Flujo de trabajo basado en la combinación de trazador isotópico experimentos para investigar el metabolismo microbiano de múltiples fuentes de nutrientes

Resumen

Este protocolo describe un procedimiento experimental cuantitativa y comprensivo investigar el metabolismo de múltiples fuentes de nutrientes. Este flujo de trabajo, basado en una combinación de experimentos de trazador isotópico y de un procedimiento analítico permite el destino de los nutrientes consumidos y el origen metabólico de moléculas sintetizado por microorganismos a determinar.

Resumen

Estudios en el campo de la microbiología se basan en la aplicación de una amplia gama de metodologías. En particular, el desarrollo de métodos adecuados substancialmente contribuye a proporcionar amplios conocimientos sobre el metabolismo de los microorganismos crecen en medios químicamente definidos que contiene fuentes de carbono y nitrógeno único. En cambio, la gestión a través de múltiples fuentes de nutrientes, a pesar de su amplia presencia en ambientes naturales o industriales, permanece prácticamente inexplorada. Esta situación se debe principalmente a la falta de metodologías adecuadas, que dificulta las investigaciones.

Divulgamos una estrategia experimental cuantitativa y comprensivo explorar cómo metabolismo funciona cuando un alimento se suministra como una mezcla de diferentes moléculas, es decir, un recurso complejo. Aquí, Describimos su aplicación para la evaluación de la partición de múltiples fuentes de nitrógeno a través de la red metabólica de la levadura. El flujo de trabajo combina la información obtenida durante experimentos de trazalíneas de isótopos estables usando las ¹³C - o sustratos marcados con N ¹⁵. Primero consiste en fermentaciones paralelas y reproducibles en el mismo medio, que incluye una mezcla de moléculas que contiene N; sin embargo, una fuente de nitrógeno seleccionado se etiqueta cada vez. Se implementa una combinación de procedimientos analíticos (HPLC, GC-MS) para evaluar los patrones Etiquetadoras de compuestos específicos y cuantificar el consumo y la recuperación de sustratos en otros metabolitos. Un análisis integrado del conjunto completo de datos proporciona una visión general del destino de sustratos consumidos dentro de las células. Este enfoque requiere un protocolo preciso para la recolección de las muestras – facilitado por un sistema asistido por robot para monitoreo en línea de fermentaciones- y la realización de numerosos análisis desperdiciador de tiempo. A pesar de estas limitaciones, permitió entender por primera vez, la partición de múltiples fuentes de nitrógeno a través de la red metabólica de la levadura. Había aclarada la redistribución del nitrógeno de las fuentes más abundantes hacia otros compuestos de N y determinar el origen metabólico de proteinogenic aminoácidos y moléculas volátiles.

Introducción

Entender cómo funciona el metabolismo microbiano es una cuestión clave para el diseño de estrategias eficientes para mejorar los procesos de fermentación y modulan la producción de compuestos fermentativos. Avances en genómica y genómica funcional en estas dos últimas décadas contribuidas en gran medida a ampliar los conocimientos de la topología de redes metabólicas en muchos microorganismos. Acceso a esta información condujo al desarrollo de enfoques que buscan un panorama completo de la función celular¹. Estas metodologías dependen a menudo de una interpretación basada en modelos de parámetros mensurables. Estos datos experimentales incluyen, por un lado, las tasas de captación y producción de metabolitos y, por otro lado, experimentos cuantitativo información intracelular que se obtiene del trazalíneas de isótopos. Estos datos proporcionan información esencial para la deducción de la actividad en vivo de las diferentes vías en una red metabólica definida^2,3,4. Actualmente, las técnicas analíticas disponibles sólo permiten la detección precisa de etiquetado patrones de moléculas cuando se utiliza un solo elemento isótopo y posiblemente al conjunto de etiquetado con dos elementos isotópicos. Por otra parte, en la mayoría de las condiciones de crecimiento, la fuente de carbono sólo se compone de uno o dos compuestos. En consecuencia, los enfoques basados en marcadores isotópicos de C ¹³de substratos de carbón ampliamente y con éxito se aplicaron para desarrollar una comprensión completa de carbono red metabólica operaciones^{5,6,7 ,8}.

Por el contrario, en muchos ambientes naturales e industriales, el recurso de nitrógeno disponible que apoya crecimiento microbiano se compone a menudo de una amplia gama de moléculas. Por ejemplo, durante la fermentación del vino o la cerveza, nitrógeno se presenta como una mezcla de 18 aminoácidos y amonio en concentraciones variables⁹. Este conjunto de compuestos de N que son accesibles para el anabolismo hace estas condiciones medios complejos considerablemente diferentes de las utilizadas para estudios fisiológicos, como este último se logra mediante una fuente única de nitrógeno, por lo general amonio.

En general, internalizado nitrógeno compuestos pueden ser incorporados en las proteínas directamente o catabolizados. La estructura de la red del metabolismo de nitrógeno en muchos microorganismos, incluyendo la levadura Saccharomyces cerevisiae, es muy compleja según la diversidad de sustratos. Esquemáticamente, este sistema se basa en la combinación del núcleo central del metabolismo de nitrógeno que cataliza la interconversión de glutamina, glutamato y el α-cetoglutarato^10,11, con las aminotransferasas y Desaminasas. A través de esta red, se reúnen grupos de Amina de amonio o de otros aminoácidos y α-ceto ácidos liberados. Estos productos intermedios son también sintetizado a carbón central metabolismo (CCM)^12,13. Este gran número de reacciones ramificadas y productos intermedios, involucrados en el catabolismo de las fuentes de nitrógeno exógeno y el anabolismo de aminoácidos proteinogenic, cumple con los requisitos anabólicos de las células. También resultados de la actividad a través de estas diferentes rutas interconectadas en la excreción de metabolitos. En particular, α-ceto ácidos pueden ser redirigidos a través de la vía de Ehrlich a producir alcoholes superiores y sus derivados de éster de acetato de¹⁴, que son contribuidores esenciales a los perfiles sensoriales de los productos. Posteriormente, cómo funciona el metabolismo del nitrógeno juega un papel clave en la producción de biomasa y la formación de moléculas volátiles (aroma).

Las reacciones, las enzimas y genes implicados en el metabolismo del nitrógeno son ampliamente descritos en la literatura. Sin embargo, la cuestión de la distribución de múltiples fuentes de nitrógeno a través de una red metabólica ha no aún abordada. Hay dos razones principales que explican esta falta de información. En primer lugar, dada la importante complejidad de la red de metabolismo del nitrógeno, una gran cantidad de datos cuantitativos se requiere para una comprensión completa de su funcionamiento que no estaba disponible hasta ahora. Segundo, muchas limitaciones experimentales y limitaciones de los métodos analíticos impidieron la aplicación de métodos que fueron utilizados previamente para la aclaración de la función CCM.

Para superar estos problemas, decidimos desarrollar un enfoque de nivel de sistema que se basa en la reconciliación de los datos de una serie de experimentos de trazador isotópico. El flujo de trabajo incluye:
-Una serie de fermentaciones realizadas bajo las mismas condiciones ambientales, mientras que otra fuente nutrientes seleccionada (sustrato) se etiqueta cada vez.
-Una combinación de procedimientos analíticos (HPLC, GC-MS) para una determinación precisa, en diferentes etapas de la fermentación, de la concentración residual de sustrato marcado y la concentración y el enriquecimiento isotópico de compuestos que se derivan de el catabolismo de la molécula marcada, incluida la derivada de la biomasa.
-Un cálculo del equilibrio isotópico y masa para cada uno consume molécula marcada y un posterior análisis integrado del conjunto de datos para obtener una visión global de la gestión de múltiples fuentes de nutrientes por los microorganismos a través de la determinación de coeficientes de flujo .

Para aplicar esta metodología, debe prestarse atención al comportamiento reproducible del microorganismo y la tensión entre culturas. Además, deben tomarse muestras de diferentes culturas durante el progreso mismo de fermentación bien definidos. En el trabajo experimental en este manuscrito, un sistema de robótica se utiliza para el monitoreo en línea de las fermentaciones para tener en cuenta estas limitaciones.

Además, es esencial elegir un conjunto de sustratos marcados (compuesto, naturaleza y posición de las etiquetas) que es apropiado para abordar el problema científico del estudio. Aquí, arginina, glutamina y ¹⁵marcado con el N amonio fueron seleccionados como las tres fuentes de nitrógeno más importantes encontradas en el jugo de uva. Esto permitió evaluar el patrón de redistribución del nitrógeno de compuestos consumidos a los aminoácidos proteinogenic. También se intentó investigar el destino de la columna vertebral de carbono de los aminoácidos consumidos y su contribución a la producción de moléculas volátiles. Para cumplir con este objetivo, uniformemente leucina marcada con C ¹³, isoleucina, treonina y valina fueron incluidos en el estudio como aminoácidos que se derivan de importantes intermediarios de la vía de los Ehrlich.

En general, exploramos cuantitativamente cómo levadura gestiona un recurso complejo nitrógeno por redistribución de fuentes exógenas de nitrógeno para cumplir con sus requerimientos anabólicos a través Fermentación mientras que además quita el exceso de precursores de carbono como moléculas volátiles. El procedimiento experimental reportado en este trabajo puede aplicarse para investigar otras múltiples fuentes de nutrientes utilizadas por cualquier otro microorganismo. Parece ser un enfoque apropiado para el análisis del impacto de la genética o las condiciones ambientales en el comportamiento metabólico de los microorganismos.

Protocolo

1. fermentación y toma de muestras

1. Preparación de medios de comunicación y fermentadores
   Nota: Todas las fermentaciones son llevadas a cabo en paralelo, con la misma tensión y en el mismo químicamente definición medio sintético (SM, composición proporcionada en la tabla 1), que incluye una mezcla de amonio y aminoácidos como fuentes de nitrógeno¹⁵. Para cada fermentación, un compuesto de nitrógeno solo se proporciona exclusivamente en un etiquetado uniforme ¹³C o ¹⁵N (100%), mientras que los otros permanecen sin etiqueta. Para cada fuente de nitrógeno marcado que se utiliza en el conjunto de experimentos (aquí: ¹⁵NH₄, U -¹⁵N4-Arg, U -¹⁵N2-Gln, U -¹³C6-Leu, U -¹³C5-Val, U -¹³C6-Ile, U -¹³C4-Thr), dos los fermentadores están preparados. Para cada condición, fermentación duplicada se realiza utilizando solamente las moléculas sin etiqueta (fermentaciones 7 control).
   1. Para que cada fuente de N estudiar, preparar 500 mL de SM medio que contiene todas las fuentes de nitrógeno enumeradas en la tabla 1, con la excepción del compuesto a ser utilizado en un 100% etiquetados como forma.
      Nota: La molécula marcada es añadida en los siguientes pasos.
   2. Pasteurización de cada medio en un matraz de 1 L (10 minutos, 100 ° C) que contiene una barra de agitación magnética. Pesar la cantidad apropiada de molécula marcada para alcanzar la concentración final que se reporta en la tabla 1 y se disuelve en el medio.
   3. Esterilizar el medio utilizando un sistema de filtración de vacío desechable (membrana de acetato de celulosa, 0,22 μm). Utilizando una probeta estéril, dividen el medio entre dos fermentadores pre-esterilizados (250 mL) que contiene una barra de agitación magnética y están equipadas con cerraduras de fermentación para evitar la entrada de oxígeno, pero permitiendo la liberación de CO₂.
   4. Los frascos de fermentación a 28 º C de calor colocándolos en la sala de incubación por 1 noche (temperatura de 28 ° C).
2. Inoculación y control de las fermentaciones
   1. Crecer la cepa de S. cerevisiae en tubos estériles conteniendo 10 mL de medio YPD a 28 ° C con agitación (150 rpm) durante 12 h. Entonces, Pipetear 1 mL de YPD preculture y transferir 10 ml del medio de SM (en tubos estériles de 15 mL). Incubar el cultivo de 12 h a 28 ° C con agitación (150 rpm).
   2. Bajo cabina de flujo laminar, recoge una alícuota de planas y cuantificar la población de células usando un contador de partículas electrónico que está provisto de una abertura de μm 100. Centrifugue las planas (2.000 x g, 15 min, 4 ° C) y suspender el sedimento en un volumen adecuado de agua estéril para obtener una concentración final de 2.5 x 10⁸ células/mL. Inocular cada fermentador con 1 mL de la suspensión de células.
      Nota: El sistema de robótico para supervisar el progreso de la fermentación se describe en la figura 1.
   3. Preparar la plataforma de la fermentación mediante la instalación de los fermentadores en las guías de soporte que se colocan en las placas de agitación de 21 posiciones correctamente y ajustar la velocidad de agitación en rpm 270. Para iniciar el seguimiento on-line de cada fermentación, inicie la aplicación de control del robot, luego haga clic en el botón "iniciar análisis" y seleccione el volumen de fermentación a llevarse a cabo (300 mL).
   4. La interfaz mostrada permite la indicación del número y la posición de los fermentadores en la plataforma. Para asegurar que esto ocurre, haga clic en la ubicación de la ranura y seleccione "activar" para activar el seguimiento de la fermentadora situada en esta posición.
   5. Inicializar el software de cálculo, permanentemente se ejecutan en el sistema, antes de comenzar la adquisición de peso. Haga clic en el botón "Initialiser" y validar con "ok". Haga clic en el botón"Inicio" de la aplicación de control del robot para iniciar las adquisiciones de peso.
3. Procedimiento de muestreo
   Nota: Para cada fermentador, se toman muestras cuando el CO₂ producción (valor que se muestra en línea en el equipo que ejecuta el software de cálculo) alcanza el punto de ajuste necesario: 5, 10, 40 y 90 g/L en este estudio.
   1. Muestreo el procedimiento de las culturas con compuestos marcados.
      1. Centrifugar dos muestras de 6 mL (2.000 x g, 5 min, 4 ° C). Guardar y almacenar los sobrenadantes congelados en dos alícuotas a-80 ° C. Lavar el pellet dos veces con 5 mL de agua destilada y conservar a-80 ° C para la medición de enriquecimientos isotópicos.
   2. Procedimiento para las culturas sin compuestos etiquetados de muestreo
      1. 10 mL de la cultura, que se utilizará para la determinación de peso seco de la cosecha. Sedimenten las células de dos muestras de 10 mL por centrifugación (2.000 x g, 5 min, 4 ° C). Lavar el pellet dos veces con 10 mL de agua destilada y guardar a-80 ° C para la determinación del contenido de proteína y aminoácidos.

2. cuantificación de las fuentes de nitrógeno consumido

1. Determinación enzimática de las concentraciones de amoníaco residual
   Nota: La determinación de la concentración de amoníaco en sobrenadantes se realiza utilizando un kit comercial basado en la enzima; todos los reactivos son suministrados por el fabricante.
   1. Preparar una solución de amoniaco estándar (61,4 mg/L) disolver 25 mg de precisión de pesada (NH₄)₂hasta₄ en un matraz aforado de 100 mL.
   2. Para cumplir con las instrucciones del fabricante, realizar una dilución 1:2 de las muestras que fueron tomadas antes de la fermentación y en 5 g/L de CO₂ liberado. Ajustar el pH de las muestras aproximadamente 8 añadiendo 1 M KOH. Tomar nota del volumen añadido y tomar en cuenta el factor de dilución.
   3. En cubetas de espectrofotómetro de 4 mL, mezclar 100 μl de la muestra (diluida si es necesario), agua destilada o solución de amoníaco estándar con 2 mL de reactivo 1 (0, 75 mM de ADP y 30 U/mL glutamato deshidrogenasa en buffer pH 7.8) y 500 μl de reactivo 2 (NADH 1,3 mM). Incubar por 15 min a temperatura ambiente y leer la absorbancia del NADH a 340 nm (A1).
   4. Añadir 500 μl del Reactivo 3 (60 mM α-cetoglutarato en buffer de pH 8), incubar la muestra durante 20 min a temperatura ambiente y leer la absorbancia del NADH a 340 nm (A2).
   5. Calcular la concentración de amoníaco usando:
      C_amoníaco (g/L) = 0.083 x [(0.839 x A1-A2)_muestra- (0.839 x A1-A2)_{agua destilada}]
   6. Verificar que la concentración correcta se obtiene con la solución estándar.
2. Determinación cromatográfica de las concentraciones del aminoácido residual
   Nota: La determinación de las concentraciones del aminoácido en sobrenadantes se logra mediante un sistema de análisis de aminoácidos dedicado basado en cromatografía de intercambio iónico con derivatización de la columna del post de compuestos de N con la ninhidrina, que permite su detección colorimétrica.
   1. Preparar una solución de referencia mediante la adición de 200 μL de una mezcla comercial de aminoácidos ácidos y neutros, 200 μL de una mezcla comercial de aminoácidos básicos y 200 μL de glutamina de 2,5 mM a 400 μL de tampón de citrato de litio 200 mM, pH 2.2. Esta solución de referencia definidos químicamente se trata como una muestra.
   2. Añadir 200 μL de solución de ácido sulfosalicílico 25% (w/v) que contiene norleucine de 2,5 mM (estándar interno) a 800 μl de la muestra para eliminar las moléculas con peso molecular alto. Incubar durante 1 h a 4 ° C, centrifugar (3.000 x g, 10 min, 4 ° C) y el filtro a través de una membrana de nitrocelulosa de tamaño de poro de 0,22 μm (sistema de jeringa).
   3. En el software del programador, haga clic en el botón "Ejecutar" para comenzar la cromatografía líquida de análisis (LC) con el analizador equipado con una columna de intercambio catiónico (forma de litio). Eluir los aminoácidos con buffers de litio sucesivas para crear un gradiente de pH y un gradiente en la concentración de iones contra en combinación con un gradiente de temperatura (tabla 2).
   4. Cuantificar los compuestos del nitrógeno después de la derivatización de ninhidrina por un detector espectrofotométrico a 570 nm (púrpura coloración: reacción entre la ninhidrina y amina de aminoácidos) y 440 nm (amarillo coloración: reacción entre la ninhidrina e imina del grupo de prolina).
   5. Realizar una calibración interna de un punto utilizando la solución de referencia y norleucine como estándar interno para calcular las concentraciones de aminoácidos en las muestras utilizando el software del fabricante.

3. cuantificación de aminoácidos Proteinogenic

1. Medición de peso seco de la célula
   1. Filtro 10 mL de la cultura a través de un filtro de nitrocelulosa (tamaño 0.45 μm de poro) que es pesado previamente en una taza de aluminio, usando un dispositivo de vacío. Lavar dos veces con 50 mL de agua destilada.
   2. Coloque el filtro en la taza de aluminio y secar en un horno a 105 ° C durante 48 h (hasta que no se observe ningún cambio más en peso) de calor antes de pesajes el filtro en la taza. Calcular la diferencia de peso.
   3. Calcular el promedio de al menos 3 mediciones independientes para determinar con precisión el peso seco de la célula de la cultura de la levadura.
2. Cuantificación del contenido de proteínas de las células
   Nota: La cuantificación de la fracción proteica de las células se realiza mínimo por triplicado usando pellets de células sin etiqueta que se obtuvieron como se describe en la sección 1.3.2.
   1. Extracto de proteínas por la adición de 1 mL de solución de DMSO (50% v/v) a pellets congelados e incubar a 105 ° C por 1 h en un horno de calor seco.
   2. Cuantificar el contenido de proteína en los extractos de DMSO con el ensayo colorimétrico bioquímico que se basa en la reducción de las proteínas de Cu⁺⁺ , en iones de Cu⁺ que además son precipitados por ácido bicinchoninic en un complejo azul (ensayo BCA).
3. Determinación de las contribuciones relativas de los aminoácidos en las proteínas
   Nota: El perfil de aminoácidos proteinogenic es determinado al menos por triplicado de pastillas sin etiquetar de la célula (1.3.2.).
   1. Preparar un extracto oxidado por suspender el precipitado de células en 200 μL de ácido performic (el ácido fórmico 90%, 10% peróxido de hidrógeno). Incubar durante 4 h a 4 º C y detener la reacción por la adición de 33,6 mg de sulfato de sodio.
      Nota: El paso de oxidación es necesario para convertir la cisteína y metionina, metionina sulfona y cisteico ácido, que va ser más cuantificado por cromatografía de intercambio iónico. Sin embargo, algunos aminoácidos (tirosina, fenilalanina, histidina y arginina) son desnaturalizadas durante el tratamiento de la oxidación. Por lo tanto, se preparan dos hidrolizados (con y sin oxidación).
   2. Añadir 800 μl de HCl 6N a pellets celulares u oxidado extracto e incubar la muestra en un tubo de vidrio sellado herméticamente durante 16 horas a 110 ° C en un horno de calor seco. Añadir 200 μL de 2.5 mM norleucine y quite el HCl con una corriente de nitrógeno. Lavar (Resuspender el extracto seco y removiendo el líquido con una corriente de nitrógeno) dos veces con 800 μl de agua destilada y luego con 800 μl de etanol. Tomar en 800 μl de tampón de acetato de litio 200 mM, pH 2.2.
      Nota: Preste atención al tiempo de incubación para la hidrólisis como algunos aminoácidos no son estables en condiciones ácidas. La fracción de triptófano en la proteína se calcula de los datos encontrados en la literatura¹⁶, como este aminoácido es totalmente desnaturalizado durante la hidrólisis de ácido clorhídrico.
   3. Preparar un estándar de hidrolizado para la calibración interna de un solo punto. Añadir 160 μl de una solución comercial de aminoácidos hidrolizados a 840 μl de tampón de acetato de litio 200 mM, pH 2.2, que contiene del sulfone metionina de 625 μm, 625 μm el ácido cisteico 625 μm norleucine.
   4. Determinar las concentraciones relativas de los aminoácidos en las proteínas mediante el método cromatográfico que se describe en la sección 2.2.
4. Cálculos
   1. Calcular el porcentaje de peso de cada aminoácido en las proteínas dividiendo la cantidad de cada aminoácido (mg/L) medida por la cantidad total de aminoácidos que se midió en el extracto de proteína (suma en mg/L).
   2. Multiplicar este porcentaje por la concentración de proteínas en la cultura (mg/L), es decir, el producto entre el contenido de proteína de la biomasa y el peso seco, para evaluar la concentración de cada aminoácido proteinogénico en la cultura (mg/L).

4. medición de enriquecimiento isotópico de aminoácidos Proteinogenic

Nota: Para la medida del enriquecimiento isotópico de aminoácidos proteinogenic, utilice los pellets de células marcadas. Tres agentes se utilizan para el paso de derivatización para cuantificar el enriquecimiento isotópico de los aminoácidos. Se miden las intensidades de los iones de cluster para estimar los patrones de etiquetado de los aminoácidos. La señal de cada ion cluster corresponde a la abundancia de la masa isotopomers (m₀ = sin etiquetado, m_{+ 1} = 1 átomo de etiquetado,...) de un fragmento de aminoácido. Un ejemplo de un cromatograma que se obtiene después del procedimiento DMADMF se proporciona en la figura 2.

1. Hidrólisis de biomasa
   1. Hidrolizar las pelotillas de la célula (correspondiente a 1-2 mg de biomasa seca) agregar 1,2 mL de 6 M de HCl y incubar la muestra durante 16 horas a 105 ° C en tubos de cristal bien cerrados en un horno de calor seco.
   2. Añadir 1,2 mL de agua destilada y centrifugar a 3.000 x g durante 5 min eliminar los desechos celulares. Distribuya el sobrenadante en fracciones de 6 400 μL en tubos de vidrio abierto. Seco de las fracciones en un caliente el horno a 105 ° C hasta alcanzar la consistencia de jarabe (4-5 h).
2. Derivatización de Ethylchloroformate (ECF)
   1. Disolver hidrolizado seco en 200 μL de 20 mM HCl; Luego, añadir 133 μl de piridina: etanol (1:4). Añadir 50 μl de ECF derivatize los aminoácidos y esperar hasta que todo el CO₂ ha sido liberado. Transferir la mezcla a tubos que contienen 500 μl de diclorometano para extraer los compuestos derivatizados de centrífuga.
   2. Vórtex los tubos durante 10 s y centrifugar por 4 min a 10.000 x g; recoger la fase orgánica inferior con una pipeta Pasteur y transferencia a frascos de GC que contienen inserciones de vidrio cónico para que las muestras se pueden inyectar directamente en el instrumento de GC/MS.
3. (N, N)-derivatización de dimetilformamida dimetil acetal (DMFDMA).
   1. Disolver hidrolizado seco en 50 μl de metanol y 200 μL de acetonitrilo. Añadir 300 μL de DMFDMA. Vórtice el tubo y la transferencia de las muestras muestreadores GC viales que contienen cristal cónico.
4. N, derivatización de O-Bis (trimetilsilil) trifluoroacetamida (BSTFA)
   1. Suspender el hidrolizado en 200 μL de acetonitrilo. Añadir 200 μL de BSTFA, cerrar herméticamente el tubo de cristal e incubar durante 4 h a 135 ° C antes de transferir el extracto directamente a GC viales.
5. Análisis por GC-MS
   1. Analizar muestras con un cromatógrafo de gases que está equipado con un inyector automático y está acoplado a un espectrómetro de masas.
      1. Utilizar software específico del instrumento el instrumento de control y analizar los cromatogramas. En el menú "Secuencia", haga clic en la "tabla de registro de muestra" para crear la lista de muestra y haga clic en el botón "Ejecutar" para iniciar las inyecciones.
         Nota: La cromatografía de gas está equipada con una columna capilar de 30 m x 0.25 mm apolar silicona con un espesor de película de 0,15 μm. El espectrómetro de masas cuadrupolo temperatura a 150 ° C y mantenga la línea de transferencia a 250 ° C para el análisis. Se utilizan tres programas analíticos, cada uno específico para cada agente de derivatización.
      2. Derivados de la seta: Uso de helio como fase móvil con un flujo de 1,2 mL/min temperatura de la entrada a 230 ° C y la de la fuente a 250 ° C. Programa de los muestreadores para inyectar 1 μl de las muestras con una relación de split de 3:1. Ejecutar los análisis, aumentando gradualmente la temperatura del horno como sigue: 130 ° C por 3 min; pendiente de 15 ° C/min hasta 260 ° C; mantener la temperatura a 260 º C por 20 min.
      3. Derivados del DMFDMA: Uso de helio como fase móvil con un constante flujo de 1,2 mL/min temperatura de la entrada a 230 ° C y la de la fuente a 250 ° C. Programa de los muestreadores para inyectar 1 μl de las muestras con una relación de split de 3:1. Ejecutar los análisis, aumentando gradualmente la temperatura del horno como sigue: 60 ° C por 1 min; gradiente de 20 ° C/min a 130 ° C; segundo gradiente de 4 º C/min hasta 260 ° C; mantener la temperatura a 260 º C durante 10 minutos.
      4. Derivados BSTFA: Uso de helio como fase móvil con un constante flujo de 1,2 mL/min temperatura de la entrada a 275 ° C y la de la fuente a 300 ° C. Ejecutar el análisis (inyección: 1 μl), poco a poco aumentando así la temperatura del horno: 110 ° C por 1 min; primera inclinación de 2 ° C/min a 154 ° C; segundo gradiente de 5 ° C/min hasta 300 ° C; mantener la temperatura a 300 ° C durante 10 minutos.
      5. Procedimiento de detección: Para cada modo de derivatización, inyectar una muestra (1 μl) en modo de escaneo con ionización de impacto del electrón positivo en 70 eV y tomar nota del tiempo de retención de cada aminoácido.
      6. Use estos valores para definir las ventanas de tiempo en el cromatograma y para los diferentes iones seleccionados, que son característico de cada aminoácido y se enumeran en la tabla 3; Estos valores deben ser incluidos para cada aminoácido. Incluir esta información en el programa de detección de SIM y ejecutar el análisis en modo SIM con ionización de impacto positivo electrones a 70 eV.
   2. Recoger los resultados de los análisis; es decir, para cada aminoácido, anotar un racimo de intensidades que corresponden a sus diferentes masas isotopomers. Procesar los datos usando el dedicatedsoftware¹⁷ corregir natural etiquetado y calcular el enriquecimiento isotópico de los aminoácidos proteinogenic (definido como la fracción marcada de un aminoácido con respecto a su importe total en la proteína muestras).
      Nota: El enriquecimiento isotópico de una molécula (es decir), expresado como un porcentaje, se calcula dividiendo la suma de las intensidades corregidas de la masa isotopomers con etiqueta (m₁, m₂,... m_n) por la suma de la corrección intensidades de todas las masas isotopomers (m₀, m₁, m₂,... m_n):
      I. E. = (m₁ + m₂ +... + m_n) / (m₀ + m₁+ m₂ +... + m_n)

5. cuantificación y enriquecimiento isotópico de compuestos volátiles

1. Extracción de compuestos volátiles etiquetados
   1. Añadir 10 μl de estándares internos deuterados a 5 mL del sobrenadante (concentración final de compuestos deuterados: 100 μg/L) en un tubo de vidrio de 15 mL. Añadir 1 mL de diclorometano, bien cerrar los tubos y agitar en una plataforma oscilante durante 20 min, centrifugar durante 5 min a 3.000 x g y recoger la fase orgánica inferior en un tubo de vidrio de 15 mL. Repetir la extracción en diclorometano.
   2. Seque el extracto orgánico más 500 mg de sulfato de sodio anhidro y recoger la fase líquida con una pipeta Pasteur. Concentrar el extracto por un factor de cuatro bajo flujo de nitrógeno y transferir a un frasco de muestreadores de GC.
2. GC-MS cuantificación de compuestos volátiles
   1. Equipar el cromatógrafo de gases con una columna capilar de sílice fundida de 30 m x 0.25 mm con espesor de película de 0,25 μm y aplique un flujo constante de helio de 1,0 mL/min., mantenga el inyector y la línea de transferencia a 250 ° C.
   2. Inyectar 2 μl de muestra con un cociente de la división de 10:1 y separar las moléculas volátiles extraídas con el siguiente perfil de temperatura de horno: mantener la temperatura durante 3 minutos a 40 ° C, aumenta en 4 ° C/min hasta 220 ° C y luego mantener el horno a 220 ° C por 20 min.
   3. Detectar los compuestos mediante un espectrómetro de masas con su temperatura de fuente regulada a 230 ° C y su temperatura de espectrómetro de masas cuadrupolo a 150 ° C. Registrar los espectros de masas en el modo seleccionado Ion de monitoreo (SIM) con ionización de impacto positivo electrones a 70 eV y el uso de los racimos de iones específicos para los compuestos volátiles que se reportan en la tabla 4.
   4. Use una calibración externa de 7 puntos para cuantificar las concentraciones de las moléculas volátiles de la suma de las intensidades de la racimo del ion correspondiente. Preparar las soluciones madre de cada compuesto (10 g/L) en etanol al 100%. Luego, preparar soluciones estándar para cada clase de moléculas volátiles (ésteres etílicos, acetatos, alcoholes y ácidos) mediante la mezcla de soluciones. Por último, diluir diferentes cantidades de las soluciones estándar en una solución hidroalcohólica de 12% con 5 g/L de ácido tartárico con el pH ajustado a 3.3 para preparar soluciones de calibración.
   5. En paralelo, corregir para el etiquetado natural de las intensidades de cada racimo del ion y calcular el enriquecimiento isotópico de compuestos volátiles, que se define como la fracción marcada de las moléculas y se expresa como un porcentaje con el software dedicado ¹⁷.

6. cálculos para un análisis integrado del conjunto de datos

1. Colección de los datos en bruto
   1. Usando las hojas de cálculo se muestra en las tablas 5, 6, 7 y 8, Introduzca los valores de datos que corresponden a la concentración de aminoácidos extracelulares, peso seco de la célula, contenido de proteína de las células, la concentración de moléculas volátiles e isotópica enriquecimiento de proteinogenic aminoácidos y moléculas volátiles.
      Nota: Los datos mostrados en las tablas se expresan en milímetros. Todos los resultados se expresan en mg/L también multiplicando los valores en mM por el peso molecular de cada molécula o en mg/L N multiplicando la concentración milimolar de un aminoácido proteinogénico por la masa atómica del nitrógeno (14 u) y por la cantidad de nitrógeno ato MS que son proporcionados por el catabolismo de esta molécula.
   2. Calcular el porcentaje de masa de cada aminoácido en las proteínas dividiendo la cantidad en mg/L en el hidrolizado por la cantidad total de aminoácidos (su suma en mg/L).
   3. Calcular medias, desviaciones estándar y errores estándar de la media de los datos que se obtuvieron en los experimentos independientes.
   4. Calcular la concentración ionizada (mg/L) para cada aminoácido multiplicando el porcentaje de este aminoácido en las proteínas (mg aa/g proteínas) por la fracción proteica de la biomasa (g proteínas/g DW) y el contenido de peso seco (biomasa) en el medio (g DW/L).
2. ¹⁵ N experimentos de trazador isotópico
   1. Las hojas de cálculo que se presentan en la Tabla 9, calcular las fracciones etiquetadas y sin etiqueta de nitrógeno que están presentes en los aminoácidos proteinogenic (expresados en mg/L N) de su concentración total (expresado en mg/L N) y su enriquecimiento isotópico. Para cada aminoácido, la fracción marcada corresponde al producto entre su concentración total y su enriquecimiento isotópico, y la parte es la diferencia entre el total y los montos etiquetados.
   2. Luego, determinar la fracción de nitrógeno total en las proteínas que contiene los aminoácidos proteinogenic cuantificados en este estudio suma la cantidad total de Ala, Gly, Val, Asp, Phe, Leu, Ile, Thr, Ser, Pro, Lys, His, Glu y Arg (en mg/L N) y dividiendo el total de una montaje de nitrógeno contenido en las proteínas por esta suma.
   3. Calcular el nitrógeno proporcionado por arginina, glutamina o amonio que fue recuperado en los ácidos ionizada cuantificados en este estudio mediante la suma de la fracción marcada (en mg/L N) proteinogenic aminoácidos fueron cuantificados en el estudio (Ala, Gly, Val, Asp, Phe, Leu, Ile, Thr, Ser, Pro, Lys, His, Glu y Arg) durante los experimentos en presencia de ¹⁵N-etiquetada arginina, glutamina, o amonio y dividir esta fracción de nitrógeno marcado por la cantidad total de nitrógeno en la cuantificada proteinogenic aminoácido ácidos.
   4. Evaluar la contribución de los 3 aminoácidos más abundantes a la piscina intracelular de nitrógeno utilizado para la biosíntesis de novo mediante la combinación de datos de los ¹³C y ¹⁵N isótopo trazador experimentos (hoja de cálculo en el cuadro 7).
   5. De la cantidad total (expresada en mM) de ionizada Val, Leu, Ile y Thr, deducir la parte derivada de la incorporación directa de compuestos consumidos (¹³C experimentos) y la parte que fue sintetizado de novo utilizando nitrógeno de 3 fuentes principales para determinar la fracción que fue sintetizado de novo con nitrógeno de los aminoácidos.
   6. Luego, calcular el cociente de la cantidad de aminoácido sintetizado de novo de usando el nitrógeno suministrado por Gln, Arg y NH₄⁺ (suma expresada en mM) a la cantidad total de aminoácidos proteinogenic (en mM) para cuantificar la contribución de arginina, glutamina y el amonio a la piscina de nitrógeno intracelular.
3. ¹³ C trazador isotópico experimentos
   1. Calcular las fracciones de los aminoácidos proteinogenic de concentraciones expresadas en mM y enriquecimientos isotópicos de proteinogenic aminoácidos obtenidos durante los experimentos en presencia de ¹³C-etiquetada Leu, Val, etiquetadas y sin etiqueta Ile o Thr. (ver 6.2.1, tabla 10).
   2. Calcular las fracciones de compuestos volátiles de las concentraciones expresadas en mM y enriquecimientos isotópicos de compuestos volátiles obtenidos durante los experimentos en presencia de ¹³C-etiquetada Leu, Val, Ile y Thr ( etiquetadas y sin etiqueta Tabla 10).

Resultados

Figura 3 presenta un diagrama esquemático del flujo de trabajo que llevó a cabo para investigar la gestión de las múltiples fuentes de nitrógeno que se encuentran durante la fermentación la levadura.
Para diferentes puntos de muestreo, las características de los parámetros biológicos, crecimiento, patrones de consumo de nitrógeno y el perfil de aminoácidos proteinogenic-muestran una alta reproducibilidad entre las fermentaciones (

Discusión

Cuantificación de la partición de los compuestos a través de redes metabólicas experimentos de trazador isotópico es un enfoque prometedor para entender el funcionamiento del metabolismo microbiano. Esta metodología, mientras que aplica con éxito con uno o dos sustratos etiquetados, no puede ser implementada actualmente para estudiar el metabolismo de varias fuentes usando múltiples etiquetados isótopos elementales (es decir, más de dos substratos). De hecho, las técnicas analíticas disponibles permi...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
D-Glucose	PanReac	141341.0416
D-Fructose	PanReac	142728.0416
DL-Malic acid	Sigma Aldrich	M0875
Citric acid monohydrate	Sigma Aldrich	C7129
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P5379
Potassium sulfate	Sigma Aldrich	P0772
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	230391
Calcium chloride dihydrate	Sigma Aldrich	C7902
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S9625
Ammonium chloride	Sigma Aldrich	A4514
Sodium hydroxide	Sigma Aldrich	71690
Manganese sulfate monohydrate	Sigma Aldrich	M7634
Zinc sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	Z4750
Copper (II) sulfate pentahydrate	Sigma Aldrich	C7631
Potassium iodine	Sigma Aldrich	P4286
Cobalt (II) chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	C3169
Boric acid	Sigma Aldrich	B7660
Ammonium heptamolybdate	Sigma Aldrich	A7302
Myo-inositol	Sigma Aldrich	I5125
D-Pantothenic acid hemicalcium salt	Sigma Aldrich	21210
Thiamine, hydrochloride	Sigma Aldrich	T4625
Nicotinic acid	Sigma Aldrich	N4126
Pyridoxine	Sigma Aldrich	P5669
Biotine	Sigma Aldrich	B4501
Ergostérol	Sigma Aldrich	E6510
Tween 80	Sigma Aldrich	P1754
Ethanol absolute	VWR Chemicals	101074F
Iron (III) chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	236489
L-Aspartic acid	Sigma Aldrich	A9256
L-Glutamic acid	Sigma Aldrich	G1251
L-Alanine	Sigma Aldrich	A7627
L-Arginine	Sigma Aldrich	A5006
L-Cysteine	Sigma Aldrich	C7352
L-Glutamine	Sigma Aldrich	G3126
Glycine	Sigma Aldrich	G7126
L-Histidine	Sigma Aldrich	H8000
L-Isoleucine	Sigma Aldrich	I2752
L-Leucine	Sigma Aldrich	L8000
L-Lysine	Sigma Aldrich	L5501
L-Methionine	Sigma Aldrich	M9625
L-Phenylalanine	Sigma Aldrich	P2126
L-Proline	Sigma Aldrich	P0380
L-Serine	Sigma Aldrich	S4500
L-Threonine	Sigma Aldrich	T8625
L-Tryptophane	Sigma Aldrich	T0254
L-Tyrosine	Sigma Aldrich	T3754
L-Valine	Sigma Aldrich	V0500
13C5-L-Valine	Eurisotop	CLM-2249-H-0.25
13C6-L-Leucine	Eurisotop	CLM-2262-H-0.25
15N-Ammonium chloride	Eurisotop	NLM-467-1
ALPHA-15N-L-Glutamine	Eurisotop	NLM-1016-1
U-15N4-L-Arginine	Eurisotop	NLM-396-PK
Ethyl acetate	Sigma Aldrich	270989
Ethyl propanoate	Sigma Aldrich	112305
Ethyl 2-methylpropanoate	Sigma Aldrich	246085
Ethyl butanoate	Sigma Aldrich	E15701
Ethyl 2-methylbutanoate	Sigma Aldrich	306886
Ethyl 3-methylbutanoate	Sigma Aldrich	8.08541.0250
Ethyl hexanoate	Sigma Aldrich	148962
Ethyl octanoate	Sigma Aldrich	W244910
Ethyl decanoate	Sigma Aldrich	W243205
Ethyl dodecanoate	Sigma Aldrich	W244112
Ethyl lactate	Sigma Aldrich	W244015
Diethyl succinate	Sigma Aldrich	W237701
2-methylpropyl acetate	Sigma Aldrich	W217514
2-methylbutyl acetate	Sigma Aldrich	W364401
3-methyl butyl acetate	Sigma Aldrich	287725
2-phenylethyl acetate	Sigma Aldrich	290580
2-methylpropanol	Sigma Aldrich	294829
2-methylbutanol	Sigma Aldrich	133051
3-methylbutanol	Sigma Aldrich	309435
Hexanol	Sigma Aldrich	128570
2-phenylethanol	Sigma Aldrich	77861
Propanoic acid	Sigma Aldrich	94425
Butanoic acid	Sigma Aldrich	19215
2-methylpropanoic acid	Sigma Aldrich	58360
2-methylbutanoic acid	Sigma Aldrich	193070
3-methylbutanoic acid	Sigma Aldrich	W310212
Hexanoic acid	Sigma Aldrich	153745
Octanoic acid	Sigma Aldrich	W279900
Decanoic acid	Sigma Aldrich	W236403
Dodecanoic acid	Sigma Aldrich	L556
Fermentor 1L	Legallais	AT1357	Fermenter handmade for fermentation
Disposable vacuum filtration system	Dominique Deutscher	029311
Fermenters (250 ml)	Legallais	AT1352	Fermenter handmade for fermentation
Sterile tubes	Sarstedt	62.554.502
Fermentation locks	Legallais	AT1356	Fermetation locks handmade for fermentation
BactoYeast Extract	Becton, Dickinson and Company	212750
BactoPeptone	Becton, Dickinson and Company	211677
Incubator shaker	Infors HT
Particle Counter	Beckman Coulter	6605697	Multisizer 3 Coulter Counter
Centrifuge	Jouan		GR412
Plate Butler Robotic system	Lab Services BV	PF0X-MA	Automatic instrument
Plate Butler Software	Lab Services BV		Robot monitor software
RobView			In-house developed calculation software
My SQL			International source database
Cimarec i Telesystem Multipoint Stirrers	Thermo Fisher Scientific	50088009	String Drive 60
BenchBlotter platform rocker	Dutscher	60903
Ammonia enzymatic kit	R-Biopharm AG	5390
Spectrophotometer cuvettes	VWR	634-0678
Spectrophotometer UviLine 9400	Secomam
Amino acids standards physiological - acidics and neutrals	Sigma Aldrich	A6407
Amino acids standards physiological - basics	Sigma Aldrich	A6282
Citrate lithium buffers - Ultra ninhydrin reagent	Biochrom	BC80-6000-06
Sulfosalycilic acid	Sigma Aldrich	S2130
Norleucine	Sigma Aldrich	N1398
Biochrom 30 AAA	Biochrom
EZChrom Elite	Biochrom		Instrument control and Data analysis software
Ultropac 8 resin Lithium	Biochrom	BC80-6002-47	Lithium High Resolution Physiological Column
Filter Millex GV	Merck Millipore	SLGVX13NL	Millex GV 13mm (pore size 0.22 µm)
Membrane filter PALL	VWR	514-4157	Supor-450 47mm 0.45µm
Vacuum pump Millivac Mini	Millipore	XF5423050
Aluminium smooth weigh dish 70mm	VWR	611-1380
Precision balance	Mettler		Specifications AE163
Dimethyl sulfoxid dried	Merck	1029310161	(max. 0.025% H2O) SeccoSolv
Combustion oven	Legallais
Pierce BCA protein assay kit	Interchim	UP40840A
Formic acid	Fluka	94318
Hydrogen peroxide	Sigma Aldrich	H1009
Hydrochloric Acid Fuming 37% Emsure	Merck	1003171000	Grade ACS,ISO,Reag. Ph Eur
Lithium acetate buffer	Biochrom	80-2038-10
Commercial solution of hydrolyzed amino acids	Sigma Aldrich	AAS18
L-Methionine sulfone	Sigma Aldrich	M0876
L-Cysteic acid monohydrate	Sigma Aldrich	30170
Pyrex glass culture tubes	Sigma Aldrich	Z653586
Pyridine	Acros Organics	131780500	99% Extrapure
Ethyl chloroformate	Sigma Aldrich	23131
Dichloromethane	Sigma Aldrich	32222
Vials	Sigma Aldrich	854165
Microinserts for 1.5ml vials	Sigma Aldrich	SU860066
GC/MS	Agilent Technologies	5890 GC/5973 MS
Chemstation	Agilent Technologies		Instrument control and data analysis software
Methanol	Sigma Aldrich	34860	Chromasolv, for HPLC
Acetonitrile	Sigma Aldrich	34998	ChromasolvPlus, for HPLC
N,N-Dimethylformamide dimethyl acetal	Sigma Aldrich	394963
BSTFA	Sigma Aldrich	33024
DB-17MS column	Agilent Technologies	122-4731	30m*0.25mm*0.15µm
Sodium sulfate, anhydrous	Sigma Aldrich	238597
Technical nitrogen	Air products	14629
Zebron ZB-WAX column	Phenomenex	7HG-G007-11	30m*0.25mm*0.25µm
Helium BIP	Air products	26699
Glass Pasteur pipettes	VWR	612-1702