Biblioteca de peptídeo sobreposição para mapear os resumos de Qa-1 em uma proteína

Resumo

QA-1 (HLA-E em humanos) pertence a um grupo de moléculas de 1b complexo principal de histocompatibilidade não-clássica. Imunização com resumos de Qa-1-ligação foi mostrada para aumentar o tecido-específica Regulamento imune e amenizar várias doenças auto-imunes. Neste documento descrevemos uma estratégia de biblioteca de peptídeo sobreposição para a identificação de epitopos de Qa-1 em uma proteína.

Resumo

QA-1 (HLA-E em humanos) pertence a um grupo de não-clássica histocompatibilidade complexa 1b moléculas (MHC-Ib). Dados recentes sugerem que as moléculas de Qa-1 desempenham papéis importantes em Agrimensura células para integridade estrutural e funcional, induzindo o Regulamento imune e limitando a resposta imune a infecções virais. Além disso, funcional aumento de CD8 Qa-1-restrito⁺ T células através do epítopo imunização tem mostrado efeitos terapêuticos em vários modelos animais doença auto-imune, por exemplo, experimental encefalomielite alérgica, artrite induzida por colágeno e diabetes não-obesos. Portanto, há uma necessidade urgente de um método que pode eficientemente e rapidamente identificar epítopos de Qa-1 funcionais em uma proteína. Aqui, descrevemos um protocolo que utiliza o CD8 Qa-1-restrito⁺ célula T linhas específicas para uma biblioteca de peptídeo (OLP) sobrepostas para determinar os resumos de Qa-1 em uma proteína. Esta biblioteca OLP contém 15-mer sobreposição peptídeos que cobrem todo o comprimento de uma proteína, e peptídeos adjacentes se sobrepõem por 11 aminoácidos. Usando este protocolo, identificamos recentemente um epítopo de Qa-1 9-mer em glicoproteína oligodendrocyte de mielina (MOG). Este recém mapeada epítopo MOG Qa-1 foi mostrado para induzir CD8 epítopo específico, Qa-1-restrito⁺ T células desse regulamento imune reforçado de mielina específicos. Portanto, o presente protocolo é útil para futura investigação de novos objectivos e funções de CD8 Qa-1-restrito⁺ T células.

Introdução

QA-1 pertence a um grupo de não-clássica histocompatibilidade complexa 1b moléculas (MHC-Ib) em camundongos. Seu homólogo humano é HLA-E. Provas anteriores tem demonstrou que as moléculas de Qa-1 tem importantes funções biológicas. Em primeiro lugar, Qa-1 moléculas desempenham um papel importante no levantamento de células para a integridade estrutural e funcional. Neste aspecto, Qa-1 moléculas evoluíram diversas estratégias para monitorar a função normal de uma célula. Uma tal estratégia permite Qa-1 moléculas para formar complexos com um peptídeo líder transformados (epítopo), ou seja, o Qa-1 determinante modificador (Qdm) é processado a partir de moléculas de MHC-i clássicas no retículo endoplasmático¹. Estes complexos de Qa-1/Qdm depois exibir na superfície de uma célula e ligam aos receptores inibitórios de NKG2A em células NK para inibir NK matar atividade². Se a expressão de moléculas de MHC-i é perdida, uma célula (por exemplo, uma célula maligna) torna-se sensível para NK matar². A outra estratégia permite Qa-1 moléculas formar novos complexos de Qa-1/epítopo na superfície de uma célula que é deficiente em TAP (transporte associado ao processamento de antígeno)³ e/ou ERAAP (retículo endoplasmático aminopeptidase associado processamento do antígeno)⁴ (ambas as deficiências muitas vezes ocorrem em células malignas). A célula que expressa estes novos complexos de Qa-1/epítopo pode ser reconhecida e eliminada pelo epítopo específico CD8 Qa-1-restrito⁺ T células. Em segundo lugar, moléculas de Qa-1 induzem Regulamento imune⁵. Neste aspecto, Qa-1/epítopo complexos têm sido mostrados para estimular CD8⁺ pilhas de T (Treg) reguladoras que são importantes para a prevenção do dano imune-mediada de autotecidos^{6,7,8 ,9,10}. Em terceiro lugar, CD8 Qa-1-restrito⁺ Treg células têm sido mostradas para limitar as respostas imunes contra infecção viral¹¹.

Portanto, aumento do específico do epítopo específico CD8 de Qa-1-restrictred⁺ T células é uma estratégia potencialmente promissora para a eliminação de células anormais, para o aprimoramento do Regulamento imune e para o controle da magnitude do induzida por vírus respostas imunes. Enquanto não tiver sido determinado se aumento de epítopo específico CD8 Qa-1-restrito⁺ T células podem reforçar a vigilância imunológica e limitar as respostas de imune induzida por vírus, nossos laboratórios e outros demonstraram claramente que imunização com resumos de Qa-1 pode aumentar a função de Qa-1-restrito CD8⁺ Treg células específicas para CD4 auto-imune patogénicos⁺ T células, levando ao controle eficiente de CD4⁺ doenças auto-imune mediada por células T em um variedade de animal modelos tais como encefalomielite alérgica experimental (um modelo animal do humano esclerose múltipla)^6,10, artrite induzida por colágeno (um modelo animal de artrite de reumatoide humana)⁷, e diabetes não-obesos (um modelo animal de diabetes do tipo humano 1)⁸. Além disso, descobrimos que a imunização com um epítopo de Qa-1 tecido-específica leva a controle específico de inflamação imune-mediada em que o tecido através de aumento de CD8⁺ Treg células¹². Os sucessos acima dos estudos pré-clínicos indicam a necessidade de uma avaliação completa de Qa-1 epítopo imunização para o tratamento de doenças de tecido-específica imune-mediada e potencialmente para o tratamento de outras doenças associadas com deficiências na TAP e ERAAP.

Nesse sentido, há uma demanda por uma tecnologia que pode confiantemente e rapidamente analisar resumos de Qa-1 em uma proteína. A este respeito, foi descrito um número limitado de epitopos de Qa-1 biologicamente importantes. A maioria destes resumos de Qa-1 foram identificada por acaso durante o estudo de CD8⁺ T célula respostas para bactérias¹³, células deficientes em torneira³, células deficientes em ERAAP⁴e células que causam EAE^{6, 9}. Portanto, uma técnica de alta taxa de transferência é desejável para a identificação de epitopos de Qa-1 biologicamente importantes em uma proteína definido. A seguir, descrevemos uma estratégia de biblioteca de peptídeo (OLP) sobrepostas que mapeia funcionais epitopos de Qa-1 em uma proteína usando CD8 Qa-1-resrticted⁺ célula T linhas específicas para o pool OLP (OLP_pool) de uma proteína.

Protocolo

Todos os experimentos foram realizados em conformidade com um protocolo de uso aprovado pelo Comité de uso, a Universidade do Texas em El Paso e a Universidade de Loma Linda e cuidado Animal e institucional Cuidado Animal.

1. geração de uma biblioteca OLP abrange todo o comprimento de uma proteína

1. Projete uma biblioteca da OLP na qual todos os peptídeos são mer-15 de comprimento, e peptídeos adjacentes se sobrepõem por 11 aminoácidos.
   Nota: No estudo MOG OLP, sequência do precursor MOG [Mus musculus] foi obtida em banco de dados da proteína NCBI, seguindo este link: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_034944. Utilizou-se o precursor MOG (247 aminoácidos), que continha tanto sinal e péptidos maduros, porque a maioria de epitopos de Qa-1 (HLA-E) relatados localizavam-se em peptídeos de sinal (por exemplo, Qdm¹). Começando na sua extremidade N-terminal, as sequências de peptídeos mer-15 foram identificadas tais que dois peptídeos adjacentes sobrepunham por 11 aminoácidos (Figura 1). Daí, exatamente 59 OLPs foram identificados no 247 aminoácido precursor MOG. No entanto, a última OLP pode variar de 12 a 15-mer dependendo do comprimento da proteína. Além disso, nós escolhemos 15-mer biblioteca porque nós e outros mostraram que 15-mer peptídeos, quando adicionado em células dendríticas (DCs) ou macrófagos, podem ser eficientemente transformadas em resumos de reconhecimento CD8⁺ T células^14,15 .
2. Compre cada peptídeo individual comercialmente. 5 mg / peptídeo deve ser suficiente para o rastreio. OLPs e peptídeos truncados (etapa 6.1) podem ser demolhados peptídeos (pureza é aproximadamente 50-70%). A pureza do ideal do peptide (passo 6.2) que será usado para a geração de tetrâmero e para futuras análises biológicas deve ser > 90%. Reconstitua os peptídeos sob condição estéril.
3. Faça 50 mg/mL existências individuais peptídeo em 100% DMSO. 5 mg de cada peptídeo, adicionar 100 μL de DMSO em cada tubo, misture e armazenar os peptídeos a-20 ° C. Essas ações serão usadas para fazer um estoque de OLP_pool para a geração de CD8⁺ célula T linhas reativa para o OLP_pool. Além disso, essas ações também serão usadas para fazer 10 mg/mL estoques de peptídeo individuais para determinar a capacidade de cada peptídeo individual para estimular uma resposta Qa-1-restrito em um OLP_pool-reativa CD8⁺ linha de células T.
4. Estoque de OLP_pool fazer adicionando um volume igual de cada peptídeo em um tubo de fresco. Este estoque de OLP_pool contém 100% DMSO. No estudo de MOG OLP, havia 59 OLPs¹². Portanto, a concentração de cada peptídeo no OLP_pool era 847.46 μg/mL (50 mg/mL ÷ 59).
5. Fazer 10 mg/mL existências individuais peptídeo por diluição (5x) o estoque de 50 mg/mL em estéril H₂O em um prato fundo-V 96 poços (este estoque contém 20% DMSO). Faça estes estoques em uma placa de 96 poços, porque a determinação da resposta de cada indivíduo peptídeo Qa-1-restrito será executada em uma placa de 96 poços, com uma pipeta multicanal 8 ou 12 canais.
   Nota: Todos os peptídeos, incluindo OLPs e peptídeos truncados, devem ser diluídos em ou uma placa de 96 V-inferior ou um rack de amostra de 96 poços preenchido com tubos de 1 mL, desde que o rastreio de biblioteca de peptídeo é realizado em placas de 96 poços, com uma pipeta multicanal. Se é difícil diluir um peptídeo, adicione 1 gota de NaOH N sábia ajudar a dissolver o peptídeo.

2. preparação de K^b-/- D^b-/- CD8⁺ células T com o K pulsada OLP_pool^b-/- D^b-/- células dendríticas (DCs).

Nota: Existem dois alelos de Qa-1 principais: uma é Qa-1^um, e o outro é Qa-1^b. Desde os animais usados para pesquisa acadêmica, por exemplo C57BL/6 e camundongos Balb/c, carregam Qa-1^b, este protocolo descreve o procedimento para mapeamento Qa-1^b resumos em uma proteína. CD8⁺ T células utilizadas neste protocolo são purificadas de K^b-/-D^b-/- ratos (fundo C57BL/6), no qual CD8⁺ T células são restritos principalmente por moléculas de MHC-Ib não-clássica incluindo Qa-1.

1. Produzi derivados da medula óssea DCs como descrito anteriormente,¹².
   1. Brevemente, cultura suspensões de única célula da medula óssea (1 x 10⁶ células/mL) em meio RPMI-10 (RPMI 1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal, 5,5 x 10^-5 M 2-Mercaptoetanol, piruvato de sódio 1 mM e aminoácido não essencial de 0,1 mM) contendo 10 U/mL de IL-4 e 100 U/mL de GM-CSF em uma 6-placa (4 mL/poço) a 37 ° C, 5% de CO₂.
   2. Dois dias depois, remover as células não-aderentes com cuidado e adicionar mídia fresca e citocinas.
   3. Após o cultivo das células por mais dois dias, transferi células não-aderentes que contém a mídia fresca e citocinas em uma nova placa de 6.
   4. Cultura das células por mais dois dias e reabastecido com mídia fresca e citocinas contendo LPS (0,1 µ g/mL) para ativar os DCs.
   5. 24h depois, recolher os DCs para experimentos.
2. Irradiar os DCs com 3000 Rads.
   1. Alternativamente, tratar os DCs (5 x 10⁷ células/mL) com mitomicina C (50 μg/mL) em PBS a 37 ° C por 20 min. Adicionar RPMI-0 (RPMI 1640 sem soro) para encher o tubo (~ 12 mL) e girar as células por 10 min em uma centrífuga de mesa em 300 x sobrenadantes de descarte de g. e FOS t o procedimento de lavagem mais duas vezes. Estes três lavagens são críticas porque qualquer quantidade de rastreamento de mitomicina C pode inibir a resposta de CD8⁺ T células durante a co-cultura de células de DC-T.
3. Ajuste a concentração de DC a 5 x 10⁶ células/mL em meio livre de soro (AIM-V isento de soro suplementado com 5,5 x 10^-5 M 2-Mercaptoetanol, piruvato de sódio 1 mM e aminoácido não essencial de 0,1 mM).
4. Adicione a solução estoque de OLP_pool, que contém 100% DMSO, para os DCs, tal que a concentração de DMSO final será de 0,5% (200x). No estudo de MOG OLP, a concentração de cada OLP no OLP_pool foi 847.46 μg/mL; Portanto, a concentração final de cada OLP na cultura DC foi 4.2 μg/mL (847.46 μg/mL ÷ 200).

No entanto, esta concentração pode ser escalada até 100 μg/mL, enquanto a concentração de DMSO na cultura de pilha permanece inferior a 1%.

Incubar os DCs em temperatura ambiente por 3 h e agite as células a cada 15 min.

Durante este período de incubação, purificar CD8⁺ T células do baço colhido ou linfonodos de K^b-/-D^b-/- ratos usando um comercial CD8⁺ T kit de purificação de células, ajustar a concentração de células de 10 x 10⁶ células/mL em o meio livre de soro contendo 50 U/mL interleucina 2 (IL-2) e 100 U/mL de IL-7.

Agora, adicione o CD8⁺ T células em uma placa de 48 como 0,5 mL/poço (após a adição de 0,5 mL/bem de DCs OLP_pool pulsada em passo 2.8, a concentração final do CD8⁺ T células será 5 x 10⁶ células/mL).
Nota: CD8⁺ T células de baço de rato e linfonodos podem ser purificadas usando o Kit de isolamento positivo CD8, seguindo as instruções fornecidas pelo fabricante. CD8⁺ T células obtidas são livres de grânulos.

Girar para baixo os DCs OLP_pool Pulsada (300 x g, 10 min) no RT. reconstituir os DCs OLP_pool pulsada a 2 x 10⁶ células/mL no meio livre de soro e adicionar 0,5 mL/cavidade para a placa de 48 que contém o CD8⁺ T células (concentração final da OLP _pool-pulsado DCs é 1 x 10⁶ células/mL, concentração final de CD8⁺ T células é de 5 x 10⁶ células/mL, concentração final de Il-2 é de 25 U/mL e a concentração final de IL-7 é de 50 U/mL). Cultura de células em 37 ° C e 5% de CO₂.

No dia 4, remover e descartar cerca de 400 μL do meio de cultura e adicionar 500 μL do meio livre de soro fresco contendo 100 U/mL IL-2 e 100U/mL de IL-7 para cada poço. Incube as celulas em 37 ° C e 5% de CO₂.

No dia 7 ou 8, re-estimular o CD8 aprontado-OLP_pool⁺ T células com o OLP_pool.

3. restimulation do CD8 aprontada⁺ T células com macrófagos pulsado com o OLP_pool

1. Quatro dias antes de re-estimulação do CD8 aprontado-OLP_pool⁺ T células, preparar a solução de grânulo de poliacrilamida de 2% (v/v): lavar 2 g de grânulos de poliacrilamida duas vezes em 20 mL livre de endotoxinas H₂O ou PBS. Os grânulos de poliacrilamida de pelotas por centrifugação (400 x g) durante 5 min e ressuspender em 100 mL de PBS. Autoclave a 15 lb/m de 20 min. armazenar à temperatura ambiente.
2. Injete camundongos intraperitonealmente com 1 mL/mouse da estéril 2% solução do grânulo poliacrilamida para atrair a migração de monócitos/macrófagos para a cavidade peritoneal,¹⁶.
3. Quatro dias depois, sacrificar os animais por overdose de CO₂ .
   1. Sob condições estéreis, cortar uma pequena abertura no centro do abdômen tais que a abertura é suficiente para a passagem de uma pipeta de transferência de 5 mL. Encher a pipeta de transferência com RPMI-0 e introduza a pipeta na cavidade abdominal através da abertura.
   2. Enxague a cavidade do abdômen por pipetagem. Pipetar para fora tanto líquido quanto possível da cavidade abdominal para um tubo estéril (estes são os macrófagos peritoneais). Repita a etapa de lavagem 4 - 5 vezes.
4. Irradiar os macrófagos peritoneais com 3000 Rads.
   1. Alternativamente, trate os macrófagos peritoneais com mitomicina C (siga o procedimento descrito no passo 2.2).
5. Ajuste a concentração de macrófagos peritoneais para 5 x 10⁶ células/mL no meio livre de soro. Adicione o caldo de OLP_pool (a concentração final de DMSO é inferior a 1%) e M-CSF (concentração final = 100 U/mL).
   Nota: Neste estudo MOG OLP, usamos 0.5% DMSO. Assim, OLP_pool MOG estoque foi diluído 200X (por exemplo, 1 μL de MOG OLP_Pool estoque foi adicionado em 199 μL de macrófagos peritoneais). Portanto, a concentração final de cada OLP era 4.2 μg/mL).
6. Adicionar 200 μL/poço (1 x 10⁶ células/poço) em uma placa de cultura de tecidos de 48-bem e incubar a placa a 37 ° C por 4 h.
7. Remova as células não-aderentes e os grânulos de poliacrilamida por lavagem suave com 200 μL/poço do 0-RPMI pré-aquecido.
8. Coletar e piscina a OLP_pool aprontadas CD8⁺ T células de passo 2.10. Ajustar o OLP_pool aprontadas CD8⁺ concentração de células T a 1 x 10⁶ células/mL no meio livre de soro contendo 25 U/mL IL-2 e 50 U/mL de IL-7. Adicione 1 mL/cavidade para a placa de 48 que contém os macrófagos peritoneais pulsada OLP_pool.
9. Quatro dias depois, reabastecer o médio na placa de 48. Remova e descarte a cerca de 400 μL do meio de cultura nas placas de cultura de 48-bem. Adicione 500 μL de fresco médio isento de soro contendo 100 U/mL IL-2 e 100 U/mL de IL-7 em cada poço. Cultura de células em 37 ° C e 5% de CO₂.
10. Três ou quatro dias depois, examinar o CD8 OLP_pool-restimulated⁺ T células de resposta específicos OLP_pool, Qa-1-restrito por meio de ensaio enzima-lig immunospot (ELISPOT). Após este ponto, re-estimular o CD8⁺ T células a cada 7-10 dias.
    Nota: Os macrófagos são preferidos para a re-estimulação do CD8 OLP_pool-preparado⁺ T células. Notamos que CD8⁺ T células re-estimulados por macrófago cresceram melhores DCs em vitro.

4. determinação de OLP_pool específicos, Qa-1-restrito a resposta em um CD8 OLP_pool-restimulated⁺ linha de células T

Nota: Resposta específicos OLP_pool, Qa-1-restrito em um CD8 OLP_pool-restimulated⁺ linha de célula T é determinada pela secreção de relato após estimulação pelo OLP_pool na presença de C1R ou C1R. QA-1^b células usando um ensaio IFNγ ELISPOT. C1r células podem ser obtidas comercialmente. C1R. QA-1^b células podem ser geradas por transducing as células C1R com o vetor de Lentivirus Qa-1.

1. Adicione 100 μL/poço de um anticorpo anti-IFN-γ de captura diluída em tampão de revestimento (PBS) em poços de uma placa ELISPOT.

Selar e incubar a placa a 4 ° C durante a noite.

No segundo dia, descartar o buffer de revestimento contendo o anticorpo anti-IFN-γ de captura e adicionar 200 μL/bem-blocking solução (meio livre de soro) e incubar a placa por 2h, à temperatura ambiente.

Irradiar o C1R e C1R. QA-1^b células com 9.600 Rads.

1. Alternativamente, trate o C1R e C1R. QA-1^b células com mitomicina C, conforme descrito no passo 2.2, exceto que o tempo de tratamento será de 30 min.

Ajuste o C1R e C1R. QA-1^b células no meio livre de soro a 4 x 10⁶ células/mL.

Descartar a solução de bloqueio no prato e adicionar o C1R e C1R. QA-1^b células em 50 μL/poço (200.000 células/poço) e misture.

Adicionar 50 μL/poço de 100 x diluído OLP_pool estoque (no meio livre de soro) e misture bem. Incube a placa na temperatura de quarto para 2-3 h.

Ajustar o CD8 OLP_pool-restimulated⁺ T células de 1-2 x 10⁶ células/mL no meio livre de soro contendo 150 U/mL de IL-7 e adicionar 50 μL/poço (50.000-100.000 células/poço) para a placa. Centrifugue a placa (58 x g), por 5 min.

Incube a placa a 37 ° C e 5% de CO₂ durante a noite.

Aspire a suspensão de células. Lave os poços 2 vezes com deionizada (DI) (250 μL/poço). Permitir que poços de molho por 5 min em cada etapa de lavagem.

Poços de lavar 3 vezes com tampão de lavagem (PBS contendo 0,05% Tween20). Permitir que poços de molho por 1 minuto em cada etapa de lavagem. Descarte o tampão de lavagem.

Adicione 100 μL de anticorpo de detecção diluído em um tampão de diluição (PBS contendo 10% de soro fetal bovino (FBS)).

Incube as placas em temperatura ambiente por 2 h.

Descarte a solução de anticorpo da deteção. Lave os poços 3 vezes com 250 µ l/poço lavar Buffer I. permitir poços de molho por 1 minuto em cada etapa de lavagem.

Adicione 100 μL/poço do conjugado enzima (Streptavidin-HRP) diluído no tampão de diluição na diluição de 1: 100.

Incube as placas por 1h à temperatura ambiente.

Descarte a solução de conjugado enzima. Lave os poços 4 vezes com 250 µ l/poço lavar Buffer I. permitir poços de molho por 1 minuto em cada etapa de lavagem.

Lave os poços 2 vezes com 250 µ l/poço lavar Buffer II (PBS).

Adicione 100 µ l de solução de substrato (mistura 1 gota = 20 µ l de cromogénio AEC com 1 mL de substrato AEC) a cada poço. Monitorar o desenvolvimento local de 5 a 60 min.

Quando os resultados desejados começam a aparecer, pare a reacção do substrato por lavagem poços com água destilada.

As placas em temperatura ambiente por 2 h secar ao ar livre ou durante a noite até que esteja completamente seco. Remoção da bandeja de plástico sob as placas irá facilitar a secagem. Armazenar as placas em um saco plástico selado no escuro até está analisada.

Enumere pontos manualmente inspecionando um microscópio dissecação ou usando um leitor de placas ELISPOT. Veja o resultado representativo na Figura 2.

5. determinação de peptídeos individuais no OLP_pool que estimulam para a secreção de IFN-γ Qa-1 restrito em um CD8 específicas OLP_pool⁺ linha de células T

1. Determinar os peptídeos individuais que estimulam a OLP_pool específicas, secreção de IFN-γ de Qa-1-restrictred em um OLP_pool específicos CD8⁺ linha de célula T usando o acima descrito o ensaio ELISPOT de IFN-γ (concentração final de cada individual peptídeo usado para o ELISOPT assay é 10 μg/mL). Ver resultados representativos na Figura 3.
   Nota: Um OLP-específicas, restircted-Qa-1 resposta é definida como uma resposta que é pelo menos três vezes da resposta na presença de C1R. QA-1^b células mas sem a OLP. No estudo de MOG OLP, OLP68, OLP96 e OLP105 todos conhecem este critério. Portanto, todos os três OLPs potencialmente contenham resumos de Qa-1¹² (Figura 3). No entanto, o OLP105 consistentemente deu a resposta mais forte; Portanto, realizamos uma análise detalhada da OLP105 (Figura 4 e Figura 5)¹².

6. identificação do epítopo Qa-1 ideal em uma OLP 15-mer, que estimula a resposta epítopo específico, Qa-1-restrito em um CD8 específicas OLP_pool⁺ linha de células T

1. Sintetiza péptidos C - e N-terminal truncado de um 15-mer OLP como mostrado na Figura 4.
2. Examinar a secreção de IFN-γ em um OLP específicos CD8⁺ linha de célula T, estimulando o CD8⁺ T células com cada um dos peptídeos truncados, bem como a OLP parental 15-mer, na presença de C1R ou C1R. QA-1^b células usando o acima descreveram o ensaio ELISPOT de IFN-γ. A concentração final de cada peptídeo individual utilizado para o ensaio ELISPOT é 10 μg/mL. Um peptídeo é definido como o epítopo Qa-1 ideal se o peptídeo: 1) consistentemente dá resposta de IFN-γ semelhante ou mais forte, em comparação com o original do peptide 15-mer, na presença de C1R. QA-1^b células; 2) é entre 8 - 10-mer (9-mer peptídeo preferido) que são os comprimentos de peptídeo ligados a MHC-eu moléculas^15,17. Ver Resultados de representante na Figura 5.

Resultados

Projeto de uma biblioteca OLP abrange todo o comprimento de uma proteína

Começando no N-terminal de uma proteína, cada peptídeo é 15 aminoácidos (15-mer). Portanto, o primeiro peptídeo abrange a posição 1 para a posição 15. N-terminal do peptide segundo se sobrepõe com o C-terminal do peptide primeiro por 11 aminoácidos. Portanto, o segundo peptídeo abrange a posição 5, a posição 19. Desenha o resto dos peptides ?...

Discussão

Aqui, descrevemos um protocolo para a análise de resumos de Qa-1 em uma proteína. Em relação ao presente protocolo, várias outras estratégias também foram relatadas anteriormente. Em primeiro lugar, alogênico CD8⁺ linhas de células T e clones foram utilizados para a identificação do Qdm¹. Em segundo lugar, um putativo Qa-1-motivo da análise de Qdm foi usado para a identificação da HSP60p216-224 e um epítopo TCRBV8.1^9,18...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
The protein to be analyzed	N/A	N/A	Sequence of the protein can be obtained from NCBI
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	Cat#: D2650 SIGMA	DMSO should be sterile and cell culture tested.
Kb-/-Db-/- mice	The Lackson Laboratory	Stock#: 019995	We used Taconic H2-KbH2-Db doube knockout mice (Cat#: 4215-F and 4215-M) which however are not available anymore.
AIM V Serum Free Medium	ThermoFisher Scientific	Cat#: 12055091
2-mercaptoethanol	ThermoFisher Scientific	Cat#: 21985023
Sodium pyruvate	ThermoFisher Scientific	Cat#: 11360070
Nonessential Amino Acids	ThermoFisher Scientific	Cat#: 11140076
Dynabeads CD8 Positive Isolation Kit	ThermoFisher Scientific	Cat#: 11333D
Bio-Gel P-100	Bio-Rad	Cat#: 150-4171
Phoshate Balanced Solution (PBS)	ThermoFisher Scientific	Cat#: 20012027
Trasfer pipette	Globe Scientific	Mfg#: 137238
Murine M-CSF	PeproTech	Cat#: 315-02
48-well tissue culture plates	USA Scientific	Cat#: CC7682-7548
Corning Costar TC-treated Multiple well Plates, 96-well, V-shaped bottom	Sigma-Aldrich	Cat#: Z372129 Sigma
1ml deep 06-well PP plate, sterile	USA Scientific	Item#: 1896-1110
Recombinant murine IL-2	PeproTech	Cat#: 212-12
Recombinant murine IL-7	PeproTech	Cat#L: 217-17
Capture anti-IFN-γ antibody	BD Biosciences	Cat#: 551881
ELISPOT plate	Sigma-Aldrich	Cat#: S2EM004M99
C1R	ATCC	Cat#: ATCC CRL-1993
C1R.Qa-1b			Custom made (GenBank access#: NM_010398.3)
Qa-1 lentiviral vector	GeneCopoeia	Product#: Mm02955
Detection anti-IFN-γ antibody	BD Biosciences	Cat#: 551881
Tween20	Sigma-Aldrich	Cat#: P9416
Streptavidin-HRP	BD Biosciences	Cat#: BD557630
AEC substrate	BD Biosciences	Cat#: 551951
ImmunoSpot Analyzer	ImmunoSpot		Any immunoSpot analyer should work for this purpose.