Qa-1 단백질에 Epitopes를 매핑할 겹치는 펩타이드 라이브러리

요약

Qa-1 (인간에서 HLA-E) 비 고전 중요 한 조직 적합성 복잡 한 1b 분자의 그룹에 속한다. Qa-1-바인딩 epitopes와 면역 조직 특정 면역 규칙을 증강 하 고 여러 자가 면역 질환 개선에 표시 되었습니다. 여기는 Qa-1 단백질에 epitopes의 식별에 겹치는 펩타이드 라이브러리 전략에 설명합니다.

초록

Qa-1 (HLA-E 인간) (MHC-Ib) 분자 비 고전 중요 한 조직 적합성 복잡 한 1b의 그룹에 속한다. 최근 데이터 품질-1 분자 구조 및 기능적 무결성에 대 한 셀과 유도 하는 면역 조절, 제한 하는 바이러스 감염에 면역 반응에 중요 한 역할 놀이 것이 좋습니다. 또한, Qa 1 제한 CD8의 기능 확대 epitope를 통해⁺ T 세포 면역 여러 자가 면역 질환 동물 모델, 예를 들면 실험적인 알레르기 성 뇌에에서 치료 효과 보이고 있다 콜라겐 유도 관절염, 그리고 비 뚱뚱한 당뇨병. 따라서, 효율적이 고 신속 하 게 단백질의 기능적인 Qa 1 epitopes 식별할 수 있는 방법에 대 한 긴급 한 필요가 있다. 여기, 우리가 Qa 1 제한 CD8 사용 프로토콜 설명⁺ T 셀 라인 Qa-1 단백질에 epitopes를 결정 하기 위한 중복 펩 티 드 (OLP) 라이브러리에 대 한 특정. 이 OLP 라이브러리 포함 15-메 르 겹치는 펩 티 드, 단백질의 전체 길이 커버 하 고 인접 한 펩 티 드 11 아미노산에 의해 중복. 이 프로토콜을 사용 하 여, 최근 myelin oligodendrocyte 당단백질 (MOG)에서 9-메 르 Qa 1 epitope 파악. 이 새로 매핑된 MOG Qa-1 epitope epitope 관련, Qa 1 제한 CD8 유도 표시 했다⁺ T 세포는 향상 된 myelin 특정 면역 규칙. 따라서,이 프로토콜은 소설 대상의 미래 조사 및 Qa 1 제한 CD8의 기능을 위한 유용한⁺ T 세포.

서문

Qa-1 쥐에서 (MHC-Ib) 분자 비 고전 중요 한 조직 적합성 복잡 한 1b의 그룹에 속한다. 그것의 인간 상 동 기관이 이다 HLA. 이전 증거 Qa 1 분자는 중요 한 생물 학적 기능을 시연 하고있다. 첫째, Qa-1 분자 셀 구조 및 기능적 무결성에 대 한 조사에서 중요 한 역할을 한다. 이와 관련, Qa-1 분자는 세포의 정상적인 기능을 모니터링 하는 몇 가지 전략을 진화 했다. 이러한 전략 중 하나는 Qa-1 분자를와 처리 지도자 펩 티 드 (epitope), 즉 Qa-1 결정 한정자 (Qdm) 바인딩과 그물¹에 고아 한 MHC i a 분자에서 처리 되는 양식 단지를 수 있습니다. Qa-1/Qdm 단지 나중 세포의 표면에 표시 하 고 바인딩합니다 NK 세포에 금지 NKG2A 수용 체를 억제 하는 활동²를 죽이 NK. Ia MHC 분자의 표현을 손실 됩니다, 셀 (예: 악성 셀)²를 죽이 NK에 민감한 됩니다. 다른 전략 Qa 1 분자를 탭 (항 원 처리와 관련 된 전송)의 결핍은 세포의 표면에 새로운 Qa-1/epitope 복합물을 형성 수 있습니다³ 또는 ERAAP (바인딩과 그물 aminopeptidase와 관련 된 항 원 처리)⁴ (둘 다 결핍이 자주 악성 세포에 발생). 표현 하는 이러한 새로운 Qa-1/epitope 단지 셀 수 다음 인식 하 고 피토 프 전용 CD8 Qa 1 제한에 의해 제거⁺ T 세포. 둘째, Qa-1 분자 면역 규칙⁵유도. 이와 관련, Qa-1/epitope 단지 표시 되었습니다 CD8 자극⁺ 자체 조직^{6,,78 의 면역 중재 손상의 예방에 대 한 중요 한 규제 T (Treg) 셀 ,910}. 셋째, Qa 1 제한 CD8⁺ Treg 세포 바이러스 감염¹¹에 대 한 면역 반응 제한 표시 되었습니다.

따라서, 특정 확대 epitope 관련 Qa-1-restrictred CD8의⁺ T 세포는 비정상적인 세포의 제거, 면역 조절의 향상 및의 크기의 제어 잠재적으로 유망한 전략 바이러스-유도 된 면역 응답입니다. 동안 여부 결정 되지 않은 확대 epitope 관련 Qa 1 제한 CD8의⁺ T 셀 수 면역 감시를 강화 하 고 면역 반응을 유도 하는 바이러스를 제한, 우리의 실험실과 다른 사람 명확 하 게 증명 하는 Qa 1 epitopes와 예방접종 CD8 Qa 1 제한의 기능을 강화할 수 있습니다⁺ Treg 세포 병원 성 면역 CD4에 대 한 특정⁺ T 세포, CD4의 효율적인 제어를 선도⁺ T 세포 중재 면역 질환에는 실험적인 알레르기 성 뇌 (인간 다 발성 경화 증 동물 모델)^6,10, 콜라겐 유도 관절염 (인간 류 마티스 관절염 동물 모델)⁷, 등 다양 한 동물 모델 및 비만 아닌 당뇨병 (인간 타입-1 당뇨병의 동물성 모형)⁸. 또한, 우리는 면역 조직 관련 Qa 1 epitope와 CD8의 확대를 통해 그 조직에 염증 면역 중재의 특정 컨트롤에 리드 발견⁺ Treg 세포¹². 전 임상 연구의 위의 성공을 나타내는 Qa 1 epitope 접종 및 잠재적으로 수돗물에 결핍과 관련 된 다른 질병의 치료에 대 한 조직의 특정 면역 중재 질병의 치료에 대 한 완전 한 평가 대 한 필요와 ERAAP입니다.

따라서, 안정적이 고 신속 하 게 Qa-1 단백질에 epitopes 분석할 수 있는 기술에 대 한 수요가 있다. 이와 관련, 제한 된 수의 생물학으로 중요 한 Qa 1 epitopes 설명 하고있다. 대부분 이러한 Qa 1 epitopes의 CD8의 연구 기간 동안 serendipitously 발견 했다⁺ T 세포 박테리아¹³, 셀 탭³결핍, 셀 ERAAP⁴, 결핍 및 EAE^{6, 발생 하는 셀에 대 한 응답 9}. 따라서, 높은 처리량 기술 정의 된 단백질의 생물학으로 중요 한 Qa 1 epitopes의 식별을 위해 바람직합니다. 다음, 우리를 사용 하 여 Qa-1-resrticted CD8 단백질에서 기능 Qa 1 epitopes는 겹치는 펩 티 드 (OLP) 라이브러리 전략 설명⁺ T 세포 단백질의 OLP 풀 (OLP_pool)에 대 한 특정 라인.

프로토콜

모든 실험 기관 동물 관리 및 사용 프로토콜 동물 관리 및 사용 텍사스 대학교 엘 파소 그리고 Loma Linda 대학에 위원회에 의해 승인에 따라 수행 되었다.

1. 단백질의 전체 길이 덮고 OLP 라이브러리의 생성

1. 설계는 OLP 라이브러리는 모든 펩 티 드, 길이 15-메 르 이며 인접 한 펩 티 드 11 아미노산에 의해 중복.
   참고: MOG OLP 연구에 MOG 전조 [생쥐]의 시퀀스 검색 NCBI 단백질 데이터베이스에서이 링크를 수행 하 여: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_034944. 집 고 양이 전조 (247 아미노산), 신호 및 성숙한 펩 티 드를 포함, 보고 된 Qa-1 (HLA-E) epitopes의 대부분은 신호 펩 티 드 (예: Qdm¹)에 위치 해 있기 때문에 사용 되었다. 그것의 N-말단에서 시작, 15-메 르 펩 티 드의 시퀀스를 두 개의 인접 한 펩 티 드 11 아미노산 (그림 1)에 의해 중첩 확인 되었다. 따라서, 정확 하 게 59 OLPs 247 아미노산 MOG 전조에서 확인 되었다. 그러나, 마지막 OLP 단백질의 길이 따라 15-메 르 12에서 배열할 수 있다. 우리와 다른 것으로 나타났습니다 15-메 르 펩 티 드, 또는 대 식 세포, 모 수석 세포 (DCs)에 추가 될 때 효율적으로 될 수 있기 때문에 15-메 르 라이브러리 선택 하는 또한,⁺ T^{14,15 세포 CD8 epitopes 인식으로 처리} .
2. 상업적으로 각 개별 펩 티 드를 구입. 펩 티 드 당 5 mg 심사에 대 한 충분 해야 합니다. 잘린된 펩 티 드 (단계 6.1) OLPs desalted 펩 티 드 (순도 약 50-70%)를 하실 수 있습니다. 최적의 펩 티 드 (단계 6.2) tetramer의 세대와 미래 생물학 분석 사용 될의 순도 이어야 한다 > 90%. 무 균 조건 하에서 펩 티 드 reconstitute
3. 100 %DMSO 50 mg/mL 개별 펩 티 드 주식을 확인 합니다. 각 펩 티 드의 5 mg 추가 각 튜브에 DMSO의 100 μ 혼합, 그리고-20 ° c.에 펩 티 드 저장 이러한 주식 CD8의 세대에 대 한 OLP_pool 재고를 확인 하는 데 사용 됩니다⁺ T 셀 라인 반응 하는 OLP_pool. 또한, 이러한 주식은 또한 만들기 위하여 이용 될 10 mg/mL OLP_pool 반응 CD8에서 Qa 1 제한 반응을 자극 하는 각 개별 펩 티 드의 능력을 결정 하기 위한 개별 펩 티 드 주식⁺ T 세포 라인.
4. 신선한 관으로 각 펩 티 드의 동일한 볼륨을 추가 하 여 확인 OLP_pool 주식. 이 OLP_pool 주식 100 %DMSO 포함합니다. 집 고 양이 OLP 연구에서 59 OLPs¹²했다. 따라서, 농도 OLP_pool에서 각 펩 티 드의 847.46 μ g/mL (50 mg/mL ÷ 59) 이었다.
5. 희석 (5 x) 10 mg/mL 개별 펩 티 드 주식 하 게 살 균 H₂O (이 주식 포함 20 %DMSO) V 하단 96 잘 접시에서 50 mg/mL 주식. 각 개별 펩 티 드의 Qa 1 제한 응답의 결정 96 잘 접시 8 또는 12 채널 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 수행 됩니다 때문에이 주식 96 잘 접시에 확인 합니다.
   참고: 모든 펩 티 드, OLPs 및 잘린된 펩 티 드를 포함 하 여 V-하단 96 잘 접시에 희석 해야 합니다 또는 96-잘 샘플 랙 가득 1 mL 튜브 때문에 펩 티 드 라이브러리 심사 96 잘 접시 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 수행 됩니다. 경우에 희석 한 펩 티 드, 펩 티 드를 분해 수 있도록 현명한 1 N NaOH 방울을 추가 하는 것이 어렵습니다.

2. 못쓰게 K의^b-/- D^b-/- CD8⁺ OLP_pool 펄스 k T 세포^b-/- D^b-/- 모 수석 세포 (DCs).

참고: 두 개의 주요 Qa 1 대립 유전자에 있다: 하나는 Qa-1^는, 그리고 다른 Qa-1^b. 학술 연구에 대 한 일반적으로 사용 되는 동물, 이후 예 C57BL/6, Balb/c 마우스, Qa-1^b,이 프로토콜 매핑 Qa-1^b epitopes는 단백질에 대 한 절차를 설명 합니다. CD8⁺ T이이 프로토콜에 사용 되는 세포에서에서 순화 된다^b-/-D^b-/- 는 CD8에 마우스 (C57BL/6 배경)⁺ T 세포 Qa-1 등 아닌 클래식 Ib MHC 분자에 의해 주로 제한 됩니다.

1. 앞에서 설명한¹²골 파생 된 Dc를 생성 합니다.
   1. 간단히, RPMI-10 매체 (RPMI 1640 10% 태아 둔감 한 혈 청, 5.5 x 10^-5 M 2-mercaptoethanol, 1mm 나트륨 pyruvate, 0.1 m m 불필요 한 아미노산 보충)에 골 수 단일 셀 정지 (1 x 10⁶ 셀/mL)를 문화 10 U/mL IL-4를 포함 하는 6-잘 접시 (4 mL/잘) 37 ° C, 5% CO₂에서 100 U/mL GM-CSF.
   2. 2 일 후, 신중 하 게 비 부착 한 세포를 제거 하 고 신선한 미디어와 cytokines를 추가 합니다.
   3. 또 다른 2 일 동안 세포를 배양 한 후 신선한 미디어와 cytokines 새로운 6 잘 플레이트에 포함 된 비 부착 한 세포를 전송 합니다.
   4. 또 다른 2 일 셀 문화 및 신선한 미디어와 LPS를 포함 하는 cytokines 보충 (0.1 µ g/mL)는 Dc를 활성화.
   5. 24 시간 후, 실험에 대 한 Dc를 수집 합니다.
2. 3000 래 드와 Dc 비추는
   1. 또는, 미토마이신 C와 Dc (5 x 10⁷ 셀/mL)을 치료 (50 μ g/mL) 20 분에 대 한 37 ° C에서 PBS에 추가할 RPMI-0 (혈 청 없이 RPMI 1640) (~ 12 mL) 튜브를 g. 삭제 supernatants repea x 300에 탁상 원심 분리기에서 10 분에 대 한 셀을 회전 t 세척 절차 두 번 더입니다. 이러한 세 가지 세척은 중요 한 어떤 추적 미토마이신 C 양의 CD8의 응답을 억제 수 있습니다 때문에⁺ T DC-T 세포 공동 배양 중 세포.
3. 5 x 10⁶ 셀/ml 혈 청 무료 매체 (목표-V 세럼 무료 매체 5.5 x 10^-5 M 2-mercaptoethanol, 1mm 나트륨 pyruvate, 0.1 m m 불필요 한 아미노산 보충)에 DC 농도 조정 합니다.
4. 최종 DMSO 농도 0.5% (200 x) 일 것 이다 그런 Dc에 100 %DMSO 포함 하는 OLP_pool 재고 솔루션을 추가 합니다. 집 고 양이 OLP 연구에는 OLP_pool에서 각 OLP의 농도 847.46 μ g/mL; 따라서 DC 문화에 각 OLP의 최종 농도 4.2 μ g/mL (847.46 μ g/mL ÷ 200) 이었다.

그러나,이 농도 세포 배양에서 DMSO 농도 남아 1% 미만으로 100 μ g/mL까지 확장할 수 있습니다.

3 시간 실 온에서 Dc를 품 어 고 흔들어 셀 부드럽게 매 15 분.

이 잠복기 동안 CD8 정화⁺ T 세포 수확된 비장 또는 K의 림프절에서^b-/-D^b-/- 상업 CD8를 사용 하 여 마우스⁺ T 세포 정화 키트, 10 x 10⁶ 셀/ml에 셀 농도 조정 50 U/mL 인터 루 킨 2 (일리노이-2)와 일리노이-7의 100 U/mL를 포함 하는 혈 청 자유로운 매체.

자, 추가 CD8 0.5 mL/잘으로 48-잘 접시로⁺ T 세포 (0.5 mL/OLP_pool 펄스 Dc 단계 2.8는 CD8의 최종 농도에서 추가 후에⁺ T 세포는 5 x 10⁶ 셀/mL을 될 것입니다).
참고: CD8⁺ T 마우스 비장 및 림프절에서 셀 제조업체에서 제공한 지시를 따라 CD8 긍정적인 격리 키트를 사용 하 여 순화 될 수 있다. CD8⁺ T 세포 얻은 구슬의 자유롭다.

2 x 10⁶ 셀/ml 혈 청 무료 매체에서 OLP_pool 펄스 Dc OLP_pool 펄스 Dc (300 x g, 10 분) 실시간 Reconstitute에 아래로 회전 하 고는 CD8 포함 48-잘 접시에 0.5 mL/잘 추가⁺ T 세포 (최종 농도 OLP의 _pool 펄스 Dc 1 x 10⁶ 셀/mL, CD8의 최종 농도⁺ T 세포는 5 x 10⁶ 셀/mL, 일리노이-2의 최종 농도 25 U/mL 이며 일리노이-7의 최종 농도 50 U/mL). 37 ° C, 5% CO₂셀 문화.

4 일에 제거 하 고 문화 매체의 약 400 μ를 삭제 한 추가 100 U/mL 일리노이-2와 각 잘 일리노이-7의 100U/mL를 포함 하는 신선한 혈 청 자유로운 매체의 500 μ. 37 ° C, 5% CO₂에서 셀을 품 어.

당일 7 또는 8, 다시 OLP_pool 액 CD8 자극은 OLP_pool와⁺ T 세포.

3. 끝났다 CD8 restimulation⁺ T 세포와 대 식 세포는 OLP_pool와 펄스

1. OLP_pool 액 CD8의 다시 자극 하기 전에 4 일⁺ T 세포, 2% (v/v) polyacrylamide 비드 솔루션 준비: 20 mL에 두 번 polyacrylamide 구슬의 2 세대를 세척 하 여도 무료 H₂O 또는 PBS. 5 분 동안 원심 분리 (400 x g)에 의해 작은 공의 polyacrylamide 구슬 고 100 mL PBS의에서 resuspend. 압력솥에서 15 파운드/m 실 온에서 20 분이 게에 대 한.
2. Intraperitoneally 살 균 2 %polyacrylamide 비드 솔루션의 복 막 구멍¹⁶에 monocytes/대 식 세포의 마이그레이션 유치 1 mL/마우스와 함께 쥐를 주사.
3. 4 일 후, CO₂ 과다 하 여 동물을 희생.
   1. 무 균 조건 하에서 잘라는 작은 여 복 부의 중심에는 오프닝은 충분히 5 mL 전송 피 펫을 전달. 전송 피 펫 RPMI-0와 개방을 통해 복 부 캐비티에 피펫으로 삽입.
   2. Pipetting으로 복 부 구멍을 씻어. (이들은 복 막 대 식 세포) 무 균 튜브에 복 부 구멍에서 가능한 많은 액체 밖으로 플라스틱. 린스 단계 4-5 회 반복 합니다.
4. 3000 래 드와 복 막 대 식 세포 비추는
   1. 또는, 미토마이신 C와 복 막 세포 (2.2 단계에에서 설명 된 절차를 따르십시오.) 취급 합니다.
5. 5 x 10⁶ 셀/ml 혈 청 자유로운 매체에 복 막 대 식 세포의 농도 조정 합니다. OLP_pool 재고 (최종 DMSO 농도 1% 미만)와 M-CSF를 추가 (최종 농도 = 100 U/mL).
   참고:이 집 고 양이 OLP 연구에서 0.5 %DMSO 사용 우리. 따라서, 집 고 양이 OLP_pool 주식 MOG OLP_Pool 재고 복 막 대 식 세포의 199 μ에 추가 되었습니다 (예: 1 μ) x 희석된 200 했다. 따라서, 각 OLP의 최종 농도 4.2 μ g/mL) 했다.
6. 48-잘 조직 문화 접시에서 200 μ/잘 (1 x 10⁶ 셀/잘)을 추가 하 고 37 ° C 4 h에서 접시를 품 어.
7. 비 부착 한 세포는과 polyacrylamide 구슬 200 μ/잘 미리 따뜻하게 RPMI-0의 부드러운 세척 하 여 제거 합니다.
8. 수집 및 수영장은 OLP_pool 액 CD8 단계 2.10에서⁺ T 세포. 조정 하는 OLP_pool 액 CD8⁺ 1 x 10⁶ 셀/ml 25 U/mL 일리노이-2와 일리노이-7의 50 U/mL를 포함 하는 혈 청 자유로운 매체에 T 세포 농도. OLP_pool 펄스 복 막 대 식 세포를 포함 하는 48-잘 접시를 1 mL/음을 추가 합니다.
9. 4 일 후, 48-잘 접시에 매체를 보충. 제거 하 고 약 400 μ 48-잘 배양 배지에서 배양의 삭제. 각 우물에 신선한 혈 청 무료 중간 포함 100 U/mL의 일리노이-2 500 μ와 일리노이-7의 100 U/mL를 추가 합니다. 37 ° C, 5% CO₂셀 문화.
10. 3 ~ 4 일 후, 검사 OLP_pool restimulated CD8 효소 연결 된 immunospot 분석 결과 (ELISPOT)에 의해 OLP_pool 전용, Qa 1 제한 응답⁺ T 세포. 이 시점 후 다시 자극 하는 CD8⁺ T 세포 모든 7-10 일.
    참고: 대 식 세포는 OLP_pool 액 CD8의 다시 자극에 대 한 선호⁺ T 세포. 우리가 나타났습니다 CD8⁺ T 세포 대 식 세포에 의해 다시 자극된 Dc 시험관보다 더 성장 했다.

4. OLP_pool-특정의 결정, Qa 1 제한 응답 OLP_pool restimulated CD8 T 세포 라인⁺

참고: OLP_pool 전용, Qa 1 제한 응답 OLP_pool restimulated CD8에서⁺ T 셀 라인 IFNγ 분 비 자극 C1R 또는 C1R 있을 때 OLP_pool에 의해 다음에 의해 결정 됩니다. Qa-1^b 세포 IFNγ ELISPOT 분석 결과 사용 하 여. C1R 셀 상업적으로 얻어질 수 있다. C1R입니다. Qa-1 lentiviral 벡터와 C1R 셀 시험으로 Qa-1^b 세포를 생성할 수 있습니다.

1. 추가 캡처 안티-IFN-γ 항 체의 100 μ/잘 ELISPOT 격판덮개의 우물에 코팅 버퍼 (PBS)에 희석 합니다.

봉인 하 고 하룻밤 4 ° C에서 접시를 품 어.

두 번째 날, 캡처 안티-IFN-γ 항 체를 포함 하는 코팅 버퍼를 삭제 하 고 솔루션을 추가 200 μ/잘 blocking (혈 청 무료 매체) 실 온에서 2 h에 대 한 접시를 품 어.

C1R와 C1R 비추는. 9600 래 드와 Qa-1^b 세포.

1. 또는, C1R와 C1R 취급 합니다. 미토마이신 C 제외 하 고 치료 시간이 30 분 일 것 이다 단계 2.2에 설명 된 대로와 Qa-1^b 세포.

C1R와 C1R 조정 합니다. 4 x 10⁶ 셀/mL 혈 청 자유로운 매체에서 Qa-1^b 세포.

접시에 차단 솔루션을 삭제 하 고 C1R와 C1R 추가. Qa-1^b 세포 50 μ/잘 (200, 000 셀/잘)와 혼합.

100 x 50 μ/잘 희석 OLP_pool 주식 (혈 청 무료 매체)에 추가 하 고 제대로 혼합. 2-3 시간 실 온에서 접시를 품 어.

OLP_pool restimulated CD8 조정⁺ T 1-일리노이-7의 150 U/mL를 포함 하는 혈 청 자유로운 매체에 10⁶ 셀/mL x 2 세포와 50 μ/잘 (50000-100000 셀/잘) 접시에 추가. 5 분 동안 접시 (58 x g) 원심

37 ° C, 5% CO₂ 접시를 밤새 품 어.

세포 현 탁 액 발음 2 번 이온된 (DI) 수 (250 μ/잘)와 웰 스 워시. 웰 스 각 세척 단계에 5 분 동안 담가 수 있습니다.

세척 우물 3 번 씻어 버퍼 나 (PBS 0.05 %Tween20 포함). 웰 스 각 세척 단계에 1 분 동안 담가 수 있습니다. 워시 버퍼를 삭제 합니다.

탐지 항 체 희석 버퍼 (PBS 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 포함)에 희석의 100 μ를 추가 합니다.

2 시간에 대 한 실 온에서 번호판을 품 어.

삭제 탐지 항 체 솔루션. 워시 3 번으로 각 세척 단계에 1 분 동안 담가 수 250 µ L/잘 씻어 버퍼 I. 허용 우물 우물.

1: 100 희석 시 희석 버퍼에 희석 효소 공액 (Streptavidin-HRP)의 100 μ/잘 추가 합니다.

실 온에서 1 h에 대 한 번호판을 품 어.

효소 어원이 솔루션을 삭제 합니다. 각 세척 단계에 1 분 동안 담가 수 250 µ L/잘 씻어 버퍼 나 수 스와 4 번 웰 스 워시.

2 번 250 µ L/잘 씻어 버퍼 II (PBS)와 웰 스 워시.

각 우물에 기판 솔루션 (혼합 1 방울 = 20 µ L의 AEC Chromogen AEC 기판의 1 mL와 함께) 100 µ L를 추가 합니다. 5 ~ 60 분 별색 개발을 모니터링 합니다.

원하는 결과 표시 시작, 웰 스 증류수로 세척 하 여 기판 반응을 중지 합니다.

2 h에 대 한 실 온에서 접시를 건조 나 완전히 건조 될 때까지 밤새. 접시 아래 플라스틱 트레이 제거 건조 촉진 한다. 분석 되 고 때까지 어둠 속에 봉인된 된 비닐 봉투에 접시를 저장 합니다.

수동으로 해 현미경으로 검사 하거나 ELISPOT 플레이트 리더를 사용 하 여 명소를 열거 합니다. 그림 2에 대표적인 결과 참조 하십시오.

5. 결정 개별 펩 티 드의는 OLP_pool에는 OLP_pool 전용 CD8에서 Qa 1 제한 IFN-γ 분 비를 자극 하는⁺ T 셀 라인

1. 결정 개별 펩 티 드 OLP_pool 전용, OLP_pool 전용 CD8에서 Qa-1-restrictred IFN-γ 분 비를 자극 하는⁺ 위의 사용 하 여 T 세포 선 IFN-γ ELISPOT 분석 결과 (최종 농도 사용 각 개별 펩 티 드의 설명 ELISOPT에 대 한 분석 결과가 이다 10 μ g/mL). 그림 3에 대표적인 결과 참조 하십시오.
   참고: OLP-특정, Qa-1-restircted 응답 C1R 존재 응답의 적어도 세 번은 응답으로 정의 됩니다. Qa-1^b 세포는 OLP 없이. 집 고 양이 OLP 연구, OLP68, OLP96, 및 OLP105에서 모두이 기준을 만났다. 따라서, 모든 3 개의 OLPs는 잠재적으로 Qa 1 epitopes¹² (그림 3)를 포함합니다. 그러나, OLP105는 일관 되 게 강한 응답; 준 따라서 우리는 OLP105의 상세한 분석을 수행 (그림 4 및 그림 5)¹².

6. 신분증 OLP_pool 전용 CD8에 피토 프 전용, Qa 1 제한 응답을 자극 하는 15-메 르 OLP에 최적의 Qa 1 Epitope의⁺ T 셀 라인

1. C-와 N-말기 잘린 그림 4와 같이 15-메 르 OLP의 펩 티 드를 음성 합성.
2. OLP 특정 CD8에서 IFN-γ 분 비 검사⁺ 자극 하는 CD8 T 세포 라인⁺ T C1R 또는 C1R 있을 때 부모의 15-메 르 OLP 잘린된 펩 티 드의 각 세포. 위의 사용 하 여 Qa-1^b 셀 IFN-γ ELISPOT 분석 결과 설명 합니다. 각 개별 펩 티 드 ELISPOT 분석 결과 대 한 사용의 최종 농도 10 μ g/mL 이다. 펩 티 드 경우 최적의 Qa 1 epitope로 정의 된다 펩 티 드: 1) 일관 되 게 원래 15 메 펩타이드, C1R 존재에 비해 비슷하거나 더 강한 IFN-γ 응답을 제공. Qa-1^b 세포; 2)는 8-10 메 르 (9-메 르 펩타이드 선호) 사이 MHC에 바인딩된 펩 티 드 길이-나 분자^15,17. 대표 결과 그림5에서를 참조 하십시오.

결과

단백질의 전체 길이 덮고 OLP 라이브러리의 디자인

단백질의 N-말단에서 시작, 각 펩 티 드 15 아미노산 (15-메 르)입니다. 따라서, 첫 번째 펩 티 드 15 위치로 1 위치에 걸쳐. 두 번째 펩 티 드의 N-말단 겹치면 11 아미노산에 의해 첫 번째 펩 티 드의 C-터미널. 따라서, 두 번째 펩 티 드에 걸쳐 위치 19에 위치 5. (그림 1

토론

여기, 우리는 Qa-1 단백질에 epitopes를 분석 하기 위한 프로토콜을 설명 했습니다. 이 프로토콜에 관하여 여러 가지 다른 전략 또한 이전 보고 했다. 첫째, 수용자 CD8⁺ T 세포와 클론 Qdm¹의 식별을 위해 사용 되었다. 둘째, Qdm의 분석에서 상 상속 Qa 1 바인딩 모티브 HSP60p216-224와 TCRBV8.1 epitope^9,18의 식별을 위해 사용 되었다. 단백질에?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
The protein to be analyzed	N/A	N/A	Sequence of the protein can be obtained from NCBI
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	Cat#: D2650 SIGMA	DMSO should be sterile and cell culture tested.
Kb-/-Db-/- mice	The Lackson Laboratory	Stock#: 019995	We used Taconic H2-KbH2-Db doube knockout mice (Cat#: 4215-F and 4215-M) which however are not available anymore.
AIM V Serum Free Medium	ThermoFisher Scientific	Cat#: 12055091
2-mercaptoethanol	ThermoFisher Scientific	Cat#: 21985023
Sodium pyruvate	ThermoFisher Scientific	Cat#: 11360070
Nonessential Amino Acids	ThermoFisher Scientific	Cat#: 11140076
Dynabeads CD8 Positive Isolation Kit	ThermoFisher Scientific	Cat#: 11333D
Bio-Gel P-100	Bio-Rad	Cat#: 150-4171
Phoshate Balanced Solution (PBS)	ThermoFisher Scientific	Cat#: 20012027
Trasfer pipette	Globe Scientific	Mfg#: 137238
Murine M-CSF	PeproTech	Cat#: 315-02
48-well tissue culture plates	USA Scientific	Cat#: CC7682-7548
Corning Costar TC-treated Multiple well Plates, 96-well, V-shaped bottom	Sigma-Aldrich	Cat#: Z372129 Sigma
1ml deep 06-well PP plate, sterile	USA Scientific	Item#: 1896-1110
Recombinant murine IL-2	PeproTech	Cat#: 212-12
Recombinant murine IL-7	PeproTech	Cat#L: 217-17
Capture anti-IFN-γ antibody	BD Biosciences	Cat#: 551881
ELISPOT plate	Sigma-Aldrich	Cat#: S2EM004M99
C1R	ATCC	Cat#: ATCC CRL-1993
C1R.Qa-1b			Custom made (GenBank access#: NM_010398.3)
Qa-1 lentiviral vector	GeneCopoeia	Product#: Mm02955
Detection anti-IFN-γ antibody	BD Biosciences	Cat#: 551881
Tween20	Sigma-Aldrich	Cat#: P9416
Streptavidin-HRP	BD Biosciences	Cat#: BD557630
AEC substrate	BD Biosciences	Cat#: 551951
ImmunoSpot Analyzer	ImmunoSpot		Any immunoSpot analyer should work for this purpose.