Libreria del Peptide per mappare gli epitopi di Qa-1 in una proteina di sovrapposizione

Riepilogo

QA-1 (HLA-E nell'uomo) appartiene ad un gruppo di molecole complesse 1b non classici di istocompatibilità. Immunizzazione con gli epitopi Qa-1-associazione ha dimostrato di aumentare la regolazione immunitaria tessuto-specifici e migliorare diverse malattie autoimmuni. Qui descriviamo una strategia di libreria del peptide sovrapposti per l'identificazione di epitopi di Qa-1 in una proteina.

Abstract

QA-1 (HLA-E nell'uomo) appartiene ad un gruppo di non-classica di istocompatibilità complex 1b molecole (MHC-Ib). Dati recenti suggeriscono che Qa-1 molecole svolgono un ruolo importante in rilievo le cellule per l'integrità strutturale e funzionale, inducendo la regolazione immunitaria e limitando la risposta immunitaria alle infezioni virali. Inoltre, l'aumento funzionale della Qa-1-restricted CD8⁺ T cellule tramite epitopo immunizzazione ha mostrato effetti terapeutici in diversi modelli animali di malattia autoimmune, ad esempio l'encefalomielite allergica sperimentale, l'artrite indotta da collagene e diabete non obesi. Di conseguenza, c'è un urgente bisogno di un metodo che può efficacemente e rapidamente identificare gli epitopi in una proteina funzionali-Qa-1. Qui, descriviamo un protocollo che utilizza Qa-1-restricted CD8⁺ cellula T linee specifiche per una libreria peptidica (OLP) sovrapposti per determinare gli epitopi di Qa-1 in una proteina. Questa libreria OLP contiene peptidi sovrapposti 15-mer che coprono tutta la lunghezza di una proteina, e peptidi adiacenti si sovrappongono da 11 aminoacidi. Usando questo protocollo, abbiamo recentemente identificato un epitopo di Qa-1 9-mer alla della glicoproteina del oligodendrocyte del myelin (MOG). Questo appena mappata epitopo di MOG Qa-1 è stato indicato per indurre CD8 epitopo specifico, Qa-1-restricted⁺ T cellule che una maggiore regolazione immunitaria mielina specifici. Di conseguenza, questo protocollo è utile per la ricerca futura di nuovi bersagli e funzioni di Qa-1-restricted CD8⁺ T cellule.

Introduzione

QA-1 appartiene ad un gruppo di non-classica di istocompatibilità complex 1b molecole (MHC-Ib) in topi. Suo omologo umano è HLA-E. La prova precedente ha dimostrato che le molecole di Qa-1 hanno importanti funzioni biologiche. In primo luogo, Qa-1 molecole svolgono un ruolo importante nel rilevamento topografico di cellule per integrità strutturale e funzionale. A questo proposito, Qa-1 molecole hanno evoluto strategie diverse per monitorare la funzione normale di una cella. Una tale strategia consente Qa-1 molecole per formare complessi con un peptide leader trasformati (epitopo), cioè il Qa-1 determinante modificatore (Qdm) che viene elaborato da molecole di MHC-Ia classiche nel reticolo endoplasmatico¹. Questi complessi di Qa-1/Qdm successivamente visualizzano sulla superficie di una cellula e associare a recettori inibitori NKG2A sulle cellule NK per inibire NK uccidendo attività². Se l'espressione di molecole MHC-Ia è perduto, una cella (ad es. una cellula maligna) diventa sensibile alla NK uccidendo². L'altra strategia consente Qa-1 molecole per formare nuovi complessi di Qa-1/epitopo sulla superficie di una cellula che è carente in TAP (trasportatore associate all'elaborazione dell'antigene)³ e/o ERAAP (reticolo endoplasmico aminopeptidasi associati elaborazione dell'antigene)⁴ (entrambe le carenze si verificano spesso in cellule maligne). La cellula che esprime questi nuovi complessi di Qa-1/epitopo può quindi essere riconosciuta ed eliminata dall'epitopo specifico Qa-1-restricted CD8⁺ T cellule. In secondo luogo, Qa-1 molecole inducono regolazione immunitaria⁵. A questo proposito, Qa-1/epitopo complessi sono stati indicati per stimolare CD8⁺ cellule regolarici di T (Treg) che sono importanti per la prevenzione del danno immune-mediato di auto-tessuti^{6,7,8 ,9,10}. In terzo luogo, Qa-1-restricted CD8⁺ Treg cellule sono state indicate per limitare le risposte immunitarie contro l'infezione virale¹¹.

Pertanto, l'incremento specifico di epitopo specifico Qa-1-restrictred CD8⁺ T cellule è una strategia potenzialmente promettente per l'eliminazione delle cellule anormali, per il miglioramento della regolazione immune e per il controllo dell'entità del risposte immunitarie indotta da virus. Mentre esso non è stato determinato se l'incremento di epitopo specifico Qa-1-restricted CD8⁺ T cellule possono aumentare la sorveglianza immune e limitare le risposte immunitarie indotta da virus, i nostri laboratori e altri hanno dimostrato chiaramente che immunizzazione con gli epitopi Qa-1 può aumentare la funzione di Qa-1-restricted CD8⁺ Treg cellule specifiche per patogeni autoimmuni CD4⁺ T cellule, con conseguente controllo efficiente di CD4⁺ malattie autoimmuni T cellulo-mediata in un modelli di varietà di animali come encefalomielite allergica sperimentale (un modello animale della sclerosi multipla umana)^6,10, artrite indotta da collagene (un modello animale dell'artrite reumatoide umana)⁷, e diabete non obesi (un modello animale del diabete di tipo 1 umano)⁸. Inoltre, abbiamo scoperto che l'immunizzazione con un epitopo di Qa-1 tessuto-specifici conduce al controllo specifico di infiammazione immune-mediata in quel tessuto attraverso l'aumento di CD8⁺ Treg cells¹². I successi precedenti studi preclinici indicano la necessità di una valutazione completa di immunizzazione di epitopo Qa-1 per il trattamento di malattie immuno-mediate di tessuto-specifici e, potenzialmente, per la terapia di altre malattie connesse con le mancanze nel rubinetto e ERAAP.

Di conseguenza, esiste una domanda per una tecnologia che può attendibilmente e rapidamente analizzare gli epitopi di Qa-1 in una proteina. A questo proposito, è stato descritto un numero limitato di epitopi Qa-1 biologicamente importanti. La maggior parte di questi epitopi di Qa-1 sono stata identificata serendipitously durante lo studio di CD8⁺ T cell responses to batteri¹³, le cellule carenti di rubinetto³, le cellule carenti di ERAAP⁴e le cellule che causano EAE^{6, 9}. Pertanto, una tecnica di elevato throughput è auspicabile per l'identificazione di epitopi di Qa-1 biologicamente importanti in una proteina definita. Di seguito descriviamo una strategia di libreria del peptide (OLP) sovrapposti che esegue il mapping funzionali epitopi di Qa-1 in una proteina usando CD8 Qa-1-resrticted⁺ cellula T linee specifiche per il pool di OLP (OLP_pool) di una proteina.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati fatti in conformità con un protocollo di utilizzo approvato dal comitato di impiego presso l'Università del Texas a El Paso e Loma Linda University e cura degli animali e istituzionali Animal Care.

1. generazione di una libreria OLP che coprono l'intera lunghezza di una proteina

1. Progettare una libreria OLP in cui tutti i peptidi sono 15-mer in lunghezza, e peptidi adiacenti si sovrappongono da 11 aminoacidi.
   Nota: Nello studio MOG OLP, sequenza del precursore MOG [Mus musculus] è stato estratto dal database della proteina di NCBI seguendo questo link: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_034944. Il precursore MOG (247 aminoacidi), che conteneva sia segnale che peptidi maturi, è stato utilizzato perché la maggior parte degli epitopi di Qa-1 (HLA-E) segnalati sono stata situata in peptidi di segnale (ad esempio Qdm¹). All'inizio della sua estremità N-terminale, le sequenze di 15-mer peptidi sono state identificate tale che due peptidi adiacente sovrappongono da 11 aminoacidi (Figura 1). Quindi, esattamente 59 OLPs sono stati identificati nel precursore dell'aminoacido 247 MOG. Tuttavia, l'OLP scorso può variare da 12 a 15-mer a seconda della lunghezza della proteina. Inoltre, abbiamo scelto 15-mer biblioteca perché noi ed altri abbiamo dimostrato che 15-mer peptidi, quando aggiunto in cellule dendritiche (DCs) o macrofagi, possono essere efficientemente trasformati in epitopi per riconoscimento di CD8⁺ T cellule^14,15 .
2. Acquistare ogni singolo peptide commercialmente. 5 mg al peptide dovrebbe essere sufficiente per lo screening. OLPs e peptidi troncati (passo 6.1) possono essere dissalate peptidi (purezza è circa 50-70%). La purezza del peptide ottima (punto 6.2) che verrà utilizzato per la generazione del tetramero e per future analisi biologiche deve essere > 90%. Ricostituire i peptidi in condizioni sterili.
3. Fanno scorte di peptide individuale di 50 mg/mL in 100% DMSO. Per 5 mg di ciascun peptide, aggiungere 100 μL di DMSO in ogni provetta, mescolare e conservare i peptidi a-20 ° C. Questi stock verranno utilizzati per fare un magazzino di OLP_pool per la generazione di CD8⁺ T cell lines reattiva per il OLP_pool. Inoltre, questi stock servirà anche a fare 10 mg/mL scorte di peptide individuali per determinare la capacità di ciascun peptide individuali per stimolare una risposta di Qa-1-limitati in un OLP_pool-reattiva CD8⁺ linea a cellula T.
4. Marca OLP_pool stock aggiungendo un volume uguale di ciascun peptide in una nuova provetta. Questo stock OLP_pool contiene 100% DMSO. Nello studio MOG OLP, c'erano 59 OLPs¹². Quindi, la concentrazione di ciascun peptide nella OLP_pool era 847.46 μg/mL (50 mg/mL ÷ 59).
5. Fanno 10 mg/mL del peptide individuali scorte di diluzione (5x) lo stock di 50 mg/mL in sterile di H₂O in un piatto fondo V 96 pozzetti (questo stock contiene 20% DMSO). Fanno queste scorte in una piastra a 96 pozzetti, poiché la determinazione della risposta Qa-1-limitati di ciascun peptide individuali non verrà eseguita in una piastra a 96 pozzetti usando una pipetta multicanale a 8 o 12 canali.
   Nota: Tutti i peptidi, tra cui OLPs e peptidi troncati, devono essere diluiti in entrambi un piatto fondo V 96 pozzetti o un rack 96 pozzetti campione riempito con 1 mL provette poiché lo screening di libreria del peptide viene eseguito in piastre da 96 pozzetti usando una pipetta multicanale. Se è difficile diluire un peptide, aggiungere 1 goccia di NaOH N saggio per aiutare a sciogliere il peptide.

2. innesco di K^b-/- D^b-/- CD8⁺ le cellule di T con la K OLP_pool-pulsata^b-/- D^b-/- cellule dendritiche (DCs).

Nota: Ci sono due principali Qa-1 alleli: uno è Qa-1^una, e l'altro è Qa-1^b. Poiché gli animali comunemente usati per la ricerca accademica, per esempio C57BL/6 e topi Balb/c, trasportare Qa-1^b, questo protocollo descrive la procedura per la mappatura di Qa-1^b epitopi in una proteina. CD8⁺ T cellule utilizzate in questo protocollo sono purificate da K^b-/-D^b-/- topi (sfondo C57BL/6) in quale CD8⁺ T cellule sono limitate principalmente da molecole di MHC-Ib non classici tra cui Qa-1.

1. Prodotti derivanti dal midollo osseo DCs come precedentemente descritto¹².
   1. Brevemente, cultura sospensioni di singole cellule del midollo osseo (1 x 10⁶ cellule/mL) nel medium RPMI-10 (RPMI 1640 completati con 10% siero bovino fetale, 5.5 x 10^-5 M. 2-mercaptoetanolo, piruvato di sodio di 1 mM e 0,1 mM aminoacido non essenziale) contenente 10 U/mL IL-4 e 100 U/mL GM-CSF in una piastra a 6 pozzetti (4 mL/pozzetto) a 37 ° C, 5% CO₂.
   2. Due giorni dopo, rimuovere cellule non aderenti con cura e aggiungere citochine e media fresco.
   3. Dopo la coltura le cellule per altri due giorni, trasferimento di cellule non aderenti contenente media fresco e citochine in una nuova piastra 6 pozzetti.
   4. Le cellule della coltura per altri due giorni e rifornito con media fresco e citochine contenente LPS (0,1 µ g/mL) per attivare i controller di dominio.
   5. 24 ore più tardi, raccogliere i controller di dominio per gli esperimenti.
2. Irradiare il DCs con 3000 rad.
   1. In alternativa, trattare il DCs (5 x 10⁷ cellule/mL) con mitomicina C (50 μg/mL) in PBS a 37 ° C per 20 min. aggiungere RPMI-0 (RPMI 1640 senza siero) per riempire il tubo (~ 12 mL) e far girare le cellule per 10 min in una centrifuga di tavolo a 300 x surnatanti di g. scartare e ripet t la procedura di lavaggio due volte. Questi tre lavaggi sono critici perché qualsiasi quantità in tracce di mitomicina C può inibire la risposta di CD8⁺ T cellule durante la co-coltura di cellule DC-T.
3. Regolare la concentrazione di DC a 5 x 10⁶ cellule/mL in un medium privo di siero (AIM-V senza siero supplementato con 5.5 x 10^-5 M. 2-mercaptoetanolo, piruvato di sodio di 1 mM e 0,1 mM aminoacido non essenziale).
4. Aggiungere la soluzione madre di OLP_pool, che contiene 100% DMSO, ai controller di dominio, tale che la concentrazione di DMSO finale sarà 0,5% (200 x). Nello studio MOG OLP, la concentrazione di ciascun OLP nella OLP_pool era 847.46 μg/mL; da qui la concentrazione finale di ogni OLP nella cultura DC era 4,2 μg/mL (847.46 μg/mL ÷ 200).

Tuttavia, questa concentrazione può essere scalata fino a 100 μg/mL, purché la concentrazione di DMSO in coltura delle cellule rimane inferiore all'1%.

Incubare il DCs a temperatura ambiente per 3 h e agitare le cellule delicatamente ogni 15 min.

Durante questo periodo di incubazione, purificare CD8⁺ T cellule dal raccolto della milza o linfonodi di K^b-/-D^b-/- topi utilizzando un CD8 commerciale⁺ T cellulare kit di purificazione, regolare la concentrazione di cellule a 10 x 10⁶ cellule/mL in il medium senza siero contenente 50 U/mL interleukin 2 (il-2) e 100 U/mL di IL-7.

Ora, aggiungere il CD8⁺ T di celle in una piastra a 48 pozzetti come 0,5 mL/pozzetto (dopo l'aggiunta di 0,5 mL/bene della DCs OLP_pool-pulsato in passo 2.8, la concentrazione finale del CD8⁺ T cellule sarà 5 x 10⁶ cellule/mL).
Nota: CD8⁺ T cellule da mouse milza e linfonodi possono essere purificate utilizzando Kit di isolamento positivo CD8 seguendo le istruzioni fornite dal produttore. CD8⁺ T cellule ottenute sono liberi di perline.

Rotazione verso il basso il DCs OLP_pool-pulsato (300 x g, 10 min) a RT. ricostituire il DCs OLP_pool-pulsato a 2 x 10⁶ cellule/mL nel medium privo di siero e aggiungere 0,5 mL/pozzetto nella piastra 48-pozzo che contiene il CD8⁺ T cellule (concentrazione finale di OLP _pool-pulsato DCs è 1 x 10⁶ cellule/mL, la concentrazione finale di CD8⁺ T cellule è 5 x 10⁶ cellule/mL, la concentrazione finale del-2 è 25 U/mL e concentrazione finale di IL-7 è di 50 U/mL). Coltura le cellule a 37 ° C e 5% CO₂.

Il giorno 4, rimuovere e scartare circa 400 μL di coltura e aggiungere 500 μL del medium privo di siero fresco contenente 100 U/mL IL-2 e 100U/mL di IL-7 in ciascun pozzetto. Incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO₂.

Il giorno 7 o 8, ri-stimolare il CD8 innescato OLP_pool⁺ T cellule con il OLP_pool.

3. restimolazione del CD8 innescato⁺ T cellule con macrofagi ha pulsato con l'OLP_pool

1. Quattro giorni prima di re-stimolo del CD8 innescato OLP_pool⁺ T cellule, preparare soluzione al 2% (v/v) poliacrilammide perlina: lavare 2 g di perle di poliacrilammide due volte in 20 mL privo di endotossina H₂O o PBS. A pellet le perline di poliacrilammide mediante centrifugazione (400 x g) per 5 min e risospendere in 100 mL di PBS. Sterilizzare in autoclave a 15 lb/m per 20 min. Store a temperatura ambiente.
2. Iniettare topi intraperitonealmente con 1 mL/mouse della sterile soluzione 2% poliacrilammide perlina per attirare la migrazione dei monociti/macrofagi nella cavità peritoneale¹⁶.
3. Quattro giorni più tardi, sacrificare gli animali dalla dose eccessiva di CO₂ .
   1. In condizioni di sterilità, tagliare una piccola apertura al centro dell'addome in modo che l'apertura è appena sufficiente per il passaggio di una pipetta di trasferimento di 5 mL. Riempire la pipetta con RPMI-0 e inserire la pipetta nella cavità addominale attraverso l'apertura.
   2. Sciacquare la cavità addominale di pipettaggio. Pipettare fuori quanto più liquido possibile dalla cavità addominale in una provetta sterile (questi sono i macrofagi peritoneali). Ripetere il passaggio di risciacquo 4 - 5 volte.
4. Irradiare i macrofagi peritoneali con 3000 rad.
   1. In alternativa, trattare i macrofagi peritoneali con mitomicina C (seguire la procedura descritta al punto 2.2).
5. Regolare la concentrazione dei macrofagi peritoneali a 5 x 10⁶ cellule/mL nel medium privo di siero. Aggiungere il brodo di OLP_pool (la concentrazione di DMSO finale è meno dell'1%) e M-CSF (concentrazione finale = 100 U/mL).
   Nota: In questo studio di MOG OLP, abbiamo usato 0,5% DMSO. Così, MOG OLP_pool stock era diluito 200 x (es. 1 μL di MOG OLP_Pool magazzino è stato aggiunto in 199 μL dei macrofagi peritoneali). Quindi, la concentrazione finale di ogni OLP era 4,2 μg/mL).
6. Aggiungere 200 μL/pozzetto (1 x 10⁶ cellule/pozzetto) in una piastra di coltura del tessuto 48 pozzetti e incubare la piastra a 37 ° C per 4 h.
7. Rimuovere le cellule non-aderenti e le perle di poliacrilammide lavaggio delicato con 200 μL/pozzetto del pre-riscaldato RPMI-0.
8. Raccogliere e piscina il OLP_pool innescato CD8⁺ T cellule da passo 2.10. Regolare la OLP_pool innescato CD8⁺ concentrazione di cellule T a 1 x 10⁶ cellule/mL nel medium privo di siero contenente 25 U/mL IL-2 e 50 U/mL di IL-7. Aggiungere 1 mL/pozzetto il 48-piastra che contiene i macrofagi peritoneali OLP_pool-pulsato.
9. Quattro giorni più tardi, ricostituire il mezzo nella piastra 48 pozzetti. Rimuovere e scartare circa 400 μL di coltura nelle piastre di coltura 48 pozzetti. Aggiungere 500 μL di fresco medium privo di siero contenente 100 U/mL IL-2 e 100 U/mL di IL-7 in ogni pozzetto. Coltura le cellule a 37 ° C e 5% CO₂.
10. Tre o quattro giorni dopo, esaminare il CD8 restimolate OLP_pool⁺ T cellule di risposta specifiche OLP_pool, Qa-1-limitati dall'analisi enzima-collegata immunospot (ELISPOT). Dopo questo punto, ri-stimolare il CD8⁺ T cellule ogni 7-10 giorni.
    Nota: I macrofagi sono comodo per ri-stimolare il CD8 OLP_pool-innescato⁺ T cellule. Abbiamo notato che CD8⁺ T cellule ri-stimolate dal macrofago è cresciuto meglio di DCs in vitro.

4. la determinazione di specifiche OLP_pool, Qa-1-limitata risposta in un CD8 restimolate OLP_pool⁺ cellula T linea

Nota: OLP_pool-specific, Qa-1-limitata risposta in un CD8 restimolate OLP_pool⁺ linea a cellula T è determinato dalla secrezione di IFNγ dopo stimolazione da OLP_pool in presenza di C1R o C1R. QA-1^b cellule usando un'analisi di IFNγ ELISPOT. C1r cellule possono essere ottenute commercialmente. C1R. QA-1^b cellule possono essere generate da transducing C1R cellule con il vettore lentivirale Qa-1.

1. Aggiungere 100 μL/pozzetto di un anticorpo anti-IFN-γ cattura diluito in tampone di rivestimento (PBS) nei pozzetti di una piastra ELISPOT.

Ed incubare la piastra a 4 ° C durante la notte.

Il secondo giorno, scartare il tampone di rivestimento contenente l'anticorpo di anti-IFN-γ cattura e aggiungere 200 μL/ben-antibloccaggio soluzione (medium senza siero) e incubare la piastra per 2 h a temperatura ambiente.

Irradiare il C1R e C1R. QA-1^b cellule con 9.600 rad.

1. In alternativa, trattare il C1R e C1R. QA-1^b cellule con mitomicina C come descritto in Step 2.2 salvo che la durata del trattamento sarà 30 min.

Regolare la C1R e C1R. QA-1^b cellule nel medium privo di siero a 4 x 10⁶ cellule/mL.

Scartare la soluzione bloccante nel piatto e aggiungere il C1R e C1R. QA-1^b cellule a 50 μL/pozzetto (200.000 cellule/pozzetto) e mescolare.

Aggiungere 50 μL/pozzetto di 100 x diluito OLP_pool stock (in medium senza siero) e mescolare bene. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 2-3 h.

Regolare il CD8 restimolate OLP_pool⁺ T cellule per 1-2 x 10⁶ cellule/mL nel medium privo di siero contenente 150 U/mL di IL-7 e aggiungere 50 μL/pozzetto (50.000-100.000 cellule per pozzetto) alla piastra. Centrifugare la piastra (58 x g) per 5 min.

Incubare la piastra a 37 ° C e 5% di CO₂ durante la notte.

Aspirare la sospensione cellulare. Lavare i pozzetti 2 volte con acqua deionizzata (DI) (250 μL/pozzetto). Lasciare i pozzetti in ammollo per 5 min in ogni fase di lavaggio.

Pozzi lavare 3 volte con tampone di lavaggio (PBS contenente 0,05% Tween20). Lasciare i pozzetti in ammollo per 1 min in ogni fase di lavaggio. Gettare il tampone di lavaggio.

Aggiungere 100 μL di anticorpo di rilevazione diluito in un tampone di diluizione (PBS contenente 10% siero bovino fetale (FBS)).

Incubare le piastre a temperatura ambiente per 2 h.

Eliminare la soluzione di anticorpo di rilevazione. Lavare i pozzetti 3 volte con 250 µ l/pozzetto consentono di lavare Buffer I. pozzi in ammollo per 1 min in ogni fase di lavaggio.

Aggiungere 100 μL/pozzetto di coniugato enzimatico (streptavidina-HRP) diluito in tampone di diluizione alla diluizione 1: 100.

Incubare le piastre per 1 h a temperatura ambiente.

Scartare la soluzione di coniugato enzimatico. Lavare i pozzetti 4 volte con 250 µ l/pozzetto consentono di lavare Buffer I. pozzi in ammollo per 1 min in ogni fase di lavaggio.

Lavare i pozzetti 2 volte con 250 µ l/pozzetto lavare Buffer II (PBS).

Aggiungere 100 µ l di soluzione substrato (mix 1 goccia = 20 µ l di cromogeno AEC con 1 mL di substrato AEC) in ciascun pozzetto. Monitor spot sviluppo per 5 a 60 min.

Quando i risultati desiderati iniziano ad apparire, è possibile bloccare la reazione di lavaggio dei pozzetti con acqua distillata.

Asciugare le piastre a temperatura ambiente per 2 h o durante la notte fino a quando è completamente asciutto. Rimozione del vassoio in plastica sotto le piastre faciliterà l'essiccazione. Memorizzare piastre in un sacchetto di plastica sigillato al buio fino a quando è analizzato.

Enumerare manualmente punti di ispezione sotto un microscopio per dissezione o utilizzando un lettore di piastra ELISPOT. Vedere il risultato rappresentativo nella Figura 2.

5. determinazione dei singoli peptidi nella OLP_pool che stimolano la secrezione di IFN-γ Qa-1 limitato in un CD8 specifici OLP_pool⁺ linea a cellula T

1. Determinare i singoli peptidi che stimolano la OLP_pool-specifici, secrezione di IFN-γ Qa-1-restrictred in un OLP_pool specifico CD8⁺ linea a cellula T utilizzando il sopra descritto dosaggio di IFN-γ ELISPOT (concentrazione finale di ciascun peptide individuale utilizzato per la ELISOPT assay è 10 μg/mL). Vedere risultati rappresentativi nella Figura 3.
   Nota: Un OLP-specifico, Qa-1-restircted risposta è definito come una risposta che è almeno tre volte della risposta in presenza di C1R. QA-1^b cellule ma senza l'OLP. Nello studio di MOG OLP, OLP68, OLP96 e OLP105 tutti soddisfatti di questo criterio. Di conseguenza, tutti i tre OLPs contengono potenzialmente Qa-1 epitopi¹² (Figura 3). Tuttavia, la OLP105 costantemente ha dato la risposta più forte; Abbiamo quindi effettuato una dettagliata analisi della OLP105 (Figura 4 e Figura 5)¹².

6. identificazione dell'epitopo Qa-1 ottimale in un 15-mer OLP che stimola la risposta epitopo specifico, Qa-1-limitati in un CD8 specifici OLP_pool⁺ linea a cellula T

1. Sintetizzare peptidi C - e N-terminalmente troncato di un 15-mer OLP come mostrato nella Figura 4.
2. Esaminare la secrezione di IFN-γ in un CD8 specifici OLP⁺ linea a cellula T stimolando il CD8⁺ T cellule con ciascuno dei peptidi troncati, come pure l'OLP parentale 15-mer in presenza di C1R o C1R. QA-1^b celle utilizzando il sopra descritto dosaggio di IFN-γ ELISPOT. La concentrazione finale di ciascun peptide specifico utilizzato per il test ELISPOT è 10 μg/mL. Un peptide è definito come l'epitopo di Qa-1 ottima se il peptide: 1) costantemente dà risposta di IFN-γ simile o più forte, rispetto al peptide originale 15-mer, in presenza di C1R. QA-1^b cellule; 2) è compreso tra 8 - 10-mer (peptide di 9-mer preferito) che sono le lunghezze di peptide associate a MHC-sono molecole^15,17. Vedere Risultati rappresentante nella Figura 5.

Risultati

Progettazione di una libreria OLP che coprono l'intera lunghezza di una proteina

All'inizio del N-terminale di una proteina, ogni peptide è 15 aminoacidi (15-mer). Quindi, il primo peptide si estende su posizione 1 alla posizione 15. N-terminale del peptide secondo si sovrappone con il C-terminale del peptide primo da 11 aminoacidi. Quindi, il secondo peptide si estende dalla posizione 5 alla posizione 19. Progettare il resto dei ...

Discussione

Qui, abbiamo descritto un protocollo per l'analisi di epitopi di Qa-1 in una proteina. In relazione al presente protocollo, parecchie altre strategie inoltre sono state segnalate precedentemente. In primo luogo, trapianto allogeneic CD8⁺ linee a cellula T e i cloni sono stati usati per l'identificazione del Qdm¹. In secondo luogo, un motivo di Qa-1-legante presunto dall'analisi di Qdm è stato utilizzato per l'identificazione di HSP60p216-224 e un epitopo TCRBV8.1⁹

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
The protein to be analyzed	N/A	N/A	Sequence of the protein can be obtained from NCBI
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	Cat#: D2650 SIGMA	DMSO should be sterile and cell culture tested.
Kb-/-Db-/- mice	The Lackson Laboratory	Stock#: 019995	We used Taconic H2-KbH2-Db doube knockout mice (Cat#: 4215-F and 4215-M) which however are not available anymore.
AIM V Serum Free Medium	ThermoFisher Scientific	Cat#: 12055091
2-mercaptoethanol	ThermoFisher Scientific	Cat#: 21985023
Sodium pyruvate	ThermoFisher Scientific	Cat#: 11360070
Nonessential Amino Acids	ThermoFisher Scientific	Cat#: 11140076
Dynabeads CD8 Positive Isolation Kit	ThermoFisher Scientific	Cat#: 11333D
Bio-Gel P-100	Bio-Rad	Cat#: 150-4171
Phoshate Balanced Solution (PBS)	ThermoFisher Scientific	Cat#: 20012027
Trasfer pipette	Globe Scientific	Mfg#: 137238
Murine M-CSF	PeproTech	Cat#: 315-02
48-well tissue culture plates	USA Scientific	Cat#: CC7682-7548
Corning Costar TC-treated Multiple well Plates, 96-well, V-shaped bottom	Sigma-Aldrich	Cat#: Z372129 Sigma
1ml deep 06-well PP plate, sterile	USA Scientific	Item#: 1896-1110
Recombinant murine IL-2	PeproTech	Cat#: 212-12
Recombinant murine IL-7	PeproTech	Cat#L: 217-17
Capture anti-IFN-γ antibody	BD Biosciences	Cat#: 551881
ELISPOT plate	Sigma-Aldrich	Cat#: S2EM004M99
C1R	ATCC	Cat#: ATCC CRL-1993
C1R.Qa-1b			Custom made (GenBank access#: NM_010398.3)
Qa-1 lentiviral vector	GeneCopoeia	Product#: Mm02955
Detection anti-IFN-γ antibody	BD Biosciences	Cat#: 551881
Tween20	Sigma-Aldrich	Cat#: P9416
Streptavidin-HRP	BD Biosciences	Cat#: BD557630
AEC substrate	BD Biosciences	Cat#: 551951
ImmunoSpot Analyzer	ImmunoSpot		Any immunoSpot analyer should work for this purpose.