蛋白質の Qa 1 エピトープをマップするペプチド ライブラリを重複

要約

Qa-1 (人間の HLA E) は、クラシック以外の主要な組織適合性の複雑な 1 b 分子のグループに属しています。Qa-1 結合エピトープと予防接種はティッシュ特定の免疫制御が強化され、いくつかの自己免疫疾患を改善するのに示されています。本蛋白質の Qa 1 エピトープの同定のため重複のペプチド ライブラリ戦略について述べる。

要約

Qa-1 (人間の HLA E) は、(MHC Ib) 分子をクラシック以外の主要な組織適合性の複雑な 1 b グループに属する。最近のデータでは、Qa 1 分子が細胞の構造と機能の整合性を調査、免疫調節の誘導、ウイルス感染に対する免疫応答を制限することにおいて重要な役割を果たすことを示唆しています。また、CD8 の Qa 1 制限の機能増強⁺ T 細胞エピトープを通じて予防接種がいくつかの自己免疫疾患動物モデル、例えば実験的アレルギー性脳脊髄炎、治療効果を示しています。コラーゲン誘発関節炎と非肥満の糖尿病。したがって、蛋白質の機能性 Qa 1 エピトープを効率的かつ迅速に識別できる方法のための緊急の必要性があります。ここでは、CD8 の Qa 1 制限を利用するプロトコルについて述べる⁺ T 細胞の蛋白質の Qa 1 エピトープを決定するための重複のペプチド (OLP) ライブラリの特定行。この OLP ライブラリを含む 15 mer 重複するペプチド、蛋白質の全体の長さをカバーする、11 のアミノ酸によって隣接するペプチドを重ねます。このプロトコルを使用して、我々 は最近ミエリン オリゴデンドロ サイト糖タンパク質 (モグ) 9 mer Qa 1 エピトープを識別しました。この新しくマップされたモグ Qa 1 エピトープはエピトープ固有の Qa 1 制限 CD8 を誘導するために示された⁺ T 細胞その強化されたミエリン特異免疫調節。したがって、このプロトコルは、将来における新たな標的と CD8 の Qa 1 制限の機能に便利⁺ T 細胞。

概要

Qa 1 はマウス (MHC Ib) 分子非古典的な主要な組織適合性の複雑な 1 b のグループに属しています。その人間の相同物 HLA-E のです。証拠はこれまでは、Qa 1 分子が生体の重要な機能であることを示しています。まず、Qa 1 分子構造と機能の整合性のための細胞の調査で重要な役割を果たします。この点、Qa 1 分子は、細胞の正常な機能を監視するいくつかの戦略を進化してきました。このような戦略の 1 つは、Qa 1 分子加工のリーダー ペプチド (エピトープ)、すなわちQa 1 決定修飾子 (Qdm) 小胞体¹古典的 MHC Ia 分子から処理されると錯形成できます。これら後の Qa-1/Qdm の複合体は細胞の表面に表示され、アクティビティ²を殺す NK を抑制する NK 細胞の抑制性 NKG2A 受容体にバインドします。Ia MHC 分子の発現が失われた場合 (例えば悪性細胞) は²を殺す NK に敏感になります。その他の方法により、タップ (抗原処理に関連付けられているトランスポーター) に欠けている細胞の表面の新しい Qa 1/抗原複合体を形成する Qa 1 分子³および/または ERAAP (小胞体アミノペプチダーゼに関連付けられています。抗原処理)⁴ (両方の欠陥はしばしば悪性細胞に発生します)。これらの新しい Qa 1/抗原複合体を表現する細胞認識およびエピトープ特異 CD8 の Qa 1 制限によって除去できる⁺ T 細胞。第二に、Qa 1 分子免疫制御⁵を誘発します。この点、Qa 1/抗原複合体は、CD8 を刺激するために示されている⁺自己組織^{6,7,8 の免疫介在性損傷の防止にとって重要な細胞 (Treg) T、9,10}。第三に、Qa 1 制限 CD8⁺ Treg 細胞はウイルス感染¹¹に対する免疫応答を制限する示されています。

したがって、エピトープ特異 Qa 1 点 CD8 の特定豊胸⁺ T 細胞は異常細胞の排除、免疫制御の強化との大きさの制御可能性のある有望な戦略ウイルスによる免疫応答。一方、それかどうか決定されていない豊胸エピトープ特異 CD8 の Qa 1 制限の⁺ T 細胞は免疫監視を強化でき、ウイルスによる免疫応答を制限、研究所施設、その他ことが明らかQa 1 エピトープと予防接種は CD8 の Qa 1 制限の機能を増やすことが⁺ Treg 細胞病原性自己免疫性 cd4 陽性の特定⁺ T 細胞、CD4 の効率的な管理に至る⁺で T 細胞による自己免疫疾患、さまざまな動物モデルの実験的アレルギー性脳脊髄炎 (人間多発性硬化症の動物モデル)^6,10、コラーゲン誘導関節炎 (ひと関節リウマチの動物モデル)⁷などと非肥満の糖尿病 (ヒト 1 型糖尿病の動物モデル)⁸。さらに、我々 は免疫組織固有の Qa 1 エピトープが CD8 の増強によってその組織の免疫炎症の特定のコントロールにつながることを発見した⁺ Treg 細胞¹²。前臨床試験の上記の成功が Qa 1 エピトープ免疫組織特異免疫介在性疾患の治療のため、潜在的タップの欠陥に関連付けられている他の疾患の治療のための完全な評価の必要性を示すとERAAP。

したがって、蛋白質の Qa 1 エピトープを確実かつ迅速に分析できる技術の需要があります。この点では、生物学的に重要な Qa 1 エピトープの限られた数が記載されています。これら Qa 1 エピトープのほとんどは CD8 の研究中に偶然に識別された⁺ T 細胞の反応惹起^{6、原因になるセル セル ERAAP4、欠損、タップ3欠損細胞細菌13 9}。したがって、高スループット方法が定義されたタンパク質の生物学的に重要な Qa 1 エピトープの同定のため望ましいです。以下では、マップを使用して Qa 1 resrticted CD8 蛋白質の機能性 Qa 1 エピトープ重複のペプチド (OLP) ライブラリ戦略について述べる⁺ T 細胞ライン OLP プール (OLP_pool) 蛋白質のために特定します。

プロトコル

すべての実験は、機関動物愛護と動物の世話とテキサス大学エル ・ パソとロマリンダ大学で利用委員会によって承認プロトコルを使用に準拠して行われました。

1. タンパク質の全体の長さをカバー OLP ライブラリの生成

1. すべてのペプチドが、長さ 15 mer でその後隣接するペプチドを重複 11 アミノ酸 OLP ライブラリを設計します。
   注: モグ OLP 研究でモグ前駆体 [ハツカネズミ] のシーケンスから取得された NCBI タンパク質データベースこのリンクに従うことによって: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_034944。報告された Qa 1 (e) HLA 抗原のほとんどが信号ペプチド (例えば Qdm¹) に位置していたために、信号と成熟したペプチドを含んだモグ前駆体 (247 アミノ酸) が使用されました。その N 末端から始まる、15 mer ペプチドの配列された 11 アミノ酸 (図 1) によって 2 つの隣接するペプチドがオーバー ラップするように識別されます。したがって、まさに 59 OLPs は MOG の 247 のアミノ酸前駆体で識別されました。一方、最後の OLP 12 蛋白質の長さに応じて 15 mer に範囲することができます。私たちと他の人は 15 mer ペプチド, マクロファージ, 樹状細胞 (Dc) に追加されたときが効率的にすることができます示されているので 15 mer ライブラリの選択また、CD8 による認識エピトープへの処理⁺ T 細胞^14,15.
2. 商業それぞれの個々 のペプチドを購入します。ペプチドあたり 5 mg はスクリーニングのために十分にする必要があります。OLPs と切り捨てられたペプチド (ステップ 6.1) は、脱塩ペプチド (純度は約 50-70%) をすることができます。四量体の生成と将来の生物学的分析のために使用する最適なペプチド (ステップ 6.2) の純度をする必要があります > 90%。無菌条件下でペプチドを再構成します。
3. 100 %dmso で 50 mg/mL の個々 のペプチドの株を作る。各チューブに DMSO の 100 μ L ミックス、および-20 ° C でペプチドを格納、各ペプチドの 5 mg を追加これらの株式は、CD8 の世代のための OLP_pool ストックを作るに使用される⁺ T 細胞ライン、OLP_pool に反応。さらに、これらの株式は 10 mg/mL を個々 のペプチド株式 OLP_pool 反応性 CD8 の Qa 1 制限の応答を刺激するためにそれぞれの個々 のペプチドの機能を決定するためにも使用する⁺ T 細胞。
4. 新鮮な管に各ペプチドの等しい量を追加することにより作る OLP_pool ストック。この OLP_pool 株式には 100 %dmso が含まれます。モグ OLP 研究 59 OLPs¹²があった。したがって、各ペプチド、OLP_pool の濃度は、847.46 μ g/mL (50 mg/mL ÷ 59) でした。
5. 希釈 (5 x) 10 mg/mL の個々 のペプチドの株を作る 50 mg/mL 滅菌 H₂O (この株式は、20 %dmso を含んでいる) V 下 96年ウェル プレートで入荷。8 または 12 チャネル マルチ チャンネル ピペットを使用して 96 ウェル プレートでそれぞれの個々 のペプチドの Qa 1 制限応答の決定を実行するため、これらの株式を 96 ウェル プレートで作る。
   注: OLPs と切り捨てられたペプチドを含むすべてのペプチドはどちらか V 下 96年ウェル プレートで薄めるべきまたは 96 ウェル サンプル ラック充填 1 mL 管ペプチド ライブラリ スクリーニングがマルチ チャンネル ピペットを使用して 96 ウェル プレートで行われるので.場合は、ペプチドを希釈、ペプチドを溶解するために賢明な 1 N 水酸化ナトリウム滴を追加することは困難です。

2 K のプライミング^b-/- D^b-/- CD8⁺ OLP_pool パルス K と T 細胞^b-/- D^b-/-樹状細胞 (Dc)。

注: 2 つの主要な Qa 1 の対立遺伝子がある: Qa 1、1 つは、他の Qa 1^bです。一般的にアカデミックな研究に使用される動物、例えばC57BL/6 および Balb/c マウスを運ぶ Qa 1^b、このプロトコルは蛋白質のマッピング Qa 1^bエピトープの手順を説明します。CD8⁺ T このプロトコルでセルは K から浄化される^b-/-D^b-/-マウス (C57BL/6 背景) が CD8⁺ T 細胞は主に Qa 1 を含む非古典的 MHC Ib 分子によって制限されています。

1. 上記¹²として骨髄由来の Dc を生成します。
   1. 簡単に言えば、RPMI 10 媒体 (10% 牛胎児血清 5.5 x 10^-5 M 2-メルカプトエタノール、ピルビン酸ナトリウム 1 mM、0.1 mM 非必須アミノ酸添加 RPMI 1640) 骨髄単一細胞懸濁液 (1 x 10 の⁶セル/mL) の文化します。10 U/mL il-4, 100 U/mL 37 ° c、5% CO₂6 ウェル プレート (4 mL/ウェル) に GM-CSF を含みます。
   2. 2 日後は、慎重に非付着性のセルを削除し、新鮮なメディアとサイトカインを追加します。
   3. 別の 2 日間、細胞を培養後、新しい 6 ウェル プレートに新鮮なメディアとサイトカインを含む非付着性のセルを転送します。
   4. 別の 2 日間、細胞の培養し、新鮮なメディアと LP を含むサイトカインを補充 (0.1 μ g/mL) Dc をアクティブにします。
   5. 24 h 後、実験のため Dc を収集します。
2. 3000 ラドと Dc を照射します。
   1. また、マイトマイシン C と Dc (5 x 10⁷セル/mL) の治療 (50 μ g/mL) 20 分の 37 ° C で PBS でチューブ (〜 12 mL) を記入し、g. 破棄清と repea x 300 でテーブル トップ遠心分離機で 10 分のセルをスピン RPMI-0 (血清なし RPMI 1640 年) を追加t 2 回以上洗浄方法。これらの 3 つの洗浄に欠かせない⁺ T 細胞 DC T 細胞共培養中にマイトマイシン C の任意のトレース量が cd8 陽性の反応を抑制するため。
3. 5 x 10⁶セル/ml 無血清培地 (目的 V 無血清培 10^-5 M 2-メルカプトエタノール、ピルビン酸ナトリウム 1 mM、0.1 mM 非必須アミノ酸 x 5.5) に DC の濃度を調整します。
4. Dc への 100 %dmso が含まれており最終の DMSO 濃度は 0.5% (200 x) になります OLP_pool 原液を追加します。モグ OLP 研究で、OLP_pool 各 OLP の濃度は 847.46 μ g/ミリリットルです。したがって DC 文化各 OLP の最終濃度 4.2 μ g/mL (847.46 μ g/mL ÷ 200) であった。

しかし、細胞培養の DMSO 濃度 1% 未満の残っている限りこの濃度を 100 μ g/mL まで拡張できます。

Dc 3 時間室温で孵化させなさい、優しく 15 分毎にセルを振る。

この潜伏期間中に浄化 CD8⁺ T 細胞収穫脾臓または K のリンパ節から^b-/-D^b-/-商業 CD8 を用いたマウス⁺ T 細胞の精製キット、10 x 10⁶セル/ml に細胞濃度を調整50 U/mL のインターロイキン 2 (IL-2) と IL-7 の 100 U/mL を含む無血清培。

今、CD8 を追加 0.5 mL/井戸として 48 ウェル プレートに⁺ T 細胞 (0.5 mL/ステップ 2.8、CD8 の最終的な集中で OLP_pool パルス Dc の付加の後で⁺ T 細胞は 5 x 10⁶セル/mL になります)。
注: CD8⁺ T、製造元から提供された指示に従って、CD8 陽性分離キットを使用してマウス脾臓およびリンパ節細胞を浄化することが。CD8⁺ T 細胞はビーズの無料。

スピン ・ ダウンした再構成で OLP_pool パルス Dc (300 × g, 10 分) 2 x 10⁶セル/ml 無血清培地に OLP_pool パルス Dc と CD8 を含む 48 ウェル プレートに 0.5 mL/ウェルを追加⁺ T 細胞 (OLP の最終濃度_pool パルス Dc は 1 × 10⁶セル/mL、CD8 の最終的な集中⁺ T 細胞は 5 x 10⁶セル/mL、IL-2 の最終濃度が 25 U/mL と IL-7 の最終濃度が 50 U/mL)。37 ° C と 5% の CO₂の細胞を培養します。

4 日目、削除および培地の約 400 μ L を破棄し、100 U/mL IL-2 と IL-7 の各井戸の 100U/mL を含む新鮮な無血清培地の 500 μ L を追加します。37 ° C と 5% の CO₂のセルを孵化させなさい。

7 または 8 日再活性 OLP_pool 先読み CD8⁺ T 細胞、OLP_pool。

3. メモリセル プライミング CD8 の再刺激⁺ T 細胞マクロファージとパルス、OLP_pool

1. 4 日 OLP_pool 先読み CD8 の再刺激前に⁺ T 細胞, 2% (v/v) ポリアクリルアミド ビーズ ソリューションの準備: エンドトキシン フリー 20 mL で 2 回ポリアクリルアミド ビーズの 2 g を洗って H₂O または PBS。5 分 (400 x g) 遠心分離によってポリアクリルアミド ビーズをペレットし、100 mL の PBS に再懸濁します。室温で 20 分ストア 15 lb/m オートクレーブ。
2. マウスを単球/マクロファージの腹腔内¹⁶への移行を誘致するための無菌 2% ポリアクリルアミド ビーズ溶液の 1 mL/マウスの腹腔内に注入します。
3. 4 日後、CO₂の過剰摂取によって動物を犠牲します。
   1. 無菌条件下で開口部が十分な腹部の中央に小さな開口部をカット 5 mL 転送ピペットを渡すため。RPMI 0 転送ピペットを入力し、開口部を通って腹部キャビティにピペットを挿入します。
   2. ピペッティングによる腹部キャビティをすすいでください。腹部キャビティからできるだけ多くの液体を (これらはマクロファージ) 生殖不能の管にピペットの。洗浄手順 4-5 回繰り返します。
4. 3000 ラドと腹腔マクロファージを照射します。
   1. また、扱うマイトマイシン C 併用腹腔マクロファージ (ステップ 2.2 で説明されている手順に従ってください)。
5. 5 x 10⁶セル/ml 無血清培地にマクロファージの濃度を調整します。(最終の DMSO 濃度は 1% 未満) OLP_pool 在庫と M-CSF を追加 (最終濃度 100 U/mL を =)。
   注: このモグ OLP の研究では、0.5 %dmso を使用しています。したがって、モグ OLP_pool 在庫だった (例えば1 モグ OLP_Pool 腹腔マクロファージの 199 μ L に追加された在庫の μ L) x 希釈 200 です。したがって、各 OLP の最終濃度が 4.2 μ g/mL)。
6. 48 ウェル培養皿で 200 μ L/ウェル (1 x 10⁶細胞/ウェル) を追加し、37 ° C 4 h でプレートを孵化させなさい。
7. 予め温めておいた RPMI 0 200 μ L/ウェルと穏やかな洗浄によって非付着性のセルとポリアクリルアミド ビーズを削除します。
8. プール、OLP_pool の収集とプライミング CD8 ステップ 2.10 から⁺ T 細胞します。調整、OLP_pool プライミング CD8⁺ 1 x 10 の⁶セル/ml 25 U/mL IL-2 と IL-7 の 50 U/mL を含む無血清培地に T 細胞濃度。OLP_pool パルス腹腔マクロファージを含む 48 ウェル プレートに 1 mL/ウェルを追加します。
9. 4 日後、48 ウェル プレート内の媒体を補充します。取り外して 48 ウェル培養皿で培養液の約 400 μ L を廃棄します。各ウェルに新鮮な無血清培地含む 100 U/mL の IL-2 500 μ L と IL-7 の 100 U/mL を追加します。37 ° C と 5% の CO₂の細胞を培養します。
10. 3、4 日後、確認 OLP_pool よみがえって CD8⁺ T 細胞 OLP_pool 固有の Qa 1 制限対応 immunospot の酵素試金 (しなさい)。これ以降、再活性 CD8⁺ T 細胞ごとに 7-10 日間。
    注: マクロファージ OLP_pool 先読み CD8 の再刺激に適している⁺ T 細胞。我々 は気づいた CD8⁺ T 細胞マクロファージによって再刺激された Dc体外よりよく育った。

4. OLP_pool 固有の定量、Qa 1 制限応答 OLP_pool よみがえって CD8 T 細胞ラインの⁺

注: OLP_pool 固有の Qa 1 制限応答 OLP_pool よみがえって CD8⁺ T 細胞は、肝腎分泌 C1R または C1R の存在下で OLP_pool によって次の刺激によって決まります。肝腎しなさいアッセイを使用して Qa 1^b細胞。C1R 細胞は商業的に入手できます。C1R。Qa 1^b細胞は、Qa 1 レンチウイルスベクターと C1R 細胞の伝達によって生成できます。

1. 追加しなさいプレートのウェルにコーティング バッファー (PBS) で希釈したキャプチャ抗 IFN-γ 抗体の 100 μ L/ウェル。

シールし、4 ° C でプレートを一晩インキュベートします。

2 日目、キャプチャ抗 IFN-γ 抗体を含むコーティング バッファーを破棄し 200 μ L/よく blocking ソリューション (無血清培地) を追加し、室温で 2 時間版を孵化させなさい。

C1R と C1R を照射します。9,600 ラドと Qa 1^b細胞。

1. また、C1R と C1R を扱います。マイトマイシン C 処理時間は 30 分になりますが手順 2.2 で説明するように Qa 1^b細胞。

C1R と C1R を調整します。4 × 10 の⁶セル/mL に無血清培地における Qa 1^b細胞。

プレートのブロッキング液を捨て、C1R と C1R を追加します。50 μ L/ウェル (200,000 細胞/ウェル) とミックスで Qa 1^b細胞。

50 μ L/ウェルの 100 倍希釈 OLP_pool 入荷 (無血清培地) を追加し、ミックスが適切。プレート 2 3 時間室温で孵化させなさい。

OLP_pool よみがえって CD8 を調整⁺ T 細胞の IL-7 の 150 U/mL を含む無血清培地に 10 の⁶セル/mL x 1-2 に、プレートに 50 μ L/ウェル (50,000-100,000 細胞/ウェル) を追加。プレート (58 x g) 5 分間を遠心します。

37 ° C と 5% の CO₂でプレートを一晩インキュベートします。

細胞懸濁液を吸い出しなさい。純水 (DI) (250 μ L/ウェル) で 2 回洗浄します。各洗浄ステップで 5 分間浸漬する井戸を許可します。

洗浄バッファーで洗浄井戸 3 回私 (0.05 %tween20 を含む PBS)。各洗浄ステップで 1 分間浸漬する井戸を許可します。洗浄バッファーを破棄します。

検出抗体希釈バッファー (10% 牛胎児血清 (FBS) を含む PBS) で希釈した 100 μ L を追加します。

2 時間室温で版を孵化させなさい。

検出抗体溶液を破棄します。3 回各洗浄ステップで 1 分間浸漬する 250 μ L/ウェルを洗浄バッファー i. を許可井戸と井戸を洗浄します。

1: 100 希釈で希釈バッファーで希釈した酵素共役 (ストレプトアビジン-HRP) の 100 μ L/ウェルを追加します。

室温で 1 時間版を孵化させなさい。

酵素共役ソリューションを破棄します。各洗浄ステップで 1 分間浸漬する 250 μ L/ウェルを洗浄バッファー i. を許可井戸を 4 回洗浄します。

250 μ L/ウェルを洗浄バッファー II (PBS) で 2 回洗浄します。

各ウェルに 100 μ L の基板の解決 (ミックス 1 ドロップ = 20 μ L AEC 発色の AEC 基板の 1 ml) を追加します。5 に 60 分間スポット開発を監視します。

目的の結果を表示する開始、蒸留水と井戸を洗浄することにより基質反応を停止します。

2 時間室温で板を空気乾燥またはそれが完全に乾燥するまで一晩します。皿の下のプラスチックのトレイの取り外しは乾燥を促進します。解析まで、暗闇の中で密閉されたビニール袋にプレートを格納します。

解剖顕微鏡の下で検査しなさいプレート リーダーを使用して、手動でスポットを列挙します。図 2に代表的な結果を参照してください。

5. OLP_pool 固有 CD8 Qa 1 制限の IFN-γ の分泌を刺激する、OLP_pool の個々 のペプチドの定量⁺ T 細胞

1. OLP_pool 固有の OLP_pool 固有 CD8 の Qa 1 点 IFN-γ の分泌を刺激する個々 のペプチッドを決定する⁺ T セルライン上記を使用して説明しなさい IFN-γ アッセイ (最終濃度使用それぞれの個々 のペプチドのELISOPT のアッセイは、10 μ g/mL)。図 3に代表的な結果を参照してください。
   注: OLP 特定、Qa 1 restircted 応答は、C1R の存在下で応答の少なくとも 3 回は、応答として定義されます。Qa 1^b細胞が、OLP なし。モグ OLP 研究、OLP68、OLP96、および OLP105 のすべてはこの基準を満たします。したがって、3 つすべての OLPs 含む Qa 1 エピトープ¹² (図 3)。しかし、OLP105 は一貫して強い応答を与えたしたがって、OLP105 の詳細な分析を行った (図 4および図 5)¹²。

6. OLP_pool 固有 CD8 のエピトープに固有の Qa 1 制限の応答を刺激する 15 mer OLP の最適な Qa 1 エピトープの同定⁺ T 細胞

1. 図 4に示すように、15 mer OLP の C と N-末端切り捨てペプチドを合成します。
2. OLP 固有 CD8 の IFN-γ の分泌を調べる⁺ T 細胞 CD8 を刺激することによって線切り捨てられたペプチドとして親 15 mer OLP C1R または C1R の存在下での⁺ T 細胞します。上記を使用して Qa 1^b細胞は、IFN-γ しなさいアッセイをについて説明します。なさいアッセイ用各個々 のペプチドの最終濃度は 10 μ g/mL です。ペプチドは最適な Qa 1 エピトープとして定義されている場合、ペプチド: 1) 一貫して C1R の存在下で、元の 15 mer ペプチドと比較すると、類似または強い IFN-γ 応答を与えます。Qa 1^b細胞;2) 8 - 10 mer (優先 9 mer ペプチド) 間は MHC に結合ペプチドの長さである-私の分子^15,17。図 5に代表の結果を参照してください。

結果

蛋白質の全体の長さをカバー OLP ライブラリのデザイン

15 アミノ酸 (15 mer) タンパク質の N 末端から始まる、各ペプチドです。したがって、最初のペプチド 15 の位置に 1 の位置に します。2 番目のペプチドの N 末端は 11 アミノ酸によって最初のペプチドの C 末端と重複します。したがって、2 番目のペプチドにまたがる位置 ...

ディスカッション

ここでは、蛋白質の Qa 1 エピトープの分析のためのプロトコルを説明しました。このプロトコルに関連していくつかの他の方法は既に報告もしました。まず、同種の CD8⁺ T 細胞とクローンは Qdm¹の識別のために使用されました。第二に、Qdm の解析から推定される Qa-1 結合モチーフは HSP60p216 224 と TCRBV8.1 エピトープ^9,18の同?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
The protein to be analyzed	N/A	N/A	Sequence of the protein can be obtained from NCBI
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	Cat#: D2650 SIGMA	DMSO should be sterile and cell culture tested.
Kb-/-Db-/- mice	The Lackson Laboratory	Stock#: 019995	We used Taconic H2-KbH2-Db doube knockout mice (Cat#: 4215-F and 4215-M) which however are not available anymore.
AIM V Serum Free Medium	ThermoFisher Scientific	Cat#: 12055091
2-mercaptoethanol	ThermoFisher Scientific	Cat#: 21985023
Sodium pyruvate	ThermoFisher Scientific	Cat#: 11360070
Nonessential Amino Acids	ThermoFisher Scientific	Cat#: 11140076
Dynabeads CD8 Positive Isolation Kit	ThermoFisher Scientific	Cat#: 11333D
Bio-Gel P-100	Bio-Rad	Cat#: 150-4171
Phoshate Balanced Solution (PBS)	ThermoFisher Scientific	Cat#: 20012027
Trasfer pipette	Globe Scientific	Mfg#: 137238
Murine M-CSF	PeproTech	Cat#: 315-02
48-well tissue culture plates	USA Scientific	Cat#: CC7682-7548
Corning Costar TC-treated Multiple well Plates, 96-well, V-shaped bottom	Sigma-Aldrich	Cat#: Z372129 Sigma
1ml deep 06-well PP plate, sterile	USA Scientific	Item#: 1896-1110
Recombinant murine IL-2	PeproTech	Cat#: 212-12
Recombinant murine IL-7	PeproTech	Cat#L: 217-17
Capture anti-IFN-γ antibody	BD Biosciences	Cat#: 551881
ELISPOT plate	Sigma-Aldrich	Cat#: S2EM004M99
C1R	ATCC	Cat#: ATCC CRL-1993
C1R.Qa-1b			Custom made (GenBank access#: NM_010398.3)
Qa-1 lentiviral vector	GeneCopoeia	Product#: Mm02955
Detection anti-IFN-γ antibody	BD Biosciences	Cat#: 551881
Tween20	Sigma-Aldrich	Cat#: P9416
Streptavidin-HRP	BD Biosciences	Cat#: BD557630
AEC substrate	BD Biosciences	Cat#: 551951
ImmunoSpot Analyzer	ImmunoSpot		Any immunoSpot analyer should work for this purpose.