et 440 nm (jaune de coloration : réaction entre le groupe de ninhydrine et imine proline).
   5. Effectuer un calibrage interne de point unique à l’aide de la solution de référence et le norleucine comme étalon interne pour calculer les concentrations des acides aminés dans des échantillons à l’aide du logiciel du fabricant.

3. quantification de l’acide aminé

1. Mesure du poids de la pile sèche
   1. Filtrer sur un filtre de nitrocellulose (pore taille 0,45 µm) qui est préalablement pesé dans une tasse en aluminium, en utilisant un dispositif à dépression 10 mL de la culture. Laver deux fois avec 50 mL d’eau distillée.
   2. Placez le filtre dans la coupe de l’aluminium et les sécher dans un four à chaleur à 105 ° C pendant 48 h (jusqu'à ce qu’aucun autre changement dans le poids n’est observée) avant la contre-expertise le filtre dans la coupe. Calculer la différence de poids.
   3. Calculer la moyenne d’au moins 3 mesures indépendantes pour déterminer avec exactitude le poids de la pile sèche de la culture de levure.
2. Quantification de la teneur en protéines des cellules
   Remarque : La quantification de la fraction protéique des cellules s’effectue au moins en trois exemplaires à l’aide de pastilles de cellule non étiquetés qui ont été obtenues comme décrit dans la section 1.3.2.
   1. Extraire des protéines par l’addition de 1 mL de solution de DMSO (50 % v/v) à boulettes congelées et incuber à 105 ° C pendant 1 h dans un four à chaleur sèche.
   2. Quantifier la teneur en protéines dans les extraits de DMSO utilisant le test colorimétrique biochimique qui repose sur la réduction de protéines de Cu⁺⁺ en ions Cu⁺ qui sont plus précipitées par l’acide bicinchoninic dans un complexe bleu (essai de BCA).
3. Détermination de la contribution relative des acides aminés dans les protéines
   NOTE : Le profil d’acide aminé est déterminé au moins en triple exemplaire de pastilles de cellule sans étiquette (1.3.2.).
   1. Préparer un extrait oxydé en suspendant le culot cellulaire dans 200 µL d’acide performique (acide formique à 90 %, 10 % d’eau oxygénée). Incuber pendant 4 heures à 4 ° C et arrêter la réaction par l’addition de 33,6 mg de sulfate de sodium.
      Remarque : L’étape d’oxydation est nécessaire pour convertir les cystéine et méthionine méthionine sulfone et cystéique acide qui est davantage quantifié par chromatographie échangeuse d’ions. Cependant, certains acides aminés (tyrosine, phénylalanine, histidine et arginine) sont dénaturées pendant le traitement d’oxydation. Par conséquent, deux hydrolysats (avec ou sans oxydation) sont préparés.
   2. Ajouter 800 µL de HCl 6N à pastilles de cellule ou oxydé extrait et incuber l’échantillon dans un tube de verre hermétiquement fermés pendant 16 h à 110 ° C dans un four à chaleur sèche. Ajouter 200 µL de norleucine 2,5 mM et retirez le HCl dans un courant d’azote. Laver (resuspendant extrait sec et ensuite enlever le liquide avec un courant d’azote) deux fois avec 800 µL d’eau distillée, puis avec 800 µL d’éthanol. Devoir attendre jusqu'à 800 µL de tampon d’acétate de 200 mM au lithium, pH 2.2.
      NOTE : Convient pour le temps d’incubation pour l’hydrolyse que certains acides aminés ne sont pas stables dans des conditions acides. La fraction de tryptophane en protéines est estimée à partir de données trouvées dans la littérature¹⁶, que cet acide aminé est totalement dénaturé au cours de l’hydrolyse de HCl.
   3. Élaborer une norme de l’hydrolysat d’étalonnage interne monopoint. Ajouter 160 µL d’une solution commerciale d’hydrolyses acides aminés à 840 µL de tampon d’acétate de 200 mM au lithium, pH 2.2, qui contient 625 µM méthionine sulfone, 625 acide cystéique µM et 625 µM norleucine.
   4. Déterminer les concentrations relatives des acides aminés dans les protéines à l’aide de la méthode chromatographique décrite au paragraphe 2.2.
4. Calculs
   1. Calculer le pourcentage en poids de chaque acide aminé dans les protéines en divisant la quantité de chaque acide aminé (mg/L) mesurée par le nombre total d’acide aminé qui a été mesuré dans l’extrait de protéine (somme en mg/L).
   2. Multiplier cette proportion par la concentration des protéines dans la culture (mg/L), c'est-à-dire, le produit entre la teneur en protéines de la biomasse et le poids sec, pour évaluer la concentration de chaque acide aminé acide dans la culture (mg/L).

4. mesure de l’enrichissement isotopique de l’acide aminé

Remarque : Pour la mesure de l’enrichissement isotopique de l’acide aminé, utiliser des granulés de cellules marquées. Trois agents différents sont utilisés pour l’étape de dérivatisation pour quantifier l’enrichissement isotopique des acides aminés. Les intensités des groupes d’ions sont mesurées pour estimer les modèles de marquage des acides aminés. Le signal de chaque ion de cluster correspond à l’abondance des isotopomères masse (m₀ = sans étiquetage, m_{+ 1} = 1 atome étiquetée,...) d’un fragment d’acide aminé. Un exemple de chromatogramme obtenu après l’intervention DMADMF est fourni dans la Figure 2.

1. Hydrolyse de la biomasse
   1. Hydrolysent les granules cellulaires (correspondant à 1-2 mg de biomasse séchée) en ajoutant 1,2 mL de HCl de 6 M et d’incubation de l’échantillon pendant 16 h à 105 ° C dans des tubes de verre hermétiquement fermés dans un four à chaleur sèche.
   2. Ajouter 1,2 mL d’eau distillée et centrifuger à 3 000 x g pendant 5 min éliminer les débris cellulaires. Distribuer le liquide surnageant dans les fractions de 6 400 µL dans des tubes de verre ouvert. Sécher les fractions dans un four à chaleur à 105 ° C jusqu'à atteindre la consistance de sirop (4-5 h).
2. Dérivation Ethylchloroformate (ECF)
   1. Dissoudre l’hydrolysat séchée dans 200 µL de 20 mM HCl ; Ensuite, ajoutez 133 µL de pyridine : éthanol (1:4). Ajouter 50 µL de ECF derivatize les acides aminés et d’attendre que tous les CO₂ a été libéré. Transférer le mélange pour centrifuger les tubes qui contiennent 500 µL de dichlorométhane pour extraire les composés dérivés.
   2. Vortex les tubes pendant 10 s et centrifugeuse eux pendant 4 min à 10 000 x g ; recueillir la phase organique inférieure avec une pipette Pasteur et le transfert à des flacons de GC qui contiennent des insertions de verre conique afin que les échantillons peuvent être injectés directement dans l’instrument de GC/MS.
3. (N, N)-diméthylformamide dérivatisation de diméthyle acétal (DMFDMA).
   1. Dissoudre l’hydrolysat séchée dans 50 µL de méthanol et 200 µL d’acétonitrile. Ajouter 300 µL de DMFDMA. Vortex le tube et transfert les échantillons à GC autoéchantillonneur flacons qui contiennent des inserts de verre conique.
4. N, dérivatisation trifluoroacétamide (BSTFA) O-Bis (triméthylsilyl)
   1. Suspendre l’hydrolysat dans 200 µL d’acétonitrile. Ajouter 200 µL de BSTFA, fermer hermétiquement le tube en verre et incuber pendant 4 h à 135 ° C avant de transférer l’extrait directement dans les flacons de GC.
5. Analyse par CPG-SM
   1. Analyser des échantillons avec un chromatographe en phase gazeuse qui est équipé d’un injecteur automatique et est couplé à un spectromètre de masse.
      1. Logiciel spécifique à l’instrument permet de contrôler l’instrument et d’analyser les chromatogrammes. Dans le menu « Séquence », cliquez sur la « Table du journal échantillon » pour créer la liste et cliquez sur le bouton « Exécuter » pour démarrer les injections.
         Remarque : Le chromatographe en phase gazeuse est équipée d’une colonne capillaire en silice apolaire 30 m x 0,25 mm avec une épaisseur de film 0,15 μm. Réglez la température de spectromètre de masse quadripolaire 150 ° C et maintenir la ligne de transfert à 250 ° C pour toutes les analyses. Trois programmes analytiques, chaque un spécifique à chaque agent de dérivatisation, sont utilisés.
      2. Dérivés de l’ECF : Utilisation hélium comme phase mobile avec un débit de 1,2 mL/min. régler la température de l’entrée à 230 ° C et celle de la source à 250 ° C. Le programme de l’échantillonneur automatique à injecter 1 µL d’échantillons avec un rapport de 3:1 split. Exécuter les analyses, en augmentant graduellement la température du four comme suit : 130 ° C pendant 3 min ; pente de 15 ° C/min jusqu'à 260 ° C ; maintenir la température à 260 ° C pendant 20 min.
      3. Dérivés DMFDMA : Utilisation hélium comme phase mobile avec un débit constant de 1,2 mL/min. régler la température de l’entrée à 230 ° C et celle de la source à 250 ° C. Le programme de l’échantillonneur automatique à injecter 1 µL d’échantillons avec un rapport de 3:1 split. Exécuter les analyses, en augmentant graduellement la température du four comme suit : 60 ° C pendant 1 minute ; pente de 20 ° C/min à 130 ° C ; deuxième dégradé de 4 ° C/min jusqu'à 260 ° C ; maintenir la température à 260 ° C pendant 10 min.
      4. Dérivés BSTFA : Utilisation hélium comme phase mobile avec un débit constant de 1,2 mL/min. régler la température de l’entrée à 275 ° C et celle de la source à 300 ° C. Exécuter les analyses (injection : 1 µL), progressivement augmenter la température du four comme suit : 110 ° C pendant 1 min ; premier gradient de 2 ° C/min à 154 ° C ; deuxième pente de 5 ° C/min jusqu'à 300 ° C ; maintenir la température à 300 ° C pendant 10 min.
      5. Procédure de détection : Pour chaque mode de dérivation, injecter un échantillon (1 µL) en mode de balayage avec ionisation par impact de positif électronique à 70 eV et prendre note de la période de rétention de chaque acide aminé.
      6. Utilisez ces valeurs pour définir les fenêtres de temps tout au long du chromatogramme et pour les différents ions sélectionnées, qui sont caractéristiques de chaque acide aminé et répertoriés dans le tableau 3; ces valeurs doivent être inclus pour chaque acide aminé. Inclure cette information dans le programme de détection de SIM et exécuter les analyses en mode SIM avec ionisation par impact de positif électronique à 70 eV.
   2. Recueillir les résultats des analyses ; à savoir, pour chaque acide aminé, enregistrer un amas d’intensités qui correspondent à ses isotopomères de masse différents. Traiter les données à l’aide de la dedicatedsoftware¹⁷ à corriger pour l’étiquetage naturel et calculer l’enrichissement isotopique de l’acide aminé (définie comme la fraction marquée d’un acide aminé à l’égard de son montant total à la protéine échantillons).
      Remarque : L’enrichissement isotopique d’une molécule (c'est-À-dire), exprimée en pourcentage, est calculé divisant la somme des intensités corrigées des isotopomères massive avec étiquetage (m₁, m₂,.. .m_n) par la somme de la corrigée intensités de tous les isotopomères massives (m₀, m₁, m₂,..._n) :
      I. E. = (m₁ + m₂ +... +_n) / (m₀ m₁+ m₂ +... +_n)

5. quantification et l’enrichissement isotopique de composés volatils

1. Extraction de composés volatiles étiquetées
   1. Ajouter 10 µL de normes internes deutérés à 5 mL du surnageant (concentration finale de composés deutérés : 100 µg/L) dans un tube de verre de 15 mL. Ajouter 1 mL de dichlorométhane, bien fermer les tubes et secouez-les sur une plate-forme bascule pendant 20 min. Centrifuger pendant 5 min à 3 000 x g et recueillir la phase organique inférieure dans un tube de verre de 15 mL. Répéter l’extraction de dichlorométhane.
   2. Sécher l’extrait organique plus 500 mg de sulfate de sodium anhydre et recueillir la phase liquide avec une pipette Pasteur. Concentrer l’extrait par un facteur de quatre sous flux d’azote et le transférer dans un flacon pour échantillonneur automatique de GC.
2. GC-MS quantification de composés volatils
   1. Équiper le chromatographe en phase gazeuse avec colonne capillaire en silice fondue 30 m x 0,25 mm épaisseur 0,25 μm et appliquer un flux constant d’hélium de 1,0 mL/min. Maintenez l’injecteur et la ligne de transfert à 250 ° C.
   2. Injecter 2 µL de l’échantillon avec un rapport de 10:1 split et de séparer les molécules volatiles extraites en utilisant le profil de température de four suivant : maintenir la température pendant 3 min à 40 ° C, elle augmente de 4 ° C/min jusqu'à 220 ° C et puis maintenez le four à 220 ° C pendant 20 min.
   3. Détecter les composés à l’aide d’un spectromètre de masse avec sa température de source fixé à 230 ° C et sa température de spectromètre de masse quadripolaire à 150 ° C. Enregistrer les spectres de masse en mode sélectionné Ion Monitoring (SIM) avec ionisation par impact de positif électronique à 70 eV et en utilisant les grappes d’ion spécifiques aux composés volatils qui sont présentés au tableau 4.
   4. Utilisez un étalonnage externe de 7 points pour quantifier les concentrations de molécules volatiles, la somme des intensités de l’amas d’ion correspondant. Préparer les solutions de chaque composé (10 g/L) dans l’éthanol à 100 %. Ensuite, préparer des solutions étalons pour chaque classe de molécules volatiles (esters éthyliques, acétates, alcools et acides) en mélangeant des solutions mères. Enfin, diluer les différents montants des solutions étalons dans une solution hydroalcoolique de 12 % contenant 5 g/L d’acide tartrique avec le pH ajusté à 3.3 pour préparer des solutions d’étalonnage.
   5. En parallèle, corriger pour l’étiquetage naturelle des intensités de chaque groupe d’ions et calculer l’enrichissement isotopique de composés volatils, qui est définie comme la fraction marquée des molécules et est exprimée en pourcentage en utilisant le logiciel dédié ¹⁷.

6. les calculs pour une analyse intégrée de l’objet Dataset

1. Collecte des données brutes
   1. En utilisant les feuilles de calcul indiqués dans les tableaux 5, 6, 7 et 8, entrez les valeurs de données brutes qui correspondent à la concentration extracellulaire des acides aminés, poids sec de cellule, la teneur en protéines des cellules, la concentration de molécules volatiles et isotopiques enrichissement de l’acide aminé et de molécules volatiles.
      NOTE : Les données présentées dans les tableaux sont exprimées en mM. Tous les résultats sont également exprimées en mg/L en multipliant les valeurs en mM par le poids moléculaire de chaque molécule ou en mg N/L en multipliant les concentrations millimolaires d’un acide aminé acide par la masse atomique de l’azote (14 u) et par le nombre d’azote ato MS qui sont fournis par le catabolisme de cette molécule.
   2. Calculer le pourcentage massique de chaque acide aminé dans les protéines en divisant son montant en mg/L dans l’hydrolysat par le nombre total d’acides aminés (leur somme en mg/L).
   3. Calculer les moyens, les écarts et les erreurs-types de la moyenne des données qui ont été obtenues dans les expériences indépendantes.
   4. Calculer la concentration d’acide (mg/L) pour chaque acide aminé en multipliant le pourcentage de cet acide aminé dans les protéines (protéines de aa/g mg) de la fraction protéique de la biomasse (g protéines/g PS) et la teneur en matières sèches (production de biomasse) dans le moyenne (g DW/L).
2. ¹⁵ Expériences de traceur isotopique N
   1. En utilisant les feuilles de calcul qui sont présentées au tableau 9, calculer les fractions marquées et non marquées d’azote présents dans l’acide aminé (exprimée en mg N/L) de leurs concentrations totales (exprimées en mg N/L) et leur enrichissement isotopique. Pour chaque acide aminé, la fraction étiquetée correspond au produit entre sa concentration totale et l’enrichissement isotopique, et la partie sans étiquette est la différence entre le total et les montants marqués.
   2. Ensuite, déterminer la fraction de l’azote total dans les protéines contenues dans l’acide aminé quantifié dans cette étude en additionnant le montant total de Ala Gly, Val, Asp, Phe, Leu, Ile, Thr, Ser, Pro, Lys, His, Glu et Arg (en mg N/L) et en divisant le total une Mont d’azote contenue dans les protéines de cette somme.
   3. Calculer l’azote fourni par arginine, glutamine ou d’ammonium a été récupéré par les acides protéinogéniques quantifiés dans cette étude en additionnant la fraction marquée (en mg N/L) de l’acide aminé qui ont été quantifiés dans l’étude (Ala, Gly, Val, Asp, Phe, Leu, Ile, Thr, Ser, Pro, Lys, His, Glu et Arg) au cours d’expériences en présence de ¹⁵N-étiqueté arginine, glutamine, ou d’ammonium et divisant cette fraction d’azote marqué par la quantité totale d’azote dans l’engagements chiffré acide aminé acides.
   4. Évaluer la contribution des 3 acides aminés plus abondants dans le pool intracellulaire de l’azote utilisé pour la biosynthèse de novo en combinant les données provenant des ¹³C et ¹⁵N expériences de traceur isotopique (feuille de calcul dans le tableau 7).
   5. Sur le montant total (exprimé en mM) de protéinogéniques Val, Leu, Ile ou Thr, retenez la partie provenant de l’incorporation directe des composés consommés (¹³C expériences) et la partie qui a été synthétisé de novo de l’azote de la 3 principales sources afin d’évaluer la fraction qui a été synthétisé de novo à l’aide d’azote provenant d’autres acides aminés.
   6. Puis, calculer le rapport entre la quantité d’acides aminés synthétisée de novo de l’azote fourni par Gln Arg et NH₄⁺ (somme exprimée en mM) à la quantité totale d’acide aminé (en mM) pour quantifier la contribution de arginine, glutamine et ammonium dans le pool intracellulaire d’azote.
3. ¹³ C traceur isotopique expériences
   1. Calculer les fractions marquées et non marquées, de l’acide aminé de concentrations sont exprimées en mM et l’enrichissement isotopique de l’acide aminé qui ont été obtenus au cours d’expériences en présence de ¹³C-étiqueté Leu, Val, Ile ou Thr. (voir 6.2.1)., tableau 10).
   2. Calculer les fractions marquées et non marquées de composés volatils des concentrations exprimées en mM et l’enrichissement isotopique de composés volatils qui ont été obtenus au cours d’expériences en présence de ¹³C-étiqueté Leu, Val, Ile ou Thr ( Tableau 10).

Résultats

La figure 3 présente un schéma du flux de travail qui a été mis en place pour enquêter sur la gestion par la levure de multiples sources d’azote qui se trouvent au cours de la fermentation du vin.
Pour les différents points d’échantillonnage, les caractéristiques des paramètres biologiques – la croissance, les habitudes de consommation d’azote et le profil d’acides aminés acide – spectacle une reproductibilité élevée parmi les ferm...

Discussion

Quantification de la séparation de composés par l’intermédiaire de réseaux métaboliques à l’aide d’expériences de traceur isotopique est une approche prometteuse pour comprendre le fonctionnement du métabolisme microbien. Cette méthode, alors qu’il est appliqué avec succès avec un ou deux substrats marqués, ne peut être appliquée actuellement pour étudier le métabolisme de diverses sources à l’aide de plusieurs isotopes élémentaires étiquetées (c.-à-d., plus de deux substrats). En...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
D-Glucose	PanReac	141341.0416
D-Fructose	PanReac	142728.0416
DL-Malic acid	Sigma Aldrich	M0875
Citric acid monohydrate	Sigma Aldrich	C7129
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P5379
Potassium sulfate	Sigma Aldrich	P0772
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	230391
Calcium chloride dihydrate	Sigma Aldrich	C7902
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S9625
Ammonium chloride	Sigma Aldrich	A4514
Sodium hydroxide	Sigma Aldrich	71690
Manganese sulfate monohydrate	Sigma Aldrich	M7634
Zinc sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	Z4750
Copper (II) sulfate pentahydrate	Sigma Aldrich	C7631
Potassium iodine	Sigma Aldrich	P4286
Cobalt (II) chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	C3169
Boric acid	Sigma Aldrich	B7660
Ammonium heptamolybdate	Sigma Aldrich	A7302
Myo-inositol	Sigma Aldrich	I5125
D-Pantothenic acid hemicalcium salt	Sigma Aldrich	21210
Thiamine, hydrochloride	Sigma Aldrich	T4625
Nicotinic acid	Sigma Aldrich	N4126
Pyridoxine	Sigma Aldrich	P5669
Biotine	Sigma Aldrich	B4501
Ergostérol	Sigma Aldrich	E6510
Tween 80	Sigma Aldrich	P1754
Ethanol absolute	VWR Chemicals	101074F
Iron (III) chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	236489
L-Aspartic acid	Sigma Aldrich	A9256
L-Glutamic acid	Sigma Aldrich	G1251
L-Alanine	Sigma Aldrich	A7627
L-Arginine	Sigma Aldrich	A5006
L-Cysteine	Sigma Aldrich	C7352
L-Glutamine	Sigma Aldrich	G3126
Glycine	Sigma Aldrich	G7126
L-Histidine	Sigma Aldrich	H8000
L-Isoleucine	Sigma Aldrich	I2752
L-Leucine	Sigma Aldrich	L8000
L-Lysine	Sigma Aldrich	L5501
L-Methionine	Sigma Aldrich	M9625
L-Phenylalanine	Sigma Aldrich	P2126
L-Proline	Sigma Aldrich	P0380
L-Serine	Sigma Aldrich	S4500
L-Threonine	Sigma Aldrich	T8625
L-Tryptophane	Sigma Aldrich	T0254
L-Tyrosine	Sigma Aldrich	T3754
L-Valine	Sigma Aldrich	V0500
13C5-L-Valine	Eurisotop	CLM-2249-H-0.25
13C6-L-Leucine	Eurisotop	CLM-2262-H-0.25
15N-Ammonium chloride	Eurisotop	NLM-467-1
ALPHA-15N-L-Glutamine	Eurisotop	NLM-1016-1
U-15N4-L-Arginine	Eurisotop	NLM-396-PK
Ethyl acetate	Sigma Aldrich	270989
Ethyl propanoate	Sigma Aldrich	112305
Ethyl 2-methylpropanoate	Sigma Aldrich	246085
Ethyl butanoate	Sigma Aldrich	E15701
Ethyl 2-methylbutanoate	Sigma Aldrich	306886
Ethyl 3-methylbutanoate	Sigma Aldrich	8.08541.0250
Ethyl hexanoate	Sigma Aldrich	148962
Ethyl octanoate	Sigma Aldrich	W244910
Ethyl decanoate	Sigma Aldrich	W243205
Ethyl dodecanoate	Sigma Aldrich	W244112
Ethyl lactate	Sigma Aldrich	W244015
Diethyl succinate	Sigma Aldrich	W237701
2-methylpropyl acetate	Sigma Aldrich	W217514
2-methylbutyl acetate	Sigma Aldrich	W364401
3-methyl butyl acetate	Sigma Aldrich	287725
2-phenylethyl acetate	Sigma Aldrich	290580
2-methylpropanol	Sigma Aldrich	294829
2-methylbutanol	Sigma Aldrich	133051
3-methylbutanol	Sigma Aldrich	309435
Hexanol	Sigma Aldrich	128570
2-phenylethanol	Sigma Aldrich	77861
Propanoic acid	Sigma Aldrich	94425
Butanoic acid	Sigma Aldrich	19215
2-methylpropanoic acid	Sigma Aldrich	58360
2-methylbutanoic acid	Sigma Aldrich	193070
3-methylbutanoic acid	Sigma Aldrich	W310212
Hexanoic acid	Sigma Aldrich	153745
Octanoic acid	Sigma Aldrich	W279900
Decanoic acid	Sigma Aldrich	W236403
Dodecanoic acid	Sigma Aldrich	L556
Fermentor 1L	Legallais	AT1357	Fermenter handmade for fermentation
Disposable vacuum filtration system	Dominique Deutscher	029311
Fermenters (250 ml)	Legallais	AT1352	Fermenter handmade for fermentation
Sterile tubes	Sarstedt	62.554.502
Fermentation locks	Legallais	AT1356	Fermetation locks handmade for fermentation
BactoYeast Extract	Becton, Dickinson and Company	212750
BactoPeptone	Becton, Dickinson and Company	211677
Incubator shaker	Infors HT
Particle Counter	Beckman Coulter	6605697	Multisizer 3 Coulter Counter
Centrifuge	Jouan		GR412
Plate Butler Robotic system	Lab Services BV	PF0X-MA	Automatic instrument
Plate Butler Software	Lab Services BV		Robot monitor software
RobView			In-house developed calculation software
My SQL			International source database
Cimarec i Telesystem Multipoint Stirrers	Thermo Fisher Scientific	50088009	String Drive 60
BenchBlotter platform rocker	Dutscher	60903
Ammonia enzymatic kit	R-Biopharm AG	5390
Spectrophotometer cuvettes	VWR	634-0678
Spectrophotometer UviLine 9400	Secomam
Amino acids standards physiological - acidics and neutrals	Sigma Aldrich	A6407
Amino acids standards physiological - basics	Sigma Aldrich	A6282
Citrate lithium buffers - Ultra ninhydrin reagent	Biochrom	BC80-6000-06
Sulfosalycilic acid	Sigma Aldrich	S2130
Norleucine	Sigma Aldrich	N1398
Biochrom 30 AAA	Biochrom
EZChrom Elite	Biochrom		Instrument control and Data analysis software
Ultropac 8 resin Lithium	Biochrom	BC80-6002-47	Lithium High Resolution Physiological Column
Filter Millex GV	Merck Millipore	SLGVX13NL	Millex GV 13mm (pore size 0.22 µm)
Membrane filter PALL	VWR	514-4157	Supor-450 47mm 0.45µm
Vacuum pump Millivac Mini	Millipore	XF5423050
Aluminium smooth weigh dish 70mm	VWR	611-1380
Precision balance	Mettler		Specifications AE163
Dimethyl sulfoxid dried	Merck	1029310161	(max. 0.025% H2O) SeccoSolv
Combustion oven	Legallais
Pierce BCA protein assay kit	Interchim	UP40840A
Formic acid	Fluka	94318
Hydrogen peroxide	Sigma Aldrich	H1009
Hydrochloric Acid Fuming 37% Emsure	Merck	1003171000	Grade ACS,ISO,Reag. Ph Eur
Lithium acetate buffer	Biochrom	80-2038-10
Commercial solution of hydrolyzed amino acids	Sigma Aldrich	AAS18
L-Methionine sulfone	Sigma Aldrich	M0876
L-Cysteic acid monohydrate	Sigma Aldrich	30170
Pyrex glass culture tubes	Sigma Aldrich	Z653586
Pyridine	Acros Organics	131780500	99% Extrapure
Ethyl chloroformate	Sigma Aldrich	23131
Dichloromethane	Sigma Aldrich	32222
Vials	Sigma Aldrich	854165
Microinserts for 1.5ml vials	Sigma Aldrich	SU860066
GC/MS	Agilent Technologies	5890 GC/5973 MS
Chemstation	Agilent Technologies		Instrument control and data analysis software
Methanol	Sigma Aldrich	34860	Chromasolv, for HPLC
Acetonitrile	Sigma Aldrich	34998	ChromasolvPlus, for HPLC
N,N-Dimethylformamide dimethyl acetal	Sigma Aldrich	394963
BSTFA	Sigma Aldrich	33024
DB-17MS column	Agilent Technologies	122-4731	30m*0.25mm*0.15µm
Sodium sulfate, anhydrous	Sigma Aldrich	238597
Technical nitrogen	Air products	14629
Zebron ZB-WAX column	Phenomenex	7HG-G007-11	30m*0.25mm*0.25µm
Helium BIP	Air products	26699
Glass Pasteur pipettes	VWR	612-1702