JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

سؤال وجواب-1 (هلا ه في الإنسان) ينتمي إلى مجموعة من جزيئات معقدة 1b histocompatibility الرئيسية غير الكلاسيكية. لقد ثبت التحصين مع [ابيتوبس] سؤال وجواب 1-ملزم زيادة تنظيم خاص بالانسجة المناعية، والتخفيف من عدة أمراض المناعة الذاتية. هذه الوثيقة يصف لنا استراتيجية مكتبة ببتيد متداخلة لتحديد سؤال وجواب-1 [ابيتوبس] في بروتين.

Abstract

سؤال وجواب-1 (هلا ه في الإنسان) ينتمي إلى مجموعة من هيستوكومباتيبيليتي الرئيسية غير الكلاسيكية المعقدة 1b جزيئات (MHC-Ib). البيانات الأخيرة تشير إلى أن جزيئات سؤال وجواب-1 تلعب أدواراً هامة في مسح الخلايا للسلامة الهيكلية والوظيفية، وحمل النظام المناعي، وتحد من الاستجابات المناعية للعدوى الفيروسية. بالإضافة إلى ذلك، زيادة وظيفية من سؤال وجواب 1-المقيدة-CD8+ تي الخلايا عن طريق حانمه التحصين قد أظهرت الآثار العلاجية في عدة نماذج حيوانية أمراض المناعة الذاتية، مثل النخاع حساسية التجريبية، الكولاجين-الناجم عن التهاب المفاصل، ومرض السكري غير السمنة. ولذلك، هناك حاجة ملحة لأسلوب الذي يمكن، بسرعة وكفاءة تحديد الوظيفية [ابيتوبس] 1 سؤال وجواب في بروتين. هنا، يمكننا وصف بروتوكول يستخدم CD8 سؤال وجواب 1-المقيدة-+ خلية T خطوط محددة لمكتبة ببتيد (OLP) متداخلة لتحديد سؤال وجواب-1 [ابيتوبس] في بروتين. تحتوي هذه المكتبة OLP على 15-مير الببتيدات المتداخلة التي تغطي كامل طول البروتين، وتداخل الببتيدات المتاخمة بالأحماض الأمينية 11. باستخدام هذا البروتوكول، حددنا مؤخرا حانمه سؤال وجواب-1 9-مير في المايلين أوليجوديندروسيتي بروتين سكري (موج). وأبدى هذا حانمه موج سؤال وجواب-1 المعين حديثا لحمل CD8 حانمه على حدة، وسؤال وجواب 1-المقيدة-+ تي الخلايا أن التنظيم المناعي المحسن المايلين على حدة. ولذلك، هذا البروتوكول مفيد للتحقيق في المستقبل من رواية أهداف ومهام CD8 سؤال وجواب 1-المقيدة-+ تي الخلايا.

Introduction

سؤال وجواب-1 ينتمي إلى مجموعة من هيستوكومباتيبيليتي الرئيسية غير الكلاسيكية المعقدة 1b جزيئات (MHC-Ib) في الفئران. في homolog الإنسان هو هلا-هاء وقد أثبتت الأدلة السابقة أن جزيئات سؤال وجواب-1 الوظائف البيولوجية الهامة. أولاً، سؤال وجواب-1 الجزيئات تلعب دوراً مهما في مسح الخلايا للسلامة الهيكلية والوظيفية. وفي هذا الصدد، تطورت جزيئات سؤال وجواب-1 عدة استراتيجيات لرصد وظيفة طبيعية للخلية. واحد هذه الاستراتيجية تمكن جزيئات سؤال وجواب-1 نموذج المجمعات مع زعيم مجهزة ببتيد (حانمه)، أي سؤال وجواب-1 حاسما المعدل (قدم) التي يتم معالجتها من جزيئات MHC-Ia الكلاسيكية في هيولى1. هذه المجمعات سؤال وجواب-1/قدم في وقت لاحق عرض على سطح الخلية وربط لمستقبلات NKG2A المثبطة في ناغورني كاراباخ الخلايا تمنع ناغورني كاراباخ قتل النشاط2. إذا فقدت التعبير عن جزيئات MHC-Ia، يصبح الحساسة إلى ناغورني كاراباخ أسفر عن مقتل2خلية (مثل خلية خبيثة). الاستراتيجية الأخرى التي تمكن جزيئات 1 سؤال وجواب لتشكيل جديد سؤال وجواب-1/حانمه المجمعات على سطح خلية قصور في برنامج المشورة التقنية (متعهد النقل المرتبطة بتجهيز مستضد)3 و/أو آراب (أمينوبيبتيداسي هيولى المرتبطة تجهيز مستضد)4 (كل القصور غالباً ما تحدث في الخلايا الخبيثة). يمكن ثم سلم الخلية التي تعرب عن هذه المجمعات سؤال وجواب-1/حانمه الجديدة والقضاء بسؤال وجواب 1-المقيدة-CD8 حانمه-المحددة+ تي الخلايا. ثانيا، حمل جزيئات سؤال وجواب-1 تنظيم المناعة5. وفي هذا الصدد، أظهرت مجمعات سؤال وجواب-1/حانمه لحفز CD8+ خلايا تي (تريغ) التنظيمية الهامة للوقاية من الأضرار بوساطة جهاز المناعة الذاتي-الأنسجة6،،من78 ،،من910. وثالثاً، سؤال وجواب 1-المقيدة-CD8+ تريغ الخلايا قد ثبت أن تحد من الاستجابات المناعية ضد العدوى الفيروسية11.

ولذلك، زيادة معينة محددة حانمه سؤال وجواب-1-ريستريكتريد CD8+ تي الخلايا استراتيجية واعدة يحتمل أن للقضاء على خلايا غير طبيعية لتعزيز النظام المناعي للتحكم في الحجم الاستجابات المناعية الناجمة عن الفيروس. في حين أنه لم يحدد ما إذا كانت زيادة محددة حانمه CD8 سؤال وجواب 1-المقيدة-+ تي الخلايا يمكن أن تعزز مراقبة محصنة وتحد من الاستجابات المناعية الناجمة عن الفيروس، ولدينا مختبرات وغيرها قد أظهرت بوضوح أن يمكن زيادة التحصين مع [ابيتوبس] سؤال وجواب-1 وظيفة CD8 سؤال وجواب 1-المقيدة-+ تريغ الخلايا المحددة لخلايا CD4 الذاتية المسببة للأمراض+ تي الخلايا، مما أدى إلى السيطرة الفعالة على CD4+ أمراض المناعة الذاتية بوساطة الخلايا تي في نماذج متنوعة من الحيوانات مثل النخاع حساسية التجريبية (نموذج حيوان البشرية التصلب المتعدد)6،10،7من التهاب المفاصل الناجم عن الكولاجين (نموذج حيوان من التهاب المفاصل الرثياني البشرية)، و السكري غير البدناء (نموذج حيوان مرض السكري من النوع البشري 1)8. بالإضافة إلى ذلك، لقد اكتشفنا أن التحصين مع حانمه سؤال وجواب-1 خاصة بأنسجة ويؤدي إلى محددة السيطرة على الالتهاب المناعي بوساطة في هذه الأنسجة من خلال زيادة CD8 الخلايا+ تريغ12. النجاحات المذكورة أعلاه من الدراسات الإكلينيكية تشير إلى حاجة لإجراء تقييم كامل للتحصين حانمه 1 سؤال وجواب لعلاج أمراض المناعة بوساطة الأنسجة على حدة، ويحتمل أن تكون للعلاج من الأمراض الأخرى المرتبطة بأوجه القصور في برنامج المشورة التقنية و آراب.

وبناء على ذلك، هناك طلب لتكنولوجيا التي يمكن موثوق بها وسرعة تحليل [ابيتوبس] 1 سؤال وجواب في بروتين. وفي هذا الصدد، وصف عدد محدود من هامة بيولوجيا 1 سؤال وجواب [ابيتوبس]. تم تحديد معظم هذه [ابيتوبس] سؤال وجواب-1 سيرينديبيتوسلي خلال دراسة CD8+ تي الخلية الردود على البكتيريا13والخلايا ناقصة في الحنفية3، قاصرة عن آراب4خلايا والخلايا التي تسبب ع6، 9. ولذلك يستحسن تقنية إنتاجية عالية للتعرف على [ابيتوبس] سؤال وجواب-1 هامة بيولوجيا في بروتين محددة. في ما يلي، يمكننا وصف استراتيجية متداخلة لمكتبة ببتيد (OLP) الخرائط الوظيفية [ابيتوبس] 1 سؤال وجواب في بروتين باستخدام CD8 سؤال وجواب-1-ريسرتيكتيد+ خلية T خطوط محددة لتجمع OLP (OLP_pool) من البروتين.

Protocol

أجريت جميع التجارب امتثالا رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام بروتوكول أقرته لجنة الاستخدام في جامعة تكساس في ال باسو، وجامعة لوما ليندا ورعاية الحيوان.

1-إنشاء مكتبة OLP تغطي كامل طول البروتين

  1. تصميم على مكتبة OLP فيه الببتيدات جميع 15-مير في الطول، وتتداخل الببتيدات المتاخمة بالأحماض الأمينية 11.
    ملاحظة: في دراسة OLP موج، تسلسل السلائف موج [موس موسكولوس] كان استردادها من قاعدة بيانات البروتين نكبي باتباع هذا الرابط: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_034944. تم استخدام السلائف موج (الأحماض الأمينية 247)، الذي تضمن إشارة والببتيدات ناضجة، نظراً لأن معظم المبلغ عنها سؤال وجواب-1 (هلا-ﻫ) [ابيتوبس] تقع في إشارة الببتيدات (مثلاً قدم1). تبدأ في نهايته N، تم تحديد تسلسلات الببتيدات 15-مير أن تتداخل الببتيدات المجاورة اثنين من الأحماض الأمينية 11 (الشكل 1). ومن ثم فقد حددت الضبط 59 دعم المشتريات في السلائف موج 247 من الأحماض الأمينية. ومع ذلك، يمكن أن تتراوح OLP الماضي من 12 إلى 15-مير تبعاً لطول البروتين. بالإضافة إلى ذلك، علينا أن نختار المكتبة 15-مير لأن نحن وآخرون أظهرت أن الببتيدات 15-مير، عند إضافة إلى الخلايا الجذعية (DCs) أو الضامة، يمكن أن تكون كفاءة معالجة في [ابيتوبس] للاعتراف بواسطة CD8 الخلايا+ ر14،15 .
  2. شراء كل الببتيد الفردية تجارياً. 5 ملغ في الببتيد ينبغي أن يكون كافياً للفرز. يمكن دعم المشتريات ومبتورا الببتيدات (6.1 خطوة) ديسالتيد الببتيدات (نقاء هو حوالي 50-70 في المائة). نقاء الببتيد الأمثل (6.2 خطوة) التي سيتم استخدامها لتوليد تيترامير والتحليلات البيولوجية المقبلة ينبغي أن يكون > 90%. إعادة تشكيل الببتيدات تحت ظروف معقمة.
  3. جعل 50 ملغم/مل الأرصدة الببتيد الفردية في [دمس] 100%. لإضافة 5 ملغ لكل الببتيد، 100 ميكروليتر من [دمس] في كل أنبوب، مزيج، وتخزين الببتيدات في-20 درجة مئوية. سيتم استخدام هذه الأرصدة لجعل أسهم OLP_pool لتوليد CD8 خطوط+ خلية T رد الفعل OLP_pool. وبالإضافة إلى ذلك، سيتم أيضا استخدام هذه الأرصدة جعل 10 ملغ/مل الأرصدة الببتيد الفردية لتحديد قدرة كل الببتيد الفردية لتحفيز استجابة سؤال وجواب 1-المقيدة-في CD8 OLP_pool المتفاعلة+ خط الخلية T.
  4. جعل OLP_pool الأسهم بإضافة وحدة تخزين متساوية لكل الببتيد في أنبوب جديد. ويتضمن هذا المخزون OLP_pool [دمس] 100%. في هذه الدراسة OLP موج، كان هناك 59 دعم المشتريات12. ومن ثم، كان تركيز كل الببتيد في OLP_pool 847.46 ميكروغرام/مل (50 ملغم/مل ÷ 59).
  5. جعل 10 ملغ/مل الأرصدة الببتيد الفردية بتمييع (5 س) رصيد 50 ملغ/مل في العقيمة ح2س في صفيحة 96 الخامس-أسفل بئر (هذا المخزون يحتوي على 20% [دمس]). تجعل هذه الأرصدة في صفيحة 96-جيدا لأنه سيتم البت في رد سؤال وجواب 1-مقيدة بكل الببتيد الفردية في صفيحة 96-جيدا باستخدام ماصة الأقنية قناة 8 أو 12.
    ملاحظة: ينبغي أن تضعف الببتيدات كافة، بما في ذلك دعم المشتريات والببتيدات مبتوراً، في صفيحة 96 الخامس-أسفل بئر أو رف عينة 96-بئر مليئة بأنابيب 1 مل حيث يتم فحص مكتبة الببتيد في لوحات 96-جيدا ماصة متعددة باستخدام. إذا كان من الصعب أن تخفف من ببتيد، إضافة 1 قطره هيدروكسيد الصوديوم ن الحكيم للمساعدة في حل الببتيد.

2-فتيلة كب-/-- دب-/- CD8+ "خلايا تي" مع ك نابض OLP_poolب-/- دب-/- الخلايا الجذعية (DCs).

ملاحظة: هناك اثنين من الآليلات 1 سؤال وجواب الرئيسية: واحد سؤال وجواب-1، والآخر سؤال وجواب-1ب. منذ الحيوانات استخداماً للبحث الأكاديمي، مثل C57BL/6 وبالب/ج الفئران، تحمل سؤال وجواب-1ب، هذا البروتوكول وصف الإجراء لتعيين سؤال وجواب-1ب [ابيتوبس] في بروتين. CD8+ تي الخلايا المستخدمة في هذا البروتوكول يتم تنقيته من كب-/--دب-/- الفئران (خلفية C57BL/6) في CD8 التي+ تي مقيدة الخلايا غالباً بواسطة جزيئات MHC-Ib غير التقليدية بما في ذلك ضمان الجودة-1.

  1. إنتاج وحدات تحكم المجال Dc المشتقة من نخاع العظام كما هو موضح سابقا12.
    1. باختصار، ثقافة تعليق خلية مفردة نخاع العظام (1 × 106 خلايا/مل) في المتوسط 10 ربمي (RPMI 1640 تستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين، 5.5 × 10-5 م 2-mercaptoethanol، بيروفات صوديوم 1 مم، ومم 0.1 من الأحماض الأمينية غير الأساسية) يحتوي على 10 يو/مليلتر إيل-4 ويو/مليلتر 100 GM-CSF في لوحة 6-جيدا (4 مل في البئر) عند 37 درجة مئوية، 5% CO2.
    2. وبعد يومين من ذلك إزالة الخلايا غير ملتصقة بعناية وإضافة وسائط جديدة والسيتوكينات.
    3. بعد استزراع الخلايا ليومين آخرين، نقل الخلايا غير ملتصقة يحتوي على وسائط جديدة والسيتوكينات في لوحة 6-بئر جديدة.
    4. الثقافة الخلايا ليومين آخرين وتتجدد مع وسائط جديدة والسيتوكينات التي تحتوي على لبس (0.1 ميكروغرام/مل) لتنشيط وحدات تحكم المجال Dc.
    5. في وقت لاحق، جمع ح 24 وحدات تحكم المجال Dc للتجارب.
  2. تشعيع وحدات تحكم المجال Dc مع 3000 راد.
    1. وبدلاً من ذلك، التعامل مع وحدات تحكم المجال Dc (5 × 107 خلية/مل) مع ميتوميسين ج (50 ميكروغرام/مل) في برنامج تلفزيوني في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 20 إضافة ربمي-0 (1640 RPMI دون المصل) ملء الأنبوب (~ 12 مل) وتدور الخلايا لمدة 10 دقيقة في أعلى الجدول أجهزة الطرد مركزي في 300 × supernatants تجاهل زاي وربيع t إجراء الغسيل مرتين أخريين. هذه يغسل ثلاث الحاسمة لأنه قد تمنع أي تتبع كمية ميتوميسين ج رد CD8+ تي الخلايا أثناء DC-T خلية ثقافة المشارك.
  3. ضبط تركيز العاصمة إلى 5 × 106 خلايا/مل في متوسط خالية من المصل (الهدف الخامس خالية من المصل المتوسطة وتستكمل مع 5.5 × 10-5 م 2-mercaptoethanol، بيروفات صوديوم 1 مم، ومم 0.1 من الأحماض الأمينية غير الأساسية).
  4. إضافة حل الأسهم OLP_pool، الذي يحتوي على 100% [دمس]، إلى وحدات تحكم المجال Dc حيث لا تكون نهائية [دمس] تركيز 0.5% (200 س). في هذه الدراسة OLP موج، كان تركيز كل OLP في OLP_pool 847.46 ميكروغرام/مل؛ ومن ثم كان التركيز النهائي لكل OLP في ثقافة العاصمة 4.2 ميكروغرام/مل (ميكروغرام/مل 847.46 ÷ 200).
ومع ذلك، يمكن تحجيم هذا التركيز ما يصل إلى 100 ميكروغرام/مل طالما بقي أقل من 1% من التركيز [دمس] في خلية ثقافة.
  • احتضان وحدات تحكم المجال Dc في درجة حرارة الغرفة ح 3 واهتزاز الخلايا بلطف كل 15 دقيقة.
  • خلال هذه الفترة الحضانة، تنقية CD8+ تي الخلايا من المقطوع الطحال أو الغدد الليمفاوية كب-/--دب-/- الفئران باستخدام CD8 تجارية+ تي الخلية مواد تنقية، ضبط تركيز الخلية إلى 10 × 106 خلايا/مل في المتوسط خالية من المصل الذي يحتوي على 50 يو/مليلتر انترلوكين 2 (إيل-2) و U/mL 100 إيل-7.
  • الآن، إضافة CD8+ تي الخلايا في لوحة 48-جيدا ك 0.5 مل/جيدا (بعد إضافة 0.5 مل/جيدا من Dc OLP_pool نابض في خطوة 2.8، تركز CD8 النهائي+ تي سوف تكون الخلايا 5 × 106 خلايا/مل).
    ملاحظة: CD8+ تي يمكن تنقية الخلايا من الماوس الطحال والغدد الليمفاوية استخدام CD8 إيجابية عزل عدة باتباع التعليمات المقدمة من الشركة المصنعة. CD8+ تي الخلايا التي تم الحصول عليها مجاناً من الخرز.
  • إضافة 0.5 مل/بئر إلى لوحة 48-كذلك يحتوي CD8 وتدور إلى أسفل نابض OLP_pool DCs (300 x ز، 10 دقيقة) في "تشكيل الرايت" DCs نابض OLP_pool إلى 2 × 106 خلايا/مل في الأجلين المتوسط وخاليا من المصل+ تي الخلايا (تركيز OLP النهائي DCs نابض _pool 1 × 106 خلايا/مل، التركيز النهائي ل CD8+ تي الخلايا 5 × 106 خلايا/مل ويكون التركيز النهائي لايل-2 25 يو/مليلتر والتركيز النهائي لايل-7 هو 50 يو/مليلتر). ثقافة الخلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
  • في يوم 4، إزالة وتجاهل ميكروليتر حوالي 400 من المتوسط الثقافة وإضافة 500 ميكروليتر من المتوسط خالية من المصل الطازجة التي تحتوي على 100 يو/مليلتر إيل-2 ومليلتر 100U إيل-7 لكل بئر. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
  • في يوم 7 أو 8، إعادة تنشيط CD8 معبي OLP_pool+ تي الخلايا مع OLP_pool.

    • 3-ريستيموليشن CD8 معبي+ تي الخلايا مع الضامة نابض OLP_pool

    1. أربعة أيام قبل إعادة تنشيط CD8 معبي OLP_pool+ ر إعداد الخلايا، 2% (v/v) polyacrylamide حبة الحل: يغسل 2 غ حبات polyacrylamide مرتين في 20 مل خالية من الذيفان ح2س أو برنامج تلفزيوني. بيليه الخرز polyacrylamide بالطرد المركزي (400 س ز) لمدة 5 دقائق وريسوسبيند في 100 مل من برنامج تلفزيوني. اﻷوتوكﻻف في 15 رطل/م عن 20 دقيقة تخزين في درجة حرارة الغرفة.
    2. حقن الفئران إينترابيريتونيلي مع 1 مل/الماوس الحل حبة بولياكريلاميدي 2% العقيمة لجذب هجرة حيدات/الضامة في التجويف الصفاقى16.
    3. بعد أربعة أيام، التضحية الحيوانات بجرعة2 CO.
      1. تحت ظروف معقمة، قص فتح صغير في وسط البطن أن فتح ما يكفي لتمرير ماصة نقل 5 مل. تعبئة ماصة نقل مع ربمي-0 وإدراج الماصة في تجويف البطن من خلال فتح.
      2. شطف تجويف البطن من بيبيتينج. "الماصة؛" أصل سائل قدر ممكن من تجويف البطن في أنبوب عقيم (هذه هي الضامة البريتوني). كرر الخطوة شطف 4-5 مرات.
    4. تشعيع الضامة البريتوني مع 3000 راد.
      1. وبدلاً من ذلك، علاج الضامة البريتوني مع ميتوميسين ج (اتبع الإجراء الموضح في الخطوة 2، 2).
    5. ضبط تركيز الضامة البريتوني إلى 5 × 106 خلايا/مل في الأجلين المتوسط وخاليا من المصل. إضافة الأسهم OLP_pool (التركيز [دمس] النهائي أقل من 1 ٪) و M-CSF (التركيز النهائي = 100 يو/مليلتر).
      ملاحظة: في هذه الدراسة OLP موج، استخدمنا 0.5% [دمس]. وهكذا، كان OLP_pool موج الأسهم المخفف 200 × (مثلاً 1 ميكروليتر من OLP_Pool موج الأسهم أضيفت إلى 199 ميكروليتر من الضامة البريتوني). ومن ثم، تركيز كل OLP النهائي كان 4.2 ميكروغرام/مل).
    6. إضافة 200 ميكروليتر/بئر (1 × 106 خلايا/جيد) في لوحة 48-كذلك زراعة الأنسجة واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية ح 4.
    7. إزالة الخلايا غير ملتصقة والخرز بولياكريلاميدي بالغسيل لطيف مع 200 ميكروليتر/جيدا من قبل حرارة ربمي-0.
    8. جمع وتجمع OLP_pool معبي CD8+ تي الخلايا من 2.10 خطوة. ضبط OLP_pool معبي CD8+ تركيز خلية T إلى 1 × 106 خلايا/مل في المتوسط خالية من المصل الذي يحتوي على 25 يو/مليلتر إيل-2 و 50 يو/مليلتر من إيل-7. أضف 1 مل/بئر إلى لوحة 48-كذلك يحتوي الضامة البريتوني نابض OLP_pool.
    9. بعد أربعة أيام، تجديد المتوسطة في لوحة 48-جيدا. إزالة وتجاهل ميكروليتر حوالي 400 المتوسطة الثقافة في لوحات الثقافة 48-جيدا. إضافة 500 ميكروليتر جديدة خالية من المصل المتوسط تحتوي على 100 يو/مل إيل-2 و 100 مليلتر يو إيل-7 في كل بئر. ثقافة الخلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
    10. ثلاثة أو أربعة أيام وبعد دراسة CD8 تحقيقنا OLP_pool+ تي الخلايا لاستجابة محددة OLP_pool، سؤال وجواب 1-مقيدة بواسطة الإنزيم المرتبط بالانزيم إيمونوسبوت (اليسبوت). بعد هذه النقطة، إعادة تنشيط CD8+ تي الخلايا كل 7-10 أيام.
      ملاحظة: الضامة المفضلة لإعادة تنشيط CD8 معبي OLP_pool+ تي الخلايا. فقد لاحظنا أن CD8+ تي الخلايا إعادة تحفزها بلعم نمت أفضل من وحدات تحكم المجال Dc في المختبر.

    4-تحديد OLP_pool على حدة، وسؤال وجواب 1-المقيدة-الاستجابة في CD8 تحقيقنا OLP_pool خط الخلية T+

    ملاحظة: استجابة محددة OLP_pool، سؤال وجواب 1-المقيدة-في CD8 تحقيقنا OLP_pool+ خط الخلية T تتحدد بإفراز IFNγ بعد التحفيز OLP_pool حضور C1R أو C1R. سؤال وجواب-1ب الخلايا باستخدام مقايسة IFNγ السبت. ويمكن الحصول على خلايا C1R تجارياً. C1R. سؤال وجواب-1ب خلايا يمكن إنشاؤها بواسطة ترانسدوسينج الخلايا C1R مع ناقل لينتيفيرال 1 سؤال وجواب.

    1. إضافة المخفف من جسم المضادة-IFN-γ التقاط 100 ميكروليتر/جيدا في المخزن المؤقت لطلاء (PBS) في الآبار من صفيحة السبت.
    ختم واحتضان لوحة عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  • اليوم الثاني، تجاهل المخزن المؤقت الطلاء الذي يحتوي على الأجسام المضادة-IFN-γ الالتقاط وإضافة 200 ميكروليتر/جيدا-blocking الحل (خالية من المصل المتوسطة) واحتضان لوحة ح 2 في درجة حرارة الغرفة.
  • تشعيع C1R و C1R. سؤال وجواب-1ب الخلايا مع راد 9,600.
    1. وبدلاً من ذلك، يعامل C1R و C1R. سؤال وجواب-1ب الخلايا مع ميتوميسين C كما هو موضح في 2.2 خطوة إلا أن فترة العلاج سوف يكون 30 دقيقة.
  • ضبط C1R و C1R. سؤال وجواب-1ب الخلايا في المتوسط 4 × 106 خلايا/مل خالية من المصل.
  • تجاهل حل حظر في اللوحة وإضافة C1R و C1R. سؤال وجواب-1ب الخلايا في 50 ميكروليتر/البئر (200,000 الخلايا أيضا) ومزيج.
  • إضافة 50 ميكروليتر/بئر 100 x تضعف الأسهم OLP_pool (في المتوسط خالية من المصل) وتخلط بشكل صحيح. احتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة ح 2-3.
  • ضبط CD8 تحقيقنا OLP_pool+ تي الخلايا إلى 1-2 × 106 خلايا/مل في الأجل المتوسط خالية من المصل الذي يحتوي على 150 يو/مليلتر من إيل-7 وإضافة 50 ميكروليتر/البئر (50,000-100,000 الخلايا/جيد) على اللوحة. الطرد المركزي في اللوحة (58 س ز) لمدة 5 دقائق.
  • احتضان اللوحة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 بين عشية وضحاها.
  • نضح تعليق خلية. غسل الآبار 2 مرات مع المياه (دي) (250 ميكروليتر/جيد). تسمح الآبار ينقع لمدة 5 دقائق في كل خطوة من خطوات الغسيل.
  • الآبار يغسل 3 مرات مع "المخزن المؤقت ليغسل" أنا (برنامج تلفزيوني تحتوي على 0.05% Tween20). تسمح الآبار نقع لمدة 1 دقيقة في كل خطوة من خطوات الغسيل. تجاهل المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي.
  • إضافة 100 ميكروليتر من الكشف عن الأجسام المضادة المخفف في إضعاف المخزن مؤقت (برنامج تلفزيوني يحتوي على 10% مصل بقرى الجنين (FBS)).
  • احتضان اللوحات في درجة حرارة الغرفة ح 2.
  • تجاهل الكشف عن الأجسام المضادة الحل. غسل الآبار 3 مرات مع الآبار "يغسل المخزن المؤقت أولاً السماح" 250 ميليلتر/بئر نقع لمدة 1 دقيقة في كل خطوة من خطوات الغسيل.
  • إضافة 100 ميكروليتر/جيدا لأنزيم المتقارن (ستريبتافيدين-برنامج الصحة الإنجابية) المخفف في المخزن المؤقت لتمييع في تمييع 1: 100.
  • احتضان لوحات لح 1 في درجة حرارة الغرفة.
  • تجاهل إنزيم المتقارنة الحل. غسل الآبار 4 مرات مع الآبار "يغسل المخزن المؤقت أولاً السماح" 250 ميليلتر/بئر نقع لمدة 1 دقيقة في كل خطوة من خطوات الغسيل.
  • غسل الآبار 2 مرات مع 250 ميليلتر/جيدا تغسل المخزن المؤقت الثاني (PBS).
  • إضافة 100 ميليلتر من "الركازة الحل" (مزيج قطره 1 = 20 ميليلتر من "تشروموجين الجماعة الاقتصادية الأفريقية" مع 1 مل الركازة AEC) لكل بئر. رصد التنمية الموضعية لمدة 5 إلى 60 دقيقة.
  • عندما تبدأ النتائج المرجوة في الظهور، التوقف عن رد فعل الركيزة بغسل الآبار بالماء المقطر.
  • أيردري اللوحات في درجة حرارة الغرفة ح 2 أو بين ليلة وضحاها حتى أنها جافة تماما. سوف تسهل إزالة علبة بلاستيكية تحت اللوحات التجفيف. تخزين لوحات في أكياس بلاستيكية محكمة الإغلاق في الظلام حتى أنه يتم تحليل.
  • تعداد المواقع يدوياً بتفتيش تحت مجهر تشريح أو استخدام قارئ لوحة ELISPOT. انظر النتيجة الممثل في الشكل 2.

    • 5-تحديد "الببتيدات الفردية" في OLP_pool التي تحفز على إفراز IFN-γ "مقيد" 1 سؤال وجواب في CD8 OLP_pool خاصة+ خط الخلية T

    1. الببتيدات الفردية التي تحفز OLP_pool بعينها، إفراز سؤال وجواب-1-ريستريكتريد IFN-γ في CD8 OLP_pool خاصة تحديد+ خط الخلية T باستخدام ما ورد أعلاه وصف السبت IFN-γ المقايسة (التركيز النهائي لكل الببتيد الفردية المستخدمة للسبت والرزن 10 ميكروغرام/مل). راجع نتائج الممثل في الشكل 3.
      ملاحظة: يتم تعريف OLP-محددة، استجابة سؤال وجواب-1-ريستيركتيد كرد هو على الأقل ثلاث مرات استجابة حضور C1R. سؤال وجواب-1ب الخلايا ولكن دون OLP. في دراسة MOG OLP، OLP68، OLP96، و OLP105 كل ما اجتمع هذا المعيار. ولذلك يحتمل أن تكون كافة دعم المشتريات ثلاثة تحتوي على سؤال وجواب-1 [ابيتوبس]12 (الشكل 3). ومع ذلك، أعطى OLP105 استمرار استجابة أقوى؛ ومن ثم أجرينا تحليلاً مفصلاً OLP105 (الشكل 4 و الشكل 5)12.

    6-تحديد "حانمه" 1 سؤال وجواب الأمثل في OLP 15-مير الذي يحفز استجابة حانمه على حدة، وسؤال وجواب 1-المقيدة-CD8 OLP_pool خاصة+ خط الخلية T

    1. توليف ج-ونون-الميؤوس من شفائهم اقتطاع الببتيدات OLP 15-مير كما هو موضح في الشكل 4.
    2. فحص إفراز IFN-γ في CD8 OLP محددة+ خط الخلية T بحفز CD8+ تي الخلايا مع كل من الببتيدات مبتوراً، فضلا عن OLP الوالدية 15-مير حضور C1R أو C1R. سؤال وجواب-1ب الخلايا باستخدام ما ورد أعلاه وصف السبت IFN-γ المقايسة. تركيز كل الببتيد الفردية المستخدمة لفحص السبت النهائي 10 ميكروغرام/مل. يعرف ببتيد حانمه 1 سؤال وجواب الأمثل إذا الببتيد: 1) دائماً يعطي استجابة IFN-γ مماثلة أو أقوى، بالمقارنة مع 15-مير الببتيد الأصلي، حضور C1R. سؤال وجواب-1ب الخلايا؛ 2) ما بين 8-10-مير (9-مير الببتيد المفضل) وهي أطوال الببتيد منضمة إلى MHC--أنا جزيئات15،17. راجع نتائج الممثل في الشكل 5.

    النتائج

    تصميم مكتبة OLP تغطي كامل طول البروتين

    بداية في ن-المحطة من البروتين، هو كل الببتيد الأحماض الأمينية 15 (15-مير). ومن ثم، الببتيد الأول يمتد من الموضع 1 إلى موضع 15. ن-محطة الببتيد الثاني يتداخل مع ج-محطة الببتيد الأولى قبل 11 من الأحماض الأمينية. و?...

    Discussion

    هنا، لقد قمنا بوصف بروتوكول لتحليل [ابيتوبس] 1 سؤال وجواب في بروتين. فيما يتعلق بهذا البروتوكول، كما أبلغ عدة استراتيجيات أخرى سابقا. CD8 أولاً، متمكنة+ واستخدمت خطوط الخلايا T واستنساخ للتعرف على قدم1. وثانيا، استخدمت فكرة سؤال وجواب 1-ملزم المفترضة من تحليل قدم للتعرف على ...

    Disclosures

    ويعلن المؤلف لا تضارب في المصالح.

    Acknowledgements

    ونحن نشكر "غارسيا بينيلوب" لها المساعدة التقنية وإعداد هذه المخطوطة. أيد هذا العمل منحة الابتكار البحوث (تلاعب) من قسم الطب في جامعة لوما ليندا (681205-2967) ومنحة رائدة من "الجمعية الوطنية للتصلب المتعدد" (PP1685) باختصار.

    Materials

    NameCompanyCatalog NumberComments
    The protein to be analyzedN/AN/ASequence of the protein can be obtained from NCBI
    Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichCat#: D2650 SIGMADMSO should be sterile and cell culture tested.
    Kb-/-Db-/- miceThe Lackson LaboratoryStock#: 019995We used Taconic H2-KbH2-Db doube knockout mice (Cat#: 4215-F and 4215-M) which however are not available anymore.
    AIM V Serum Free MediumThermoFisher ScientificCat#: 12055091
    2-mercaptoethanolThermoFisher ScientificCat#: 21985023
    Sodium pyruvateThermoFisher ScientificCat#: 11360070
    Nonessential Amino AcidsThermoFisher ScientificCat#: 11140076
    Dynabeads CD8 Positive Isolation KitThermoFisher ScientificCat#: 11333D
    Bio-Gel P-100Bio-RadCat#: 150-4171
    Phoshate Balanced Solution (PBS)ThermoFisher ScientificCat#: 20012027
    Trasfer pipetteGlobe ScientificMfg#: 137238
    Murine M-CSFPeproTechCat#: 315-02
    48-well tissue culture platesUSA ScientificCat#: CC7682-7548
    Corning Costar TC-treated Multiple well Plates, 96-well, V-shaped bottomSigma-AldrichCat#: Z372129 Sigma
    1ml deep 06-well PP plate, sterileUSA ScientificItem#: 1896-1110
    Recombinant murine IL-2PeproTechCat#: 212-12
    Recombinant murine IL-7PeproTechCat#L: 217-17
    Capture anti-IFN-γ antibodyBD BiosciencesCat#: 551881
    ELISPOT plateSigma-AldrichCat#: S2EM004M99
    C1RATCCCat#: ATCC CRL-1993
    C1R.Qa-1bCustom made (GenBank access#: NM_010398.3)
    Qa-1 lentiviral vectorGeneCopoeiaProduct#: Mm02955
    Detection anti-IFN-γ antibodyBD BiosciencesCat#: 551881
    Tween20Sigma-AldrichCat#: P9416
    Streptavidin-HRPBD BiosciencesCat#: BD557630
    AEC substrateBD BiosciencesCat#: 551951
    ImmunoSpot AnalyzerImmunoSpotAny immunoSpot analyer should work for this purpose.

    References

    1. Aldrich, C. J., et al. Identification of a Tap-dependent leader peptide recognized by alloreactive T cells specific for a class Ib antigen. Cell. 79 (4), 649-658 (1994).
    2. Vance, R. E., Kraft, J. R., Altman, J. D., Jensen, P. E., Raulet, D. H. Mouse CD94/NKG2A is a natural killer cell receptor for the nonclassical major histocompatibility complex (MHC) class I molecule Qa-1(b). J Exp Med. 188 (10), 1841-1848 (1998).
    3. Oliveira, C. C., et al. The nonpolymorphic MHC Qa-1 mediates CD8+ T cell surveillance of antigen-processing defects. J Exp Med. 207 (1), 207-221 (2010).
    4. Nagarajan, N. A., Gonzalez, F., Shastri, N. Nonclassical MHC class Ib-restricted cytotoxic T cells monitor antigen processing in the endoplasmic reticulum. Nat Immunol. 13 (6), 579-586 (2012).
    5. Hu, D., et al. Analysis of regulatory CD8 T cells in Qa-1-deficient mice. Nat Immunol. 5 (5), 516-523 (2004).
    6. Tang, X., et al. Regulation of immunity by a novel population of Qa-1-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells. J Immunol. 177 (11), 7645-7655 (2006).
    7. Leavenworth, J. W., Tang, X., Kim, H. J., Wang, X., Cantor, H. Amelioration of arthritis through mobilization of peptide-specific CD8+ regulatory T cells. J Clin Invest. 123 (3), 1382-1389 (2013).
    8. Wu, Y., Zheng, Z., Jiang, Y., Chess, L., Jiang, H. The specificity of T cell regulation that enables self-nonself discrimination in the periphery. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 534-539 (2009).
    9. Panoutsakopoulou, V., et al. Suppression of autoimmune disease after vaccination with autoreactive T cells that express Qa-1 peptide complexes. J Clin Invest. 113 (8), 1218-1224 (2004).
    10. Tang, X., Maricic, I., Kumar, V. Anti-TCR antibody treatment activates a novel population of nonintestinal CD8 alpha alpha+ TCR alpha beta+ regulatory T cells and prevents experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 178 (10), 6043-6050 (2007).
    11. Holderried, T. A., Lang, P. A., Kim, H. J., Cantor, H. Genetic disruption of CD8+ Treg activity enhances the immune response to viral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (52), 21089-21094 (2013).
    12. Wang, X., et al. Targeting Non-classical Myelin Epitopes to Treat Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Sci Rep. 6, 36064 (2016).
    13. Lo, W. F., Dunn, C. D., Ong, H., Metcalf, E. S., Soloski, M. J. Bacterial and host factors involved in the major histocompatibility complex class Ib-restricted presentation of Salmonella Hsp 60: novel pathway. Infect Immun. 72 (5), 2843-2849 (2004).
    14. Xu, W., et al. The nucleocapsid protein of Rift Valley fever virus is a potent human CD8+ T cell antigen and elicits memory responses. PLoS One. 8 (3), e59210 (2013).
    15. Schumacher, T. N., et al. Peptide selection by MHC class I molecules. Nature. 350 (6320), 703-706 (1991).
    16. Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , (2008).
    17. Guo, H. C., et al. Different length peptides bind to HLA-Aw68 similarly at their ends but bulge out in the middle. Nature. 360 (6402), 364-366 (1992).
    18. Soloski, M. J., Metcalf, E. S. The involvement of class Ib molecules in the host response to infection with Salmonella and its relevance to autoimmunity. Microbes Infect. 3 (14-15), 1249-1259 (2001).
    19. Smith, T. R., et al. Dendritic cells use endocytic pathway for cross-priming class Ib MHC-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells with regulatory properties. J Immunol. 182 (11), 6959-6968 (2009).
    20. Kalra, A., Mukherjee, P., Chauhan, V. S. Characterization of fine specificity of the immune response to a Plasmodium falciparum rhoptry neck protein, PfAARP. Malar J. 15, 457 (2016).
    21. Kambayashi, T., et al. The nonclassical MHC class I molecule Qa-1 forms unstable peptide complexes. J Immunol. 172 (3), 1661-1669 (2004).

    Reprints and Permissions

    Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

    Request Permission

    Explore More Articles

    130 1 E

    This article has been published

    Video Coming Soon

    JoVE Logo

    Privacy

    Terms of Use

    Policies

    Contact Us

    Recommend to library

    JoVE NEWSLETTERS

    Research

    Education

    Authors

    Librarians

    ABOUT JoVE

    Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved