Überlappende Peptid-Bibliothek zuordnen Qa-1 Epitope in einem Protein

Zusammenfassung

QS-1 (beim Menschen HLA-E) gehört zu einer Gruppe von nicht-klassischen großen Histocompatibility complex 1 b Moleküle. Immunisierung mit QS-1-Bindung Epitope nachweislich erweitern gewebespezifischen Immunregulation und mehrere Autoimmunerkrankungen zu verbessern. Hier beschreiben wir eine überlappende Peptid Bibliothek Strategie zur Identifikation des Qa-1 Epitope in ein Protein.

Zusammenfassung

QS-1 (beim Menschen HLA-E) gehört zu einer Gruppe von nicht-klassischen großen Histocompatibility complex 1 b (MHC-Ib) Moleküle. Aktuellen Daten geht hervor, dass QS-1-Molekülen in Zellen für strukturelle und funktionelle Integrität Vermessung, induzierende Immunregulation und Begrenzung der Immunantwort auf virale Infektionen eine wichtige Rolle spielen. Darüber hinaus funktionale Augmentation des QS-1-eingeschränkt CD8⁺ T-Zellen durch Epitop Immunisierung hat therapeutische Effekte in mehreren Autoimmunerkrankung Tiermodellen, z.B. experimentelle allergische Enzephalomyelitis gezeigt Kollagen-induzierte Arthritis und nicht adipösen Diabetes. Daher gibt es eine dringende Notwendigkeit für eine Methode, die schnell und effizient funktionelle QS-1-Epitope in einem Protein identifizieren kann. Hier beschreiben wir eine Protokoll, das QS-1-eingeschränkt CD8 nutzt⁺ T-Zell-Linien für eine überlappende Peptid (OLP)-Bibliothek für die Bestimmung der QS-1 Epitope in einem Protein spezifisch. Diese OLP-Bibliothek enthält 15-Mer überlappende Peptide, die die gesamte Länge eines Proteins zu decken, und angrenzenden Peptide eine Überlappung von 11 Aminosäuren. Unter Verwendung dieses Protokolls, haben wir vor kurzem eine 9-Mer Qa-1 Epitop in Myelin Oligodendrozyt Glykoprotein (MOG) identifiziert. Diese neu zugeordnete MOG QS-1-Epitop zeigte sich Epitop-spezifische, QS-1-eingeschränkt CD8 induzieren⁺ T-Zellen, dass verbesserte Myelin-spezifische Immunregulation. Daher eignet sich dieses Protokoll für zukünftige Untersuchung neuartiger Ziele und Funktionen des QS-1-eingeschränkt CD8⁺ T Zellen.

Einleitung

QS-1 gehört zu einer Gruppe von nicht-klassischen großen Histocompatibility complex 1 b (MHC-Ib) Moleküle in den Mäusen. Seine menschliche Homolog ist HLA-E. Vorherigen Nachweis hat gezeigt, dass QS-1-Moleküle wichtige biologische Funktionen haben. Erstens, QS-1-Moleküle spielen eine wichtige Rolle in der Vermessung Zellen für strukturelle und funktionelle Integrität. QS-1-Moleküle haben in diesem Zusammenhang mehrere Strategien, um die normale Funktion einer Zelle überwachen entwickelt. Eine solche Strategie ermöglicht QS-1-Moleküle zu Form-komplexe mit einer verarbeiteten Führer Peptid (Epitop), d.h. der QS-1 Determinante Modifikator (Qdm), die von klassischen MHC-Ia-Moleküle in das endoplasmatische Retikulum¹verarbeitet wird. Diese QS-1/Qdm komplexe später auf der Oberfläche einer Zelle anzeigen und binden an hemmenden NKG2A Rezeptoren auf NK-Zellen, NK Aktivität²töten zu hemmen. Wenn die Expression von MHC-Ia Moleküle verloren geht, wird eine Zelle (z. B. eine maligne Zelle) empfindlich auf NK²töten. Die andere Strategie ermöglicht QS-1-Moleküle zu bilden neue QS-1/Epitop komplexe auf der Oberfläche einer Zelle, die einen Mangel an TAP (Transporter mit Antigen Verarbeitung verbunden) ist³ und/oder ERAAP (endoplasmatische Retikulum Aminopeptidase zugeordnet Antigen Processing)⁴ (beide Mängel treten oft in bösartiger Zellen). Die Zelle, die diese neuen QS-1/Epitop komplexe drückt dann erkannt und eliminiert durch die Epitop-spezifischen CD8 QS-1-eingeschränkt werden kann⁺ T Zellen. Zweitens, induzieren QS-1-Moleküle Immunregulation⁵. In diesem Zusammenhang Qa-1/Epitop-komplexe haben gezeigt, dass CD8 stimulieren⁺ regulatorische (Treg) T-Zellen, die wichtig für die Vermeidung von immunvermittelte Schäden selbst-Gewebe^{6,7,8 ,9,10}. Drittens, QS-1-eingeschränkt CD8⁺ Treg Zellen gezeigt worden, haben um Immunantworten gegen virale Infektion¹¹zu begrenzen.

Daher bestimmte Vermehrung der Epitop-spezifische QS-1-Restrictred CD8⁺ T Zellen ist eine potenziell vielversprechende Strategie für die Beseitigung von abnormen Zellen, für die Verbesserung der Immunregulation und für die Kontrolle des Ausmaßes der Virus-induzierte Immunantwort. Während es steht nicht fest ob Brustvergrößerung Epitop-spezifischer CD8 QS-1-eingeschränkt⁺ T Zellen erweitern Immunüberwachung und Virus-induzierte Immunantwort zu begrenzen können, unsere Labore und andere haben eindeutig gezeigt, dass Immunisierung mit QS-1 Epitope kann die Funktion des QS-1-eingeschränkt CD8 ergänzen⁺ Treg Zellen spezifische für pathogene autoimmune CD4⁺ T Zellen, führt zu effizienten Kontrolle von CD4⁺ T-Zell-vermittelten Autoimmunerkrankungen in eine Vielzahl von Tier-Modelle wie experimentelle allergische Enzephalomyelitis (Tiermodell der menschlichen multiplen Sklerose)^6,10, Kollagen-induzierte Arthritis (einem Tiermodell der menschlichen rheumatoide Arthritis)⁷, und nicht adipösen Diabetes (Tiermodell für menschliche Typ 1 Diabetes)⁸. Darüber hinaus haben wir entdeckt, dass die Immunisierung mit einem gewebespezifischen Qa-1 Epitop führt zu spezifischen Kontrolle der immun-vermittelte Entzündung in diesem Gewebe durch Vermehrung der CD8⁺ Treg Zellen¹². Die oben genannten Erfolge von präklinischen Studien zeigen eine Notwendigkeit für eine umfassende Bewertung der QS-1 Epitop Immunisierung für die Behandlung von gewebespezifischen immunvermittelte Erkrankungen und möglicherweise für die Behandlung von anderen Erkrankungen im Zusammenhang mit Mängeln in Hahn und ERAAP.

Dementsprechend gibt es ein Bedarf für eine Technologie, die zuverlässig und schnell Qa-1 Epitope in einem Protein analysieren kann. In diesem Zusammenhang wurde eine begrenzte Anzahl von biologisch wichtigen Epitope Qa-1 beschrieben. Die meisten dieser QS-1-Epitope wurden während des Studiums der CD8 serendipitously identifiziert⁺ T Zelle Antworten auf Bakterien¹³, einen Mangel an TAP³Zellen und Zellen einen Mangel an ERAAP⁴Zellen, die dazu führen, EAE^{6dass, 9}. Daher ist eine hoher Durchsatz-Technik für die Identifizierung von biologisch wichtigen QS-1-Epitopen in einem definierten Protein wünschenswert. Im folgenden beschreiben wir eine überlappende Peptid (OLP) Bibliothek-Strategie, die funktionale Qa-1 Epitope in einem Protein mit QS-1-Resrticted CD8 Karten⁺ T-Zell-Linien bestimmten für den OLP-Pool (OLP_pool) eines Proteins.

Protokoll

Alle Experimente wurden durchgeführt in Übereinstimmung mit einer institutionellen Animal Care und Einsatz-Protokoll durch Animal Care and Use Committee an der University of Texas at El Paso und der Loma Linda Universität genehmigt.

1. Generation einer OLP-Bibliothek, die über die gesamte Länge eines Proteins

1. Entwerfen Sie eine OLP-Bibliothek, in der alle Peptide sind 15-Mer in der Länge, und angrenzenden Peptide eine Überlappung von 11 Aminosäuren.
   Hinweis: In der MOG OLP-Studie Abfolge von MOG Vorläufer [Mus Musculus] wurde abgerufen von NCBI Proteindatenbank unter folgendem Link: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_034944. Der MOG-Vorläufer (247 Aminosäuren), der Signal- und Reifen Peptide enthielt, wurde verwendet, weil die meisten der gemeldeten Qa-1 (HLA-E) Epitope in Signal-Peptide (z.B. Qdm¹) befanden. Beginnend bei der N-Terminus, wurden die Sequenzen von 15-Mer Peptide identifiziert, so dass zwei benachbarte Peptide von 11 Aminosäuren (Abbildung 1) überlappt. In 247 Aminosäure MOG Vorläufer wurden daher genau 59 OLPs ermittelt. Allerdings reichen die letzten OLP von 12 bis 15-Mer abhängig von der Länge des Proteins. Darüber hinaus wählen wir 15-Mer Bibliothek, weil wir und andere gezeigt haben, dass 15-Mer Peptide, wenn in dendritischen Zellen (DCs) oder Makrophagen, hinzugefügt effizient weiterverarbeitet Epitope für die Anerkennung von CD8 Zellen⁺ T^14,15 .
2. Erwerben Sie jede einzelne Peptid im Handel. 5 mg pro Peptid sollten reichen für das Screening. OLPs und abgeschnittene Peptide (Schritt 6.1) kann entsalzten Peptide (Reinheit ist ca. 50-70 %). Die Reinheit der optimale Peptid (Schritt 6.2), die für die Erzeugung von Tetramer und für zukünftige Analysen verwendet werden soll > 90 %. Wiederherzustellen Sie die Peptide unter sterilen Zustand.
3. Machen Sie 50 mg/mL in 100 % DMSO individuelle Peptid-Aktien. Fügen Sie 5 mg jedes Peptid 100 μL von DMSO in jedem Röhrchen mischen und speichern die Peptide bei-20 ° C. Diese Bestände werden verwendet, um ein OLP_pool-Lager für die Generation der CD8 machen⁺ T-Zell-Linien auf den OLP_pool reagiert. Darüber hinaus werden diese Bestände auch verwendet werden, um 10 mg/mL machen individuelle Peptid Bestände zur Bestimmung der Fähigkeit jedes einzelnen Peptid, eine QS-1-eingeschränkt Antwort in ein OLP_pool-reaktive CD8 stimulieren⁺ T-Zell-Linie.
4. Machen OLP_pool Lager durch Hinzufügen zum gleichen Volumen jedes Peptid in ein frisches Gefäß. Diese OLP_pool enthält 100 % DMSO. In der MOG OLP-Studie gab es 59 OLPs¹². Daher war die Konzentration der jedes Peptid in der OLP_pool 847.46 μg/mL (50 mg/mL ÷ 59).
5. 10 mg/mL individuelle Peptid Bestände durch verdünnen (5 X) machen die Aktie 50 mg/mL in sterilen H₂O in einem V-Boden-96-Well-Platte (diese Lager enthält 20 % DMSO). Machen Sie diese Bestände in einer 96-Well-Platte, da die Bestimmung der QS-1-eingeschränkt Antwort von jedem einzelnen Peptid in eine 96-Well-Platte mit einem 8- oder 12-Kanal Mehrkanal-Pipette ausgeführt wird.
   Hinweis: Alle Peptide, einschließlich OLPs und abgeschnittene Peptide, sollte entweder eine V-Boden-96-Well-Platte verdünnt werden oder eine 96-Well-Probenrack mit 1 mL Röhrchen gefüllt, da das Peptid-Bibliothek-Screening in 96-Well-Platten mit einer Mehrkanal-Pipette durchgeführt wird. Wenn es schwierig, eine Peptid zu verdünnen, Tropfen Sie 1 N NaOH weisen zu helfen, das Peptid auflösen.

2. Priming von K^b-/- D^b-/- CD8⁺ T-Zellen mit dem OLP_pool-gepulste K^b-/- D^b-/- dendritische Zellen (DCs).

Hinweis: Es gibt zwei große QS-1-Allel: einer ist QS-1^ein, und der andere ist QS-1^b. Da die Tiere häufig verwendet für die akademische Forschung, z.B. C57BL/6 und Balb/c Mäuse, Qa-1^b, dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Zuordnung Qa-1^b Epitope in ein Protein. CD8⁺ T Zellen, die in diesem Protokoll verwendeten werden gereinigt, von K^b-/-D^b-/- Mäuse C57BL/6 (im Hintergrund) in welche CD8⁺ T Zellen sind meist durch nicht-klassischen MHC-Ib-Moleküle, einschließlich QS-1 eingeschränkt.

1. Knochenmark stammenden DCs als zuvor beschriebenen¹²produzieren.
   1. Kurz, Kultur des Knochenmarks Einzelzelle Suspensionen (1 x 10⁶ Zellen/mL) in RPMI-10 Medium (RPMI 1640 ergänzt mit 10 % fötalen Rinderserum, 5.5 x 10^-5 M 2-Mercaptoethanol, 1 mM Natrium Pyruvat und unwesentliche Aminosäure 0,1 mM) enthält 10 U/mL IL-4 und 100 U/mL GM-CSF in einem 6-Well-Platte (4 mL/Na) bei 37 ° C, 5 % CO₂.
   2. Zwei Tage später, entfernen Sie nicht anhaftende Zellen vorsichtig und fügen Sie hinzu, neue Medien und Zytokine.
   3. Nach der Kultivierung der Zellen für weitere zwei Tage, nicht anhaftende Zellen mit frischen Medien und Zytokine in eine neue 6-Well-Platte zu übertragen.
   4. Die Zellen für weitere zwei Tage Kultur und aufgefüllt mit frischen Medien und Zytokine mit LPS (0,1 µg/mL), die DCs zu aktivieren.
   5. 24 h später, sammeln die DCs für Experimente.
2. Die DCs mit 3000 Rads zu bestrahlen.
   1. Alternativ behandeln die DCs (5 x 10⁷ Zellen/mL) mit Mitomycin C (50 μg/mL) mit PBS-Puffer bei 37 ° C für 20 min. RPMI-0 (RPMI 1640 ohne Serum) hinzufügen, um das Rohr (12 mL) füllen und drehen Sie die Zellen für 10 min in einer Tischplatte Zentrifuge bei 300 x g. verwerfen Überstände und Nummer t des Waschvorgangs noch zweimal. Diese drei Wäschen kritisieren weil jede Spur Menge Mitomycin C die Reaktion der CD8 hemmen kann⁺ T Zellen während der DC-T Co Zellkultur.
3. Passen Sie die DC-Konzentration bis 5 x 10⁶ Zellen/mL in einem serumfreien Medium (AIM-V serumfreien Medium ergänzt mit 5.5 x 10^-5 M 2-Mercaptoethanol, 1 mM Natrium Pyruvat und unwesentliche Aminosäure 0,1 mM).
4. Fügen Sie die OLP_pool-Stammlösung, die 100 % DMSO auf die DCs enthält, so dass DMSO Endkonzentration 0,5 % (200 X). In der MOG OLP-Studie wurde die Konzentration von jedem OLP in der OLP_pool 847.46 μg/mL; Daher war die Endkonzentration von jedem OLP in der DC-Kultur 4.2 μg/mL (847.46 μg/mL ÷ 200).

Jedoch kann diese Konzentration bis zu 100 μg/mL skaliert werden, solange die DMSO-Konzentration in der Zellkultur weniger als 1 ist %.

Brüten Sie die DCs bei Raumtemperatur für 3 h und schütteln Sie die Zellen leicht alle 15 min.

Während dieser Inkubationszeit reinigen CD8⁺ T-Zellen aus dem geernteten Milz oder Lymphknoten von K^b-/-D^b-/- Mäuse mit einem kommerziellen CD8⁺ T Zelle Reinigung Kit, passen Sie die Zellkonzentration bis 10 x 10⁶ Zellen/mL in die serumfreien Medium mit 50 U/mL Interleukin 2 (IL-2) und 100 U/mL IL-7.

Fügen Sie nun die CD8⁺ T-Zellen in einem 48-Well-Platte als 0,5 mL/gut (nach der Zugabe von 0,5 mL/gut von der OLP_pool-gepulste DCs in Schritt 2,8, die Endkonzentration der CD8⁺ T Zellen werden 5 x 10⁶ Zellen/mL).
Hinweis: CD8⁺ T Zellen aus Maus Milz und Lymphknoten können gereinigt werden, indem, dass CD8 positiven Isolierungskit entsprechend den Anweisungen des Herstellers. CD8⁺ T-Zellen sind frei von Perlen.

Spin-down der OLP_pool-gepulste DCs (300 X g, 10 min) bei RT rekonstruieren die DCs OLP_pool gepulst bis 2 x 10⁶ Zellen/mL in serumfreien Medium und fügen 0,5 mL/Brunnen in der 48-Well-Platte, die die CD8 enthält⁺ T-Zellen (Endkonzentration von der OLP _pool-gepulste DCs ist 1 x 10⁶ Zellen/mL, Endkonzentration von CD8⁺ T Zellen ist 5 x 10⁶ Zellen/mL und Endkonzentration von IL-2 ist 25 U/mL Endkonzentration von IL-7 ist 50 U/mL). Kultur der Zellen bei 37 ° C und 5 % CO₂.

Am 4. Tag entfernen Sie und entsorgen Sie etwa 400 μl des Kulturmediums und 500 μL der frischen serumfreien Medium mit 100 U/mL IL-2 und 100U/mL IL-7 in jede Vertiefung. Inkubation der Zellen bei 37 ° C und 5 % CO₂.

Am Tag 7 oder 8, neu stimulieren die OLP_pool grundiert CD8⁺ T-Zellen mit den OLP_pool.

(3) Restimulation grundiert CD8⁺ T Zellen mit Makrophagen gepulst mit der OLP_pool

1. Vier Tage vor der erneuten Stimulation des OLP_pool grundiert CD8⁺ T-Zellen, 2 % (V/V) Polyacrylamid Wulst Lösung vorbereiten: waschen 2 g Polyacrylamid Perlen zweimal in 20 mL Endotoxin-freie H₂O oder PBS. Pellet-Polyacrylamid-Perlen durch Zentrifugieren (400 X g) für 5 min und in 100 mL PBS aufzuwirbeln. Autoklaven bei 15 lb/m für 20 min. Store bei Raumtemperatur.
2. Injizieren Sie Mäusen intraperitoneal mit 1 mL/Maus der sterilen 2 % Polyacrylamid Wulst Lösung für die Migration von Monozyten/Makrophagen in die Bauchhöhle¹⁶zu gewinnen.
3. Vier Tage später, die Tiere durch CO₂ Überdosierung zu opfern.
   1. Unter sterilen Bedingungen, schneiden Sie eine kleine Öffnung in der Mitte des Bauches, so dass die Öffnung gerade genug ist für das Bestehen einer 5 mL-Transfer-Pipette. Füllen Sie die Transferpipette mit RPMI-0 und legen Sie die Pipette in den Bauch Hohlraum durch die Öffnung.
   2. Spülen Sie den Bauch Hohlraum durch pipettieren. Pipette, soviel Flüssigkeit wie möglich aus dem Bauch Hohlraum in ein steriles Röhrchen (diese sind peritonealen Makrophagen). Wiederholen Sie spülen-Schritt 4 - 5 Mal.
4. Die peritonealen Makrophagen mit 3000 Rads zu bestrahlen.
   1. Alternativ behandeln Sie die peritonealen Makrophagen mit Mitomycin C (folgen Sie den beschriebenen Schritt 2.2).
5. Passen Sie die Konzentration der peritonealen Makrophagen, 5 x 10⁶ Zellen/mL in serumfreien Medium. Fügen Sie OLP_pool Lager (die Endkonzentration von DMSO ist weniger als 1 %) und M-CSF (Endkonzentration = 100 U/mL).
   Hinweis: In dieser Studie MOG OLP verwendet wir 0,5 % DMSO. Somit bestand MOG OLP_pool verdünnte 200 x (z.B. 1 μL des MOG OLP_Pool Lager in 199 μL der peritonealen Makrophagen hinzugefügt wurde). Daher wurde die Endkonzentration von jedem OLP 4.2 μg/mL).
6. Fügen Sie 200 μl/Well (1 x 10⁶ Zellen/Na) in einer Gewebekultur 48-Well-Platte und inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C für 4 h.
7. Entfernen Sie die nicht-anhaftende Zellen und Polyacrylamid-Perlen durch sanftes waschen mit 200 μl/Well des vorgewärmten RPMI-0.
8. Sammeln und Pool die OLP_pool grundiert CD8⁺ T-Zellen aus Schritt 2.10. Passen Sie die OLP_pool grundiert CD8⁺ T-Zell-Konzentration bis 1 x 10⁶ Zellen/mL in serumfreien Medium mit 25 U/mL IL-2 und 50 U/mL IL-7. Fügen Sie 1 mL/gut, die 48-Well-Platte, die die OLP_pool-gepulste peritonealen Makrophagen enthält.
9. Ergänzen Sie vier Tage später das Medium in der 48-Well-Platte. Entfernen Sie und entsorgen Sie ca. 400 μl des Kulturmediums in die Kultur 48-Well-Platten. Fügen Sie 500 μL der frischen serumfreien Medium mit 100 U/mL IL-2 und 100 U/mL IL-7 in jede Vertiefung. Kultur der Zellen bei 37 ° C und 5 % CO₂.
10. Drei oder vier Tage später, untersuchen Sie die OLP_pool-restimuliert CD8⁺ T-Zellen für OLP_pool-spezifische, QS-1-eingeschränkte Reaktion durch Enzym-linked Immunospot Assay (ELISPOT). Nach diesem Zeitpunkt neu stimulieren die CD8⁺ T Zellen alle 7-10 Tage.
    Hinweis: Makrophagen werden bevorzugt für die erneute Stimulation der OLP_pool grundiert CD8⁺ T Zellen. Wir haben festgestellt, dass CD8⁺ T Zellen wieder angeregt durch Makrophagen wuchs besser als DCs in Vitro.

(4) Bestimmung der OLP_pool-spezifische, QS-1-eingeschränkte Reaktion in eine OLP_pool restimuliert CD8⁺ T-Zell-Linie

Hinweis: OLP_pool-spezifische, QS-1-eingeschränkt Antwort in ein OLP_pool restimuliert CD8⁺ T-Zell-Linie richtet sich nach IFNγ Sekretion nach Stimulation durch die OLP_pool in Anwesenheit von C1R oder C1R. QS-1^b -Zellen mit einem IFNγ ELISPOT Assay. C1R Zellen sind kommerziell erhältlich. C1R. QS-1^b -Zellen können durch transducing die C1R Zellen mit der QS-1 Lentivirale Vektor erzeugt werden.

1. Fügen Sie 100 μl/Well eines Capture Anti-IFN-γ-Antikörpers in Beschichtung Puffer (PBS) in die Vertiefungen eines ELISPOT-Platte verdünnt.

Verschließen und über Nacht die Platte bei 4 ° C inkubieren.

Am zweiten Tag verwerfen Sie die Beschichtung-Puffer mit der Capture-Anti-IFN-γ-Antikörper und fügen Sie 200 μl/well-Blocker-Lösung (serumfreien Medium) und inkubieren Sie die Platte für 2 h bei Raumtemperatur.

Die C1R und C1R zu bestrahlen. QS-1^b -Zellen mit 9.600 Rads.

1. Alternativ behandeln Sie die C1R und C1R. QS-1^b -Zellen mit Mitomycin C, wie in Schritt 2.2 beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Behandlungszeit 30 min werden.

Passen Sie die C1R und C1R. QS-1^b -Zellen in serumfreien Medium 4 x 10⁶ Zellen/mL.

Entsorgen Sie die blockierende Lösung in der Platte und fügen Sie die C1R und C1R. QS-1^b -Zellen bei 50 μl/Well (200.000 Zellen/Na) und Mix.

Fügen Sie 50 μL/gut 100 x OLP_pool Lager (in serumfreien Medium) verdünnt und mischen Sie richtig. Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für ca. 2-3 h.

Passen Sie die OLP_pool-restimuliert CD8⁺ T auf 1 bis 2 x 10⁶ Zellen/mL in serumfreien Medium mit 150 U/mL IL-7 Zellen und die Platte 50 μl/Well (50.000-100.000 Zellen/Na) hinzufügen. Zentrifugieren Sie die Platte (58 X g) für 5 min.

Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C und 5 % CO₂ über Nacht.

Aspirieren Sie Zellsuspension. Waschen Sie Brunnen 2 Mal mit entionisiertem Wasser (DI) (250 μl/Well). Lassen Sie Brunnen für 5 min bei jedem Waschschritt einweichen.

Waschen Brunnen 3 Mal ich mit waschen Puffer (PBS mit 0,05 % Tween20). Lassen Sie Brunnen für 1 min bei jedem Waschschritt einweichen. Waschpuffer zu verwerfen.

Fügen Sie 100 μL der Detektionsantikörper verdünnt in einen Verdünnungspuffer (PBS mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS)).

Inkubieren Sie die Platten in 2 h bei Raumtemperatur.

Antikörperlösung Erkennung zu verwerfen. Waschen Sie Brunnen 3 Mal mit 250 µL/Well waschen Puffer I. ermöglichen Brunnen für 1 min bei jedem Waschschritt einweichen.

Fügen Sie 100 μl/Well des Enzym-Konjugat (Streptavidin-HRP) in Verdünnungspuffer bei 1: 100 Verdünnung verdünnt.

Inkubieren Sie die Platten für 1 h bei Raumtemperatur.

Enzym-Konjugat-Lösung zu verwerfen. Waschen Sie Brunnen 4 Mal mit 250 µL/Well waschen Puffer I. ermöglichen Brunnen für 1 min bei jedem Waschschritt einweichen.

Waschen Sie Brunnen 2 Mal mit 250 µL/Well waschen Puffer II (PBS).

Jedes gut 100 µL Substratlösung (Mischung 1 Tropfen = 20 µL des AEC-Chromogen mit 1 mL der AEC-Substrat) hinzufügen. Vor Ort Entwicklung für 5 bis 60 min zu verfolgen.

Wenn die gewünschten Ergebnisse beginnen zu erscheinen, vorbeischauen Sie der Substratreaktion Brunnen mit destilliertem Wasser waschen.

An der Luft trocknen der Platten bei Raumtemperatur für 2 Stunden oder über Nacht bis es völlig trocken ist. Entfernung von der Plastikschale unter den Platten erleichtert trocknen. Speichern Sie Platten in einem verschlossenen Plastikbeutel im Dunkeln, bis es analysiert wird.

Auflisten von Flecken manuell durch Inspektion unter dem sezierenden Mikroskop oder mit einem ELISPOT-Platte-Reader. Das repräsentative Ergebnis in Abbildung 2zu sehen.

5. Ermittlung der einzelnen Peptide in der OLP_pool die die eingeschränkte Qa-1 IFN-γ Sekretion in ein OLP_pool-spezifische CD8 stimulieren⁺ T-Zell-Linie

1. Bestimmen die einzelnen Peptide, die die OLP_pool-spezifisch, QS-1-Restrictred IFN-γ Sekretion in ein OLP_pool-spezifische CD8 stimulieren⁺ T-Zell-Linie mit den oben beschriebenen IFN-γ ELISPOT Assay (Endkonzentration von jedem einzelnen Peptid verwendet für die ELISOPT ist Assay 10 μg/mL). Repräsentative Ergebnisse in Abbildung 3zu sehen.
   Hinweis: Ein OLP-spezifisch, QS-1-Restircted Antwort eine Antwort bezeichnet, die mindestens drei Mal die Reaktion in Anwesenheit von C1R. QS-1^b -Zellen, aber ohne die OLP. In der MOG OLP Studie, OLP68, OLP96 und OLP105 erfüllt dieses Kriterium. Deshalb enthalten alle drei OLPs potenziell Qa-1 Epitope¹² (Abbildung 3). Jedoch gaben die OLP105 konsequent die stärkste Reaktion; Daher führten wir eine detaillierte Analyse der OLP105 (Abbildung 4 und Abbildung 5)¹².

6. Identifikation der optimale QS-1-Epitop in einem 15-Mer OLP die stimuliert die Epitop-spezifische, QS-1-eingeschränkt Reaktion in einer OLP_pool-spezifische CD8⁺ T-Zell-Linie

1. C - und N-Terminal abgeschnitten Peptide von einem 15-Mer OLP wie in Abbildung 4gezeigt zu synthetisieren.
2. IFN-γ Sekretion in einer OLP-spezifischen CD8 untersuchen⁺ T-Zell-Linie durch die Stimulierung der CD8⁺ T-Zellen mit jeweils die abgeschnittenen Peptide als auch die elterliche 15-Mer OLP in Anwesenheit von C1R oder C1R. QS-1^b -Zellen mit den oben beschriebenen IFN-γ ELISPOT Assay. Die Endkonzentration von jedem einzelnen Peptid für ELISPOT Assay verwendet ist 10 μg/mL. Eine Peptid ist definiert als die optimale QS-1-Epitop, wenn das Peptid: 1) konsequent gibt ähnliche oder stärkere IFN-γ Antwort, im Vergleich zu den ursprünglichen 15-Mer Peptid in Anwesenheit von C1R. QS-1^b -Zellen; (2) ist zwischen 8 - 10-Mer (9-Mer Peptid bevorzugt) welches sind die Peptid-Längen, gebunden an MHC-ich Moleküle^15,17. Vertreter Ergebnisse in Abbildung 5zu sehen.

Ergebnisse

Entwurf einer OLP-Bibliothek, die über die gesamte Länge eines Proteins

Beginnend am N-Terminus eines Proteins, ist jedes Peptid 15 Aminosäuren (15-Mer). Daher umfasst das erste Peptid Position 1 auf Position 15. Der N-Terminus des zweiten Peptids überschneidet sich mit dem C-Terminus des ersten Peptids durch 11 Aminosäure. Daher umfasst das zweite Peptid die Position 5 auf Position 19. Entwerfen Sie den Rest der Peptide bis z...

Diskussion

Hier haben wir ein Protokoll für die Analyse von Qa-1 Epitope in einem Protein beschrieben. In Bezug auf dieses Protokoll wurden mehrere andere Strategien auch zuvor gemeldet. Erstens die allogene CD8⁺ T-Zell-Linien und Klone wurden für die Identifizierung des Qdm¹verwendet. Zweitens wurde ein vermeintlicher QS-1-Bindung-Motiv aus der Analyse der Qdm für die Identifizierung von HSP60p216-224 und eine TCRBV8.1 Epitop^9,18verwen...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
The protein to be analyzed	N/A	N/A	Sequence of the protein can be obtained from NCBI
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	Cat#: D2650 SIGMA	DMSO should be sterile and cell culture tested.
Kb-/-Db-/- mice	The Lackson Laboratory	Stock#: 019995	We used Taconic H2-KbH2-Db doube knockout mice (Cat#: 4215-F and 4215-M) which however are not available anymore.
AIM V Serum Free Medium	ThermoFisher Scientific	Cat#: 12055091
2-mercaptoethanol	ThermoFisher Scientific	Cat#: 21985023
Sodium pyruvate	ThermoFisher Scientific	Cat#: 11360070
Nonessential Amino Acids	ThermoFisher Scientific	Cat#: 11140076
Dynabeads CD8 Positive Isolation Kit	ThermoFisher Scientific	Cat#: 11333D
Bio-Gel P-100	Bio-Rad	Cat#: 150-4171
Phoshate Balanced Solution (PBS)	ThermoFisher Scientific	Cat#: 20012027
Trasfer pipette	Globe Scientific	Mfg#: 137238
Murine M-CSF	PeproTech	Cat#: 315-02
48-well tissue culture plates	USA Scientific	Cat#: CC7682-7548
Corning Costar TC-treated Multiple well Plates, 96-well, V-shaped bottom	Sigma-Aldrich	Cat#: Z372129 Sigma
1ml deep 06-well PP plate, sterile	USA Scientific	Item#: 1896-1110
Recombinant murine IL-2	PeproTech	Cat#: 212-12
Recombinant murine IL-7	PeproTech	Cat#L: 217-17
Capture anti-IFN-γ antibody	BD Biosciences	Cat#: 551881
ELISPOT plate	Sigma-Aldrich	Cat#: S2EM004M99
C1R	ATCC	Cat#: ATCC CRL-1993
C1R.Qa-1b			Custom made (GenBank access#: NM_010398.3)
Qa-1 lentiviral vector	GeneCopoeia	Product#: Mm02955
Detection anti-IFN-γ antibody	BD Biosciences	Cat#: 551881
Tween20	Sigma-Aldrich	Cat#: P9416
Streptavidin-HRP	BD Biosciences	Cat#: BD557630
AEC substrate	BD Biosciences	Cat#: 551951
ImmunoSpot Analyzer	ImmunoSpot		Any immunoSpot analyer should work for this purpose.