ספריית פפטיד חופפים למפות Epitopes Qa-1 בחלבון

Summary

Qa-1 (הלע-E-אנוש) שייך לקבוצה של מולקולות מורכבות 1b histocompatibility הגדולות-קלאסי. חיסון Qa-1-איגוד epitopes הוכח להגדיל ויסות מערכת החיסון רקמות ספציפיות, דהוא במספר מחלות אוטואימוניות. במסמך זה אנו מתארים את אסטרטגיית ספריית פפטיד חופפים לצורך זיהוי Qa-1 epitopes של חלבון.

Abstract

Qa-1 (הלע-E-אנוש) שייך לקבוצת 1b מורכבים histocompatibility הגדולות-קלאסי מולקולות (MHC-ליברות). נתונים עדכניים מראים כי מולקולות Qa-1 לשחק תפקידים חשובים ב ודיגום תאים עבור ותקינות מבנית תפקודית, ויסות מערכת החיסון וגורם והגבלת תגובות החיסונית זיהומים וירליים. בנוסף, הגדלת פונקציונלי של CD8 Qa-1-מוגבל⁺ T תאים באמצעות epitope התחסנות הראו השפעות טיפוליות במספר מחלות אוטואימוניות בעלי חיים דגמים, למשל ניסיוני אלרגית דלקת המוח וחוט השדרה, קולגן-induced דלקת מפרקים, סוכרת ולא שמנים. לכן, יש צורך דחוף שיטה ביעילות ובמהירות לזיהוי פונקציונלי epitopes Qa-1 בחלבון. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול אשר מנצל CD8 Qa-1-מוגבל⁺ תא T שורות ספציפיות עבור ספריה פפטיד (OLP) חופפים לקביעת Qa-1 epitopes של חלבון. ספריית OLP זו מכילה 15-מר פפטידים חופפים המכסות לכל האורך של חלבון, פפטידים סמוכים חופפים על ידי 11 חומצות אמינו. באמצעות פרוטוקול זה, זיהינו לאחרונה epitope Qa-1 9-מר בגליקופרוטאין אוליגודנדרוציטים מיאלין (ש א). זה epitope ש א Qa-1 ממופה לאחרונה הוצגה לזירוז CD8 ספציפית epitope, Qa-1-מוגבלת⁺ T תאים תקנה המערכת החיסונית משופרת הזה ספציפית מיאלין. לכן, פרוטוקול זה שימושי בעתיד לפתוח בחקירה של הרומן יעדים ופונקציות של CD8 Qa-1-מוגבל⁺ T תאים.

Introduction

Qa-1 שייך לקבוצה של 1b מורכבים histocompatibility הגדולות-קלאסי (MHC-ליברות) מולקולות בעכברים. Homolog האנושי שלה הוא הלע-אי ראיות קודמות הוכיחה כי מולקולות Qa-1 יש תפקודים ביולוגיים חשובים. ראשית, מולקולות Qa-1 משחק תפקיד חשוב ודיגום תאים עבור ותקינות מבנית תפקודית. בהקשר זה, Qa-1 מולקולות התפתחו מספר אסטרטגיות כדי לנטר את התיפקוד הרגיל של תא. אסטרטגיה אחת כזו מאפשרת מולקולות Qa-1 ל קומפלקסי טופס עם מנהיג מעובד פפטיד (epitope), כלומר ה-Qa-1 הקובע צירוף (אותה לא ישכחו במהרה) המעובדים של מולקולות MHC-Ia קלאסית רשתית תוך-פלזמית¹. אלה של Qa-1/אותה לא ישכחו במהרה מתחמי מאוחר יותר להציג על פני השטח של התא, להיקשר לקולטנים NKG2A מעכבות בתאי NK לעכב NK הורג פעילות². אם הביטוי של מולקולות MHC-Ia אובד, תא (למשל תא ממאיר) הופך רגיש NK להרוג^שניים. האסטרטגיה אחרים מאפשר Qa-1 מולקולות להקים מתחמי Qa-1/epitope חדשים על פני התא בנכונותם ברז (טרנספורטר המשויך עיבוד אנטיגן)³ ו/או ERAAP (aminopeptidase רשתית תוך-פלזמית המשויך עיבוד אנטיגן)⁴ (שני ליקויים לעיתים קרובות להתרחש בתאים ממאירים). התא המבטאת אלה מתחמי Qa-1/epitope חדש יכול להיות מזוהה ואז חוסל על ידי epitope ספציפיים CD8 Qa-1-מוגבל⁺ T תאים. שנית, Qa-1 מולקולות זירוז מערכת החיסון תקנה⁵. בהקשר זה, מתחמי Qa-1/epitope הוכחו לעורר CD8⁺ הרגולציה ותאי T (Treg) חשובים למניעת נזקי בתיווך החיסון העצמי-רקמות^{6,7,8 ,9,10}. שלישית, CD8 Qa-1-מוגבל⁺ Treg תאים הוכחו להגביל את תגובות מערכת החיסון נגד זיהום ויראלי¹¹.

לכן, הגדלת ספציפי של CD8 Qa-1-restrictred epitope ספציפי⁺ T תאים היא אסטרטגיה פוטנציאל מבטיח עבור חיסול של תאים חריגים, על השיפור של ויסות מערכת החיסון ועל לפקד על המשמעות של תגובות חיסוניות הנוצרות על-ידי וירוס. בזמן זה טרם נקבע אם תוספת ספציפית epitope CD8 Qa-1-מוגבל⁺ T תאים באפשרותך לשפר את המערכת החיסונית מעקב ולהגביל הנוצרות על-ידי וירוס תגובות חיסוניות, מעבדות שלנו ואחרים בבירור הוכיחו את זה חיסון epitopes Qa-1 יכול להגדיל את הפונקציה של CD8 Qa-1-מוגבל⁺ Treg תאים ספציפיים עבור פתוגניים CD4 אוטואימוניות⁺ T תאים, שמוביל שליטה יעילה של CD4⁺ T תאית מחלות אוטואימוניות ב מגוון רחב של החיות מודלים כגון^6,ניסיוני אלרגית דלקת המוח וחוט השדרה (במודל חיה של טרשת נפוצה אנושי)¹⁰, דלקת מפרקים הנגרמת קולגן (במודל חיה של דלקת מפרקים שגרונית אנושי)⁷, ו סוכרת שאינו שמנים (במודל חיה של האדם סוג 1 סוכרת)⁸. בנוסף, גילינו כי חיסון epitope Qa-1 רקמות ספציפיות מוביל פקד מסוים של דלקת החיסונית בתיווך תפולס דרך הגדלת של CD8⁺ Treg תאים¹². ההצלחות לעיל של מחקרים פרה להצביע על הערכה מלאה התחסנות epitope Qa-1 לטיפול של רקמות ספציפיות בתיווך החיסונית מחלות ואפשרות עבור הטיפול במחלות אחרות המשויכות ליקויים ברז, ERAAP.

בהתאם לכך, יש ביקוש טכנולוגיה ניתן באמינות ובמהירות לנתח Qa-1 epitopes של חלבון. בהקשר זה, תואר מספר מוגבל של epitopes Qa-1 חשוב מבחינה ביולוגית. רוב epitopes Qa-1 אלה זוהו serendipitously במהלך המחקר של CD8⁺ T תא התגובות חיידקים¹³, לקוי ברז³תאים, התאים לקויה ERAAP⁴ותאים הגורמות EAE^{6, 9}. לכן, טכניקה תפוקה גבוהה רצוי לצורך זיהוי ביולוגית חשובה epitopes Qa-1 בחלבון מוגדר. בחלק זה, אנו מתארים את אסטרטגיית ספריית פפטיד (OLP) חופפים הממפה פונקציונלי epitopes Qa-1 בחלבון באמצעות CD8 Qa-1-resrticted⁺ תא T שורות ספציפיות עבור הבריכה OLP (OLP_pool) של חלבון.

Protocol

כל הניסויים נעשו בהתאם, טיפול בעלי חיים מוסדיים ו שימוש בפרוטוקול שאושרו על-ידי חיה אכפת והוועדה שימוש ב אוניברסיטת טקסס El Paso ובאוניברסיטה לומה לינדה.

1. דור של ספריית OLP כיסוי לכל האורך של חלבון

1. עיצוב ספריה OLP שבו כל פפטידים 15-מר אורך הינם פפטידים סמוכים חופפים על ידי 11 חומצות אמינו.
   הערה: במחקר OLP ש א, רצף למבשר ש א [ס. מאסכאלאס] אוחזר ממסד חלבון NCBI דרך לינק זו: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_034944. מבשר ש א (247 חומצות אמינו), אשר הכיל אות וגם פפטידים בוגרת, שימש כי רוב epitopes Qa-1 (הלע-E) שדווח אותרו אות פפטידים (למשל אותה לא ישכחו במהרה¹). החל שלה אמיני, הרצפים של פפטידים 15-מר אותרו כך שני פפטידים סמוכים חפפו ידי חומצות אמינו 11 (איור 1). לפיכך, OLPs 59 בדיוק אותרו בחומצת אמינו 247 ש א מבשר. עם זאת, OLP האחרון יכול לנוע בין 12 עד 15-מר בהתאם לאורך של החלבון. בנוסף, אנו בוחרים ספריית 15-מר כי אנחנו ואחרים הראו כי 15-מר פפטידים, בעת הוספת תאים דנדריטים (Dc) או מקרופאגים, יכול להיות יעיל מעובד epitopes להכרה על ידי CD8⁺ T תאים^14,15 .
2. לרכוש כל פפטיד בודדים מסחרית. 5 מ"ג לכל פפטיד צריך להיות מספיק להקרנה. OLPs קטום פפטידים (6.1 שלב) יכול להיות desalted פפטידים (טוהר הוא כ- 50-70%). הטוהר של פפטיד אופטימלית (שלב 6.2) ייעשה שימוש עבור הדור של tetramer, שניתוח ביולוגי צריך להיות > 90%. לשקם את פפטידים בתנאי סטרילי.
3. להפוך 50 מ"ג/מ"ל מניות בודדות פפטיד דימתיל סולפוקסיד 100%. עבור 5 מ"ג של כל פפטיד, להוסיף 100 μL של דימתיל סולפוקסיד לתוך כל שפופרת, לערבב, ולאחסן את פפטידים ב-20 ° C. מניות אלה ישמש כדי להפוך את המניות של OLP_pool עבור הדור של CD8⁺ תא T קווים תגובתי ל OLP_pool. בנוסף, מניות אלה יהיו אף הן בשימוש כדי להפוך 10 מ"ג/מ"ל מניות בודדות פפטיד בקביעת היכולת של כל פפטיד בודדים כדי לעורר תגובה Qa-1-מוגבלת ב- CD8 תגובתי OLP_pool⁺ תא T קו.
4. יצירת מלאי OLP_pool על-ידי הוספת אמצעי שווה של כל פפטיד לתוך צינור טריים. מלאי OLP_pool זה מכיל דימתיל סולפוקסיד 100%. במחקר OLP ש א, היו 59 OLPs¹² לכן, ריכוז של כל פפטיד ב OLP_pool היה 847.46 μg/mL (50 מ"ג/מ"ל ÷ 59).
5. להפוך את 10 מ"ג/מ"ל מניות פפטיד בודדים על-ידי המדללת (x 5) המניה 50 מ"ג/מ"ל סטרילי H₂O בצלחת התחתונה V 96-ובכן (מלאי זה מכיל 20% דימתיל סולפוקסיד). להפוך את המניות האלה צלחת 96-ובכן כי הקביעה של התגובה Qa-1-מוגבלת של כל פפטיד בודדים יבוצעו בצלחת 96-ובכן באמצעות פיפטה רב-ערוצי של 8 או 12-ערוץ.
   הערה: כל פפטידים, כולל OLPs ופפטידים קטום, יש לדלל בצלחת או V-התחתון 96-ובכן או ארון מדגם 96-ובכן מלא עם צינורות 1 מ"ל מאז ההקרנה ספריית פפטיד מתבצע ב 96-ובכן צלחות באמצעות פיפטה רב-ערוצי. אם קשה לדלל פפטיד, להוסיף טיפה N NaOH 1 חכם לעזור לפזר את פפטיד.

2. לקרקע של K^b-/- D^b-/- CD8⁺ תאי T עם K פעמו OLP_pool^b-/- D^b-/- תאים דנדריטים (Dc).

הערה: ישנם שני אללים Qa-1 העיקריים: אחת היא Qa-1, והשני הוא Qa-1^b. מאז בעלי החיים הנפוץ עבור מחקר אקדמי, למשל C57BL/6 ועכברים Balb/c, לשאת Qa-1^b, פרוטוקול זה מתאר את ההליך עבור מיפוי Qa-1^b epitopes של חלבון. CD8⁺ T תאים המשמשים פרוטוקול זה כבר טהור מ K^b-/-D^b-/- עכברים (רקע C57BL/6) ב- CD8 אילו⁺ T תאים מוגבלים בעיקר על ידי מולקולות MHC-ליברות-קלאסי כולל Qa-1.

1. לייצר DCs הנגזרות מח עצם כמו שתואר לעיל¹².
   1. בקצרה, תרבות מח עצם תא בודד המתלים (1 x 10⁶ תאים/mL) RPMI-10 בינוני (RPMI 1640 בתוספת 10% סרום שור עוברית, 5.5 x 10^-5 מ' מרקפטואתנול 1 מ"מ נתרן פירובט, חומצת אמינו שאינן חיוניות 0.1 מ מ) המכילה 10 U/mL IL-4 ו- 100 U/mL GM-CSF בצלחת 6-טוב (4 מ ל/טוב) ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂.
   2. יומיים לאחר מכן, להסיר תאים שאינם מחסידי היטב ולהוסיף מדיה טריים ציטוקינים.
   3. לאחר culturing התאים ביומיים, העברה שאינם מחסידי תאים המכילים ציטוקינים ומדיה חדשה לתוך צלחת 6-באר חדשה.
   4. התרבות התאים ביומיים, מתחדש עם ציטוקינים המכיל LPS ומדיה טריים (0.1 µg/mL) כדי להפעיל את בקרי התחום.
   5. 24 שעות לאחר מכן, לאסוף Dc לניסויים.
2. . להאיר את בקרי התחום עם 3000 ראד...
   1. לחלופין, מתייחסים Dc (5 x 10⁷ תא/mL) עם מיטומיצין C (50 μg/מ"ל) ב- PBS ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דק להוסיף RPMI-0 (RPMI 1640 ללא סרום) כדי למלא את הצינור (~ 12 mL), לסובב את התאים עבור 10 דקות ומפרידה שולחני 300 ג' להשליך supernatants ו- repea t ההליך כביסה עוד פעמיים. אלה שלושה שוטף הן קריטיות כי כל הסכום שמץ של מיטומיצין C עלול לעכב את התגובה של CD8⁺ T תאים במהלך התרבות שיתוף של התא DC-T.
3. התאם את הריכוז DC ל 5 x 10⁶ תאים למ"ל במדיום נטול סרום (AIM-V ללא סרום בינוני בתוספת 5.5 x 10^-5 מ' מרקפטואתנול 1 מ"מ נתרן פירובט, חומצת אמינו שאינן חיוניות 0.1 מ מ).
4. הוסף את הפתרון מניות OLP_pool, אשר מכיל 100% דימתיל סולפוקסיד, אוגי כזה ריכוז דימתיל סולפוקסיד הסופי יהיה 0.5% (200 x). במחקר OLP ש א, היה הריכוז של כל OLP, OLP_pool 847.46 μg/mL; לכן הריכוז הסופי של כל OLP בתרבות DC היה 4.2 μg/mL (847.46 μg/mL ÷ 200).

עם זאת, וניתן לשנותם הריכוז הזה עד 100 μg/mL כל עוד הריכוז דימתיל סולפוקסיד בתרבות תא נשאר פחות מ 1%.

דגירה Dc בטמפרטורת החדר במשך 3 שעות, לנער את התאים בעדינות כל 15 דקות.

במהלך תקופת הדגירה לטהר CD8⁺ T תאים מן הטחול שנקטפו או הלימפה של K^b-/-D^b-/- עכברים באמצעות CD8 מסחרי של⁺ T תא ערכת טיהור, להתאים את הריכוז תא ל 10 x 10⁶ תאים/מ ל המדיום ללא סרום המכיל U/mL 50 אינטרלוקין 2 (il-2) ו- U/mL 100 של IL-7.

כעת, הוסף את CD8⁺ T תאים לתוך צלחת 48-טוב כמו 0.5 mL/טוב (לאחר התוספת של 0.5 mL/טוב של בקרי התחום פעמו OLP_pool ב שלב 2.8, הריכוז הסופי של CD8⁺ T תאים יהיה 5 x 10⁶ תאים/מ ל...).
הערה: CD8⁺ T תאים מן העכבר הטחול ובלוטות הלימפה יכול להיטהר באמצעות ערכת בידוד חיובי CD8 על-ידי ביצוע ההוראה המסופקים על ידי היצרן. CD8⁺ T תאים שהושג חופשיים של חרוזים.

ספין למטה פעמו OLP_pool Dc (x 300 גרם, 10 דקות)-RT. לשקם Dc פעמו OLP_pool 2 x 10⁶ תאים/מ ל מדיום נטול סרום ולהוסיף 0.5 mL/טוב המשקולת 48-ובכן המכיל את CD8⁺ T תאים (הריכוז הסופי של OLP DCs פעמו _pool הוא עונה 1 פרק 10⁶ תאים למ"ל, הריכוז הסופי של CD8⁺ T תאים הוא 5 x 10⁶ תאים למ"ל, הריכוז הסופי של il-2 הוא 25 U/mL והריכוז הסופי של IL-7 הוא 50 U/mL). התרבות התאים-CO 37 ° C ו-5%₂.

יום 4, להסיר, למחוק כ-400 μL של המדיום תרבות ולהוסיף 500 μL של המדיום ללא סרום טריים המכילים 100 U/mL il-2 ו- 100U/mL של IL-7 כדי מכל קידוח. דגירה התאים-CO 37 ° C ו-5%₂.

ביום 7 או 8, לעורר מחדש את CD8 OLP_pool-איפה זה מונח⁺ T תאים עם OLP_pool.

3. לרסטימולציה של CD8 להתקפת⁺ T תאים מקרופאגים פעמו עם OLP_pool

1. ארבעה ימים לפני גירוי מחדש של CD8 טענתי OLP_pool⁺ T תאים, להכין 2% (v/v) לזיהוי חרוז פתרון: לשטוף 2 גר' לזיהוי חרוזים פעמיים ב- 20 mL ללא אנדוטוקסין H₂O או PBS. גלולה את החרוזים לזיהוי על ידי צנטריפוגה (400 x גרם) במשך 5 דקות, resuspend ב 100 מ של PBS. אוטוקלב-15 ליברות/m עבור 20 דקות החנות בטמפרטורת החדר.
2. מזריקים עכברים intraperitoneally 1 mL/עכבר של הפתרון חרוז לזיהוי 2% סטרילי כדי למשוך את ההעברה של monocytes/מקרופאגים חלל הצפק ה-¹⁶.
3. ארבעה ימים לאחר מכן, להקריב את החיות כתוצאה ממנת יתר של₂ CO.
   1. תחת תנאים סטריליים, לחתוך פתיחה קטנה במרכז הבטן כך הפתיחה הוא מספיק על העברת פיפטה העברה של 5 מ"ל. למלא את פיפטה העברה עם RPMI-0 והכנס את פיפטה לתוך חלל הבטן דרך הפתח.
   2. יש לשטוף את חלל הבטן על ידי pipetting. פיפטה החוצה כמה שיותר נוזלים ככל האפשר מתוך חלל הבטן לתוך צינור סטרילי (אלו מקרופאגים הצפק). חזור על השלב שטיפה 4 - 5 פעמים.
4. . להאיר את המקרופאגים הצפק עם 3000 ראד...
   1. לחלופין, פנקו את המקרופאגים הצפק עם מיטומיצין C (בצע ההליך המתואר בסעיף 2.2 שלב).
5. התאם את ריכוז מקרופאגים הצפק 5 x 10⁶ תאים/מ ל מדיום נטול סרום. הוסף מלאי OLP_pool (ריכוז דימתיל סולפוקסיד הסופי הוא פחות מ 1%) ו- M-CSF (ריכוז סופי = 100 U/mL).
   הערה: במחקר זה ש א OLP ', השתמשנו דימתיל סולפוקסיד 0.5%. לפיכך, ש א OLP_pool המניה היה מדולל 200 x (למשל 1 μL של OLP_Pool ש א מניות נוספה לתוך 199 μL של מקרופאגים הצפק). לפיכך, הריכוז הסופי של כל OLP היה 4.2 μg/mL).
6. הוסף μL 200 / (1 x 10⁶ תאים/טוב) טוב בצלחת תרביות רקמה 48-ובכן, דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות.
7. הסר את התאים שאינם מחסידי וחרוזים לזיהוי על ידי שטיפה עדין עם μL 200/טוב של ומחוממת מראש RPMI-0.
8. לאסוף ובריכת OLP_pool טענתי CD8⁺ T תאים מ- 2.10 שלב. להתאים OLP_pool בשלה CD8⁺ תא T ריכוז עונה 1 פרק 10⁶ תאים למ"ל במדיום נטול סרום המכיל 25 U/mL il-2 ו- 50 U/mL של IL-7. להוסיף 1 mL/היטב הצלחת 48-ובכן זה מכיל מקרופאגים הצפק פעמו OLP_pool.
9. כעבור ארבעה ימים לחדש המדיום בצלחת 48-. טוב. להסיר ולמחוק כ-400 μL של המדיום תרבות לוחית התרבות 48-. טוב. להוסיף 500 μL של טרי בינוני ללא סרום המכיל 100 U/mL il-2 ו- U/mL 100 של IL-7 כל טוב. התרבות התאים-CO 37 ° C ו-5%₂.
10. שלושה או ארבעה ימים מאוחר יותר, לבחון את CD8 לרסטימולציה OLP_pool⁺ T תאים עבור תגובה ספציפית OLP_pool, Qa-1-מוגבלת על ידי assay מקושרים-אנזים immunospot (ELISPOT). לאחר הנקודה הזו מחדש להמריץ את CD8⁺ T תאים כל 7-10 ימים.
    הערה: המקרופאגים עדיפים גירוי מחדש של CD8 טענתי OLP_pool⁺ T תאים. שמנו לב CD8⁺ T תאים מחדש מגורה על ידי מקרופאג גדל יותר DCs בתוך חוץ גופית.

4. קביעת OLP_pool ספציפיים, התגובה Qa-1-מוגבלת CD8 לרסטימולציה OLP_pool⁺ תא T קו

הערה: תגובה ספציפית OLP_pool, Qa-1-מוגבלת CD8 לרסטימולציה OLP_pool⁺ תא T קו נקבעת על-ידי הפרשת IFNγ בעקבות גירוי OLP_pool בנוכחות C1R או C1R. Qa-1^b תאים באמצעות וזמינותו של IFNγ ELISPOT. תאים C1R ניתן להשיג באופן מסחרי. C1R. Qa-1^b תאים יכולים להיווצר על-ידי transducing תאי C1R עם וקטור lentiviral Qa-1.

1. להוסיף 100 μL/טוב של נוגדן anti-IFN-γ לכידת מדולל במאגר ציפוי (PBS) הבארות של צלחת ELISPOT.

חותם, דגירה את הצלחת ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

ביום השני, לבטל את המאגר ציפוי המכיל נוגדן anti-IFN-γ לכידת להוסיף 200 μL/היטב-blocking פתרון (ללא סרום בינוני), דגירה את הצלחת. בשביל 2 h בטמפרטורת החדר.

להאיר את C1R ואת C1R. Qa-1^b תאים עם 9,600 ראד.

1. לחלופין, לפנק את C1R ואת C1R. Qa-1^b תאים עם מיטומיצין C כפי שמתואר על 2.2 שלב חוץ מזה זמן הטיפול יהיה 30 דקות.

להתאים את C1R ואת C1R. Qa-1^b תאים במדיום נטול סרום 4 x 10⁶ תאים/מ.

למחוק את הפתרון חסימה בצלחת ומוסיפים את C1R ואת C1R. תאים Qa-1^b -50 μL/טוב (200,000 התאים היטב), לערבב.

מוסיפים μL 50/טוב של 100 x מדולל OLP_pool מניות (של המדיום ללא סרום) ומערבבים היטב. דגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 2-3 h.

התאם את CD8 לרסטימולציה OLP_pool⁺ T תאים 1-2 x 10⁶ תאים למ"ל במדיום נטול סרום המכיל 150 U/mL של IL-7 ולהוסיף μL 50/טוב (50,000-100,000 תאים/טוב) לצלחת. Centrifuge את הצלחת (58 x g) במשך 5 דקות.

דגירה לצלחת-CO של 37 ° C ו- 5%-₂ בלילה.

האחות תא ההשעיה. רחץ בארות 2 פעמים עם מים (DI) יונים (250 μL טוב). לאפשר בארות כדי משרים למשך 5 דקות בכל שלב שטיפה.

תשטוף בארות 3 פעמים עם מאגר לשטוף אני (PBS המכילה 0.05% Tween20). לאפשר בארות להשריה עבור 1 דקות בכל שלב שטיפה. מאגר השטיפה השלך.

להוסיף 100 μL של זיהוי נוגדנים מדולל במאגר דילול (PBS המכיל 10% סרום שור עוברית (FBS)).

דגירה הלוחות בטמפרטורת החדר במשך שעתיים.

לבטל את זיהוי נוגדנים פתרון. רחץ בארות 3 פעמים עם 250 µL/טוב לשטוף את מאגר א לאפשר וולס להשריה עבור 1 דקות בכל שלב שטיפה.

להוסיף 100 μL/טוב של אנזים המספר המשלים (Streptavidin-HRP) מדולל במאגר דילול-מטריים דילול.

דגירה הלוחות לשעה בטמפרטורת החדר.

למחוק פתרון תרכיב אנזים. רחץ בארות 4 פעמים עם 250 µL/טוב לשטוף את מאגר א לאפשר וולס להשריה עבור 1 דקות בכל שלב שטיפה.

רחץ בארות 2 פעמים עם µL 250/II מאגר לשטוף (PBS) טוב.

להוסיף 100 µL של פתרון המצע (לערבב טיפה 1 = 20 µL של AEC Chromogen עם 1 מ"ל של מצע AEC) כל טוב. לפקח על פיתוח ספוט למשך 5 עד 60 דקות.

כאשר התוצאות הרצויות מתחילים להופיע, להפסיק את התגובה המצע ע י שטיפת וולס עם מים מזוקקים.

מילה נהדרת הלוחות בטמפרטורת החדר במשך שעתיים או למשך הלילה עד שהכל יבש לחלוטין. הסרה של מגש פלסטיק תחת לוחיות הרישוי יקל על ייבוש. חנות צלחות בשקית ניילון אטומה בחושך עד זה ניתוח.

לספור נקודות באופן ידני על-ידי בדיקת במיקרוסקופ ויבתר או שימוש בקורא צלחת ELISPOT. לראות את התוצאה נציג באיור2.

5. קביעת פפטידים OLP_pool הפרט אשר לעורר את הפרשת IFN-γ מוגבלת Qa-1 ב- CD8 OLP_pool ספציפיים⁺ קו תא T

1. לקבוע את פפטידים בודדים כי לעורר את ספציפי OLP_pool, הפרשת IFN Qa-1-restrictred-γ ב- CD8 OLP_pool הספציפיים⁺ קו תא T באמצעות לעיל תיאר IFN-γ ELISPOT assay (הריכוז הסופי של כל פפטיד בודדים בשימוש ELISOPT assay היא μg/מ"ל). ראה תוצאות נציג באיור3.
   הערה: ספציפי OLP, Qa-1-restircted תגובה מוגדרת כתגובה זה לפחות שלוש פעמים של התגובה בנוכחות C1R. Qa-1^b תאים אבל בלי את OLP. מחקר ש א OLP, OLP68, OLP96 ו OLP105 כל הקריטריונים הללו. לכן, כל OLPs שלוש העלולים להכיל Qa-1 epitopes¹² (איור 3). עם זאת, OLP105 בעקביות התפללתי התגובה החזקה; לפיכך ביצענו ניתוח מפורט של OLP105 (איור 4 , איור 5)¹².

6. זיהוי של Epitope Qa-1 אופטימלי ב- OLP 15-מר אשר מעוררת את התגובה Epitope ספציפיים, Qa-1-מוגבלת CD8 ספציפי OLP_pool⁺ קו תא T

1. לסנתז C - ו N-סופני נחתך פפטידים של OLP 15-mer כפי שמוצג באיור4.
2. לבחון את הפרשת IFN-γ ב CD8 ספציפי OLP⁺ תא T קו על ידי גירוי של CD8⁺ T תאים עם כל אחד של פפטידים קטום, כמו גם את OLP 15 הורים-מר בנוכחות C1R או C1R. Qa-1^b תאים באמצעות לעיל תיאר assay IFN-γ ELISPOT. הריכוז הסופי של כל פפטיד בודדים המשמשים את הבדיקה ELISPOT היא μg/מ"ל. פפטיד מוגדר של האופטימלית epitope Qa-1 אם פפטיד: 1) בעקביות נותן תגובה IFN-γ דומים או חזקה יותר, לעומת 15-מר פפטיד המקורי, בנוכחות C1R. Qa-1^b תאים; 2) הוא בין 8 - 10-mer (פפטיד 9-מר העדיף) אשר הם המרחק פפטיד מאוגדים MHC-אני מולקולות^15,17. ראה התוצאות נציג באיור5.

תוצאות

העיצוב של ספריית OLP כיסוי לכל האורך של חלבון

החל קצה אמיני של חלבון, כל פפטיד הוא 15 חומצות אמינו (15-mer). לפיכך, פפטיד הראשון מתפרשת על עמדה 1 לעמדה 15. N-הסופית של פפטיד השני חופף קצה קרבוקסילי של פפטיד הראשון החומצה אמינית 11. לפיכך, פפטיד השני מתפ?...

Discussion

. הנה, תארנו פרוטוקול לניתוח Qa-1 epitopes של חלבון. ביחס פרוטוקול זה, מספר אסטרטגיות אחרות גם דווחו בעבר. ראשית, allogeneic CD8⁺ תא T קווים שיבוטים שימשו לצורך זיהוי ה¹-אותה לא ישכחו במהרה. שנית, מוטיב Qa-1-איגוד בשם מניתוח המצב אותה לא ישכחו במהרה שימש לצורך הזיהוי של HSP60p216-224,⁹

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
The protein to be analyzed	N/A	N/A	Sequence of the protein can be obtained from NCBI
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	Cat#: D2650 SIGMA	DMSO should be sterile and cell culture tested.
Kb-/-Db-/- mice	The Lackson Laboratory	Stock#: 019995	We used Taconic H2-KbH2-Db doube knockout mice (Cat#: 4215-F and 4215-M) which however are not available anymore.
AIM V Serum Free Medium	ThermoFisher Scientific	Cat#: 12055091
2-mercaptoethanol	ThermoFisher Scientific	Cat#: 21985023
Sodium pyruvate	ThermoFisher Scientific	Cat#: 11360070
Nonessential Amino Acids	ThermoFisher Scientific	Cat#: 11140076
Dynabeads CD8 Positive Isolation Kit	ThermoFisher Scientific	Cat#: 11333D
Bio-Gel P-100	Bio-Rad	Cat#: 150-4171
Phoshate Balanced Solution (PBS)	ThermoFisher Scientific	Cat#: 20012027
Trasfer pipette	Globe Scientific	Mfg#: 137238
Murine M-CSF	PeproTech	Cat#: 315-02
48-well tissue culture plates	USA Scientific	Cat#: CC7682-7548
Corning Costar TC-treated Multiple well Plates, 96-well, V-shaped bottom	Sigma-Aldrich	Cat#: Z372129 Sigma
1ml deep 06-well PP plate, sterile	USA Scientific	Item#: 1896-1110
Recombinant murine IL-2	PeproTech	Cat#: 212-12
Recombinant murine IL-7	PeproTech	Cat#L: 217-17
Capture anti-IFN-γ antibody	BD Biosciences	Cat#: 551881
ELISPOT plate	Sigma-Aldrich	Cat#: S2EM004M99
C1R	ATCC	Cat#: ATCC CRL-1993
C1R.Qa-1b			Custom made (GenBank access#: NM_010398.3)
Qa-1 lentiviral vector	GeneCopoeia	Product#: Mm02955
Detection anti-IFN-γ antibody	BD Biosciences	Cat#: 551881
Tween20	Sigma-Aldrich	Cat#: P9416
Streptavidin-HRP	BD Biosciences	Cat#: BD557630
AEC substrate	BD Biosciences	Cat#: 551951
ImmunoSpot Analyzer	ImmunoSpot		Any immunoSpot analyer should work for this purpose.