Qa-1 epitopları bir protein eşlemek için çakışan Peptide Kütüphane

Özet

Qa-1 (HLA-E insan) klasik olmayan MHC kompleksi 1b molekülleri bir gruba ait. Bağışıklama Qa-1-bağlama epitopları ile doku özgü bağışıklık yönetmelik çoğaltmak ve birkaç otoimmün hastalıkları iyileştirmek için gösterilmiştir. Burada biz bir protein Qa-1 epitopları tanımlanması için çakışan bir peptid Kütüphane strateji tanımlarlar.

Özet

Qa-1 (HLA-E insan) (MHC-IB) molekülleri klasik olmayan MHC kompleksi 1b grubuna aittir. Son veriler ortaya koymaktadır Qa-1 moleküller hücreleri yapısal ve işlevsel bütünlüğü için ölçme, bağışıklık yönetmelik inducing ve viral enfeksiyonlara karşı bağışıklık yanıtı sınırlayan önemli rol oynarlar. Ayrıca, Qa 1 kısıtlı CD8 fonksiyonel büyütme⁺ T hücreleri epitope bağışıklama birkaç otoimmün hastalığı hayvan modellerinde, örneğin deneysel Alerjik ensefalomiyelit, tedavi edici etkileri göstermiştir kollajen kaynaklı artrit ve obez olmayan diyabet. Bu nedenle, çok verimli ve hızlı bir şekilde işlevsel Qa-1 epitopları bir protein belirlemek için bir yöntem için acil bir ihtiyaç. Burada, Qa 1 kısıtlı CD8 kullanan bir iletişim kuralı tarif⁺ T hücre hatları belirli bir protein Qa-1 epitopları belirlenmesi için çakışan peptid (OLP) kitaplık. Bir protein tüm uzunluğu kapak 15-mer örtüşen peptidler bu OLP kitaplığı içerir ve bitişik peptidler 11 amino asitler tarafından örtüşmesi. Bu iletişim kuralını kullanan, biz son zamanlarda bir 9-mer Qa-1 epitope miyelin oligodendrocyte glikoprotein (MOG) olarak tespit edilmiştir. Bu yeni eşlenen MOG Qa-1 epitope epitope özgü, Qa 1 kısıtlı CD8 ikna etmek için gösterildi⁺ T hücreleri bu gelişmiş miyelin özgü bağışıklık yönetmelik. Bu nedenle, bu iletişim kuralını roman hedeflerinden gelecekteki inceleme ve CD8 Qa 1 kısıtlı işlevler için yararlıdır⁺ T hücreleri.

Giriş

Qa-1 (MHC-IB) molekülleri farelerde klasik olmayan MHC kompleksi 1b grubuna aittir. Onun insan homolog olan HLA-E. Önceki kanıt Qa-1 molekülleri önemli biyolojik fonksiyonları var göstermiştir. İlk olarak, Qa-1 molekülleri hücreler yapısal ve işlevsel bütünlüğü için Etüt önemli bir rol oynamaktadır. Bu bağlamda, Qa-1 moleküllerin hücrenin normal işlevi izlemek için çeşitli stratejiler gelişmiştir. Bu tür bir strateji Qa-1 moleküllerine formu kompleksleri ile işlenmiş lideri peptid (epitope), endoplazmik retikulum¹klasik MHC-IA molekülleri üzerinden işlenir Yani Qa-1 determinant değiştirici (Qdm) sağlar. Daha sonra bu Qa-1/Qdm komplekslerin bir hücre yüzeyinde görüntülemek ve NK hücreleri üzerinde inhibitör NKG2A reseptörleri etkinlik²öldürme NK etkisizleştirmek için bağlayın. MHC-IA molekülleri ifade kaybolursa, bir hücre (örneğin bir malign hücre) NK²öldürmek için duyarlı hale gelir. Diğer strateji yeni Qa-1/epitope kompleksleri eksik DOKUNUN (taşıyıcı antijen işleme ile ilişkili) bir hücre yüzeyinde oluşturmak Qa-1 molekülleri sağlar³ ve/veya ERAAP (ile ilişkili endoplazmik retikulum aminopeptidaz antijen işleme)⁴ (her iki eksiklikleri Malign hücrelerde genellikle oluşur). Bu yeni Qa-1/epitope komplekslerin ifade hücre daha sonra tanınan ve epitope özel Qa 1 kısıtlı CD8 tarafından ortadan⁺ T hücreleri. İkinci olarak, Qa-1 molekül immün yönetmelik⁵ikna etmek. Bu bağlamda, Qa-1/epitope kompleksleri CD8 uyarmak gösterilmiştir⁺ immün aracılı hasara öz-doku^{6,7,8 önlenmesi için önemlidir düzenleyici T (Treg) hücreleri ,9,10}. Üçüncü olarak, Qa 1 kısıtlı CD8⁺ Treg hücreler viral enfeksiyon¹¹karşı bağışıklık yanıtı sınırlamak için gösterilmiştir.

Bu nedenle, belirli büyütme epitope özgü Qa-1-restrictred CD8⁺ T hücreleri anormal hücreler ortadan kaldırılması, bağışıklık düzenleme geliştirme ve büyüklüğü kontrolünü potansiyel olarak umut verici bir strateji olduğunu immün yanıt-e doğru virüs kaynaklı. Süre o olup olmadığını tespit değil büyütme epitope özgü CD8 Qa 1 kısıtlı,⁺ T hücreleri bağışıklık gözetim geliştirmek ve virüs kaynaklı bağışıklık yanıtı sınırlamak, laboratuarlarımızda ve diğerleri bu açıkça göstermiştir Qa-1 epitopları ile bağışıklama Qa 1 kısıtlı CD8 fonksiyonu çoğaltmak⁺ Treg hücreler belirli patojenik otoimmün CD4 için⁺ T hücreleri CD4 verimli denetimine lider,⁺ T Hücre-aracılı otoimmün hastalıklarda bir hayvan çeşitli modeller deneysel Alerjik ensefalomiyelit (insan multipl skleroz bir hayvan modeli)^6,10gibi kollajen kaynaklı artrit (bir hayvan modeli insan romatoid artrit)⁷, ve obez olmayan diyabet (bir hayvan modeli insan tip 1 diyabet)⁸. Buna ek olarak, biz bir doku özgü Qa-1 epitope ile bağışıklama immün aracılı iltihap o doku CD8 büyütme ile ayrıntılı denetim yol açar keşfettim⁺ Treg hücreler¹². Preklinik çalışmalar yukarıdaki başarıları Qa-1 epitope bağışıklama immün aracılı doku özgü hastalıkların tedavisi için ve potansiyel DOKUNUN eksiklikleri ile ilişkili diğer hastalıkların tedavisi için tam bir değerlendirme için bir ihtiyaç gösterir ve ERAAP.

Buna göre güvenilir ve hızlı bir şekilde Qa-1 epitopları bir protein çözümleyebilirsiniz bir teknoloji için bir talep vardır. Bu bağlamda, biyolojik olarak önemli Qa-1 epitopları sınırlı sayıda tarif edilmiştir. Bu Qa-1 epitopları çoğunu serendipitously CD8 çalışma sırasında tespit edildi⁺ T hücre yanıt bakteri¹³, hücre DOKUNUN³' te eksik, hücreleri ERAAP⁴' te eksik ve EAE^{6, neden olan hücreleri 9}. Bu nedenle, bir yüksek üretilen iş teknik biyolojik olarak önemli Qa-1 epitopları tanımlanmış bir protein tanımlanması için arzu edilir. Aşağıda, biz fonksiyonel Qa-1 epitopları Qa-1-resrticted CD8 kullanarak bir protein haritalar örtüşen bir peptid (OLP) Kütüphane strateji tanımlarlar⁺ T hücre hatları belirli bir protein OLP Havuzu (OLP_pool) için.

Protokol

Tüm deneylerin bir kurumsal hayvan bakım ve kullanım Protokolü hayvan bakım ve El Paso ve Loma Linda Üniversitesi'nde Texas Üniversitesi'nde kullanım Komitesi tarafından onaylanmış uygun olarak yapıldı.

1. nesil bir Protein tüm uzunluğu kapsayan bir OLP Kütüphane

1. Bir OLP kitaplığı içindeki tüm peptidler 15-mer uzunluğu ve bitişik peptidler 11 amino asitler tarafından üst üste tasarlayın.
   Not: MOG OLP çalışmada, MOG habercisi [Mus musculus] dizisi NCBI protein bu bağlantıyı takip ederek veritabanından: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_034944. Bildirilen Qa-1 (HLA-E) epitopları çoğunu sinyal peptidler (örneğin Qdm¹) yerleşmişti çünkü gerçekleştirdiği sinyal ve olgun peptidler, MOG habercisi (247 amino asitler), kullanıldı. Öyle ki iki bitişik peptidler 11 amino asitler (şekil 1) tarafından üst üste onun N-terminus adlı başlayarak, 15-mer peptidler dizisi tespit edilmiştir. Bu nedenle, tam 59 OLPs 247 amino asit MOG habercisi tespit edilmiştir. Ancak, son OLP 12'den 15-mer protein uzunluğuna bağlı olarak değişebilir. Buna ek olarak, biz ve diğerleri 15-mer peptidler, dendritik hücreler (DC) veya makrofajlar, eklendiğinde verimli olabilir göstermiştir çünkü biz 15-mer kitaplığı seçin epitopları tanıma içine CD8 tarafından işlenmiş^{14,15+ T hücreleri} .
2. Her bireysel peptid ticari olarak satın alabilirsiniz. 5 mg-peptid tarama için yeterli olmalıdır. OLPs ve kesilmiş peptidler (adım 6.1) desalted peptidler (yaklaşık 50-%70 saflık olduğunu) olabilir. Tetramer nesil için ve gelecekteki biyolojik analizleri için kullanılacak en iyi peptid (adım 6.2) saflığı olmalıdır > % 90. Peptidler steril koşul altında yeniden oluşturma.
3. 50 mg/mL bireysel peptid hisse senetleri % 100 DMSO içinde olun. Her peptid, 5 mg eklemek için DMSO 100 μL her tüpün içine karıştırın ve peptidler-20 ° C'de depolayın Bu hisse senetleri CD8 üretimi için bir OLP_pool stok yapmak için kullanılan⁺ T hücre hatları OLP_pool için reaktif. Buna ek olarak, bu hisse senetleri de 10 mg/mL bireysel peptid hisse senetleri Qa-1-sınırlı yanıt olarak bir OLP_pool reaktif CD8 uyarmak için her bireysel peptid yeteneklerini belirlemek için yapmak için kullanılmasını⁺ T hücre satırı.
4. Taze bir tüpün içine her peptid eşit bir hacmi ekleyerek yapmak OLP_pool hisse senedi. Bu OLP_pool hisse senedi % 100 DMSO içerir. MOG OLP çalışmada, 59 OLPs¹²vardı. Bu nedenle, OLP_pool her peptid konsantrasyon 847.46 μg/mL (50 mg/mL ÷ 59) oldu.
5. 10 mg/mL bireysel peptid stokları sulandrarak (5 x) yapmak steril H₂O bir V-alt 96-şey plaka (Bu hisselerin % 20 DMSO içerir) 50 mg/mL stoklarımızda. Çünkü her bireysel peptid Qa-1-sınırlı tepki belirlenmesi 8 veya 12 kanal çok kanallı pipet kullanarak bir 96-şey tabak içinde gerçekleştirilecek bu stokları bir 96-şey tabak içinde olun.
   Not: OLPs ve kesilmiş peptidler, dahil olmak üzere tüm peptidler, ya bir V-alt 96-şey tabak içinde seyreltilmiş veya peptid Kütüphane tarama 96-şey levha bir çok kanallı pipet kullanarak gerçekleştirilen bu yana bir 96-iyi örnek raf 1 mL tüpler ile dolu. Bir peptid sulandırmak zor yoksa 1 N NaOH damla peptid dağıtılması yardımcı olmak akıllıca ekleyin.

2. Astar k^b-/- D^b-/- CD8⁺ OLP_pool Geniş puls K T hücrelerle^b-/- D^b-/- dendritik hücreler (DC).

Not: İki büyük Qa-1 gen vardır: biri Qa-1^birve diğer Qa-1^b. Akademik araştırmalar için yaygın olarak kullanılan hayvanlar beri örneğin C57BL/6 ve Balb/c fare, carry Qa-1^b, bu iletişim kuralı için eşleme Qa-1^b epitopları bir protein ile ilgili yordamı açıklamaktadır. CD8⁺ T bu protokol için kullanılan hücre K saf^b-/-D^b-/- hangi CD8 (C57BL/6 arka plan) farelerde⁺ T hücreleri Qa-1 de dahil olmak üzere çoğunlukla klasik olmayan MHC-IB moleküller tarafından kısıtlanmış.

1. Kemik iliği türevi DCs yukarıda açıklanan¹²olarak üretmek.
   1. Kısaca, RPMI-10 Orta (% 10 fetal sığır serum, 5.5 x 10^-5 M 2-mercaptoethanol, 1 mM sodyum pyruvate ve 0,1 mM gerekli olmayan amino asit ile takıma RPMI 1640) kemik iliği tek hücre süspansiyonlar (1 x 10⁶ hücre/mL) kültür 10 U/mL Il-4 ve 100 U/mL GM-CSF 37 ° c, % 5 CO₂6-şey plaka (4 mL/de) içeren.
   2. İki gün sonra yapışık olmayan hücreleri dikkatli bir şekilde çıkarın ve taze medya ve sitokinler ekleyin.
   3. Hücreleri başka bir iki gün sonra kültür, taze medya ve sitokinler yeni bir 6-şey plaka içeren yapışık olmayan hücreler aktarın.
   4. Hücreleri başka bir iki gün boyunca kültür ve taze medya ve LPS içeren sitokinler ile doldurulan (0.1 µg / DCs etkinleştirmek için mL).
   5. 24 saat sonra deneyler için DCs toplamak.
2. DCs 3000 rad ile ışınlatayım.
   1. Alternatif olarak, mitomycin C ile DCs (5 x 10⁷ hücre/mL) tedavi (50 μg/mL) PBS 20 dk. 37 ° C'de RPMI-0 (serum olmadan RPMI 1640) tüp (~ 12 mL) doldurun ve bir masa üstü santrifüj vasıl 300 x g. atma supernatants ve düşmanla 10 min için hücreleri spin eklemek t çamaşır yordamı iki kez daha. Bu üç yıkama kritik mitomycin C herhangi bir eser miktarda CD8 yanıt inhibe çünkü DC-T hücre ortak kültürü sırasında⁺ T hücreleri.
3. DC konsantrasyonu 5 x 10⁶ hücre/ml serum serbest bir ortamda (5.5 x 10^-5 M 2-mercaptoethanol, 1 mM sodyum pyruvate ve 0,1 mM gerekli olmayan amino asit ile takıma AIM-V serum-Alerjik orta) ayarlayın.
4. Öyle ki son DMSO konsantrasyonu % 0,5 (200 x) olacak % 100 DMSO, DC'ler için içeren OLP_pool hisse senedi çözüm ekleyin. MOG OLP çalışmada, OLP_pool her OLP konsantrasyonu 847.46 μg/mL vardı; Bu nedenle her OLP DC kültüründe son konsantrasyonu 4.2 μg/mL (847.46 μg/mL ÷ 200) oldu.

Ancak, hücre kültüründe DMSO konsantrasyonu % 1'den az olduğu sürece bu konsantrasyon 100 μg/mL kadar ölçeklendirilebilir.

3 h için oda sıcaklığında DCs kuluçkaya ve hücreleri nazikçe her 15 dakika çalkalanır.

Bu kuluçka döneminde CD8 arındırmak⁺ T hücre hasat dalak veya lenf düğümleri k^b-/-D^b-/- ticari CD8 kullanarak fare⁺ T hücre arıtma kiti, hücre konsantrasyonu 10 x 10⁶ hücre/ml ayarlayın 50 U/mL İnterlökin 2 (IL-2) ve 7 Il-100 U/mL içeren serum-Alerjik orta.

Şimdi, CD8 ekleyin⁺ T hücreleri içine 48-şey plaka olarak 0.5 mL/iyi (ek 0,5 mL/de Adım 2.8, CD8 son konsantrasyonu OLP_pool Geniş puls DCs, sonra⁺ T hücre-ecek var olmak 5 x 10⁶ hücre/mL).
Not: CD8⁺ T hücreleri fare dalak ve lenf bezleri saf üreticisi tarafından sağlanan öğretim takip ederek CD8 pozitif izolasyon Kit kullanarak. CD8⁺ T hücreleri elde boncuk ücretsizdir.

OLP_pool Geniş puls DC 2 x 10⁶ hücre/mL serum-Alerjik orta için spin OLP_pool Geniş puls DCs (300 x g, 10 dk) RT. sulandırmak, aşağı ve 0,5 mL/iyi CD8 içerir 48-şey plaka eklemek⁺ T hücreleri (son konsantrasyonu OLP _pool Geniş puls DCs 1 x 10⁶ hücre/mL, CD8 son konsantrasyonu olduğunu⁺ T hücreleri 5 x 10⁶ hücre/mL, son IL-2 bölgedir 25 U/mL ise 7 Il-son konsantrasyonu 50 U/mL). 37 ° C ve % 5 CO₂hücre kültür.

Günde 4, kaldırın ve kültür ortamının yaklaşık 400 μL atmak ve 100 U/mL IL-2 ve 100U/mL 7 Il-her şey için içeren taze serum-Alerjik orta 500 μL ekleyin. 37 ° C ve % 5 CO₂hücreleri kuluçkaya.

Günde 7 veya 8, OLP_pool astarlanmalıdır CD8 yeniden uyarmak⁺ T hücreleri ile OLP_pool.

3. astarlanmalıdır CD8 restimulation⁺ T hücreleri makrofajlar ile geniş puls ile OLP_pool

1. Dört gün önce yeniden OLP_pool astarlanmalıdır CD8 uyarılması⁺ T hücreleri, %2 (v/v) polyacrylamide boncuk çözüm hazırlamak: endotoksin ücretsiz iki kez 20 mL 2 g polyacrylamide boncuk yıkama H₂O veya PBS. Santrifüjü (400 x g) 5 min için tarafından polyacrylamide boncuk cips ve PBS 100 mL resuspend. Otoklav 15 lb/m 20 dk. mağaza oda sıcaklığında.
2. Fareler intraperitoneally ile 1 mL/fare çözümün monosit/makrofajlar geçiş Periton boşluğuna¹⁶içine çekmek için steril % 2 polyacrylamide boncuk enjekte.
3. Dört gün sonra CO₂ doz tarafından hayvanlar kurban.
   1. Steril koşullarda, açılış yeterli olacak bir küçük karın merkezinde açılış kesilmiş 5 mL transfer pipet geçmek için. Transfer pipet RPMI-0 ile doldurun ve pipet delikten karın boşluğuna takabilirsiniz.
   2. Karın boşluğuna pipetting tarafından durulayın. Kadar sıvı karın boşluğuna üzerinden mümkün olduğunca (Periton makrofajlar bunlar) steril tüpe pipet. Durulama adım 4 - 5 kez tekrarlayın.
4. 3000 rad ile Periton makrofajlar ışınlatayım.
   1. Alternatif olarak, Periton makrofajlar (takip adım 2.2 içinde açıklanan yordamı) mitomycin C ile tedavi.
5. Periton makrofajlar 5 x 10⁶ hücre/ml serum-Alerjik orta yoğunlukta ayarlayın. OLP_pool hisse senedi (son DMSO konsantrasyonu ise % 1'den az) ekleyip M-CSF (son toplama 100 U/mL =).
   Not: Bu MOG OLP çalışmada, biz % 0.5 DMSO kullanılır. Böylece, MOG OLP_pool hisse senedi seyreltilmiş 200 x (örneğin 1 MOG hisse senedi Periton makrofajlar 199 μL eklendi OLP_Pool μL) idi. Bu nedenle, her OLP son konsantrasyonu 4.2 μg/mL) idi.
6. 48-iyi doku kültürü tabak içinde 200 μL/iyi (1 x 10⁶ hücreler/de) ekleyin ve 4 h için 37 ° C'de plaka kuluçkaya.
7. Yapışık olmayan hücreleri ve polyacrylamide boncuk nazik yıkama 200 μL/iyi Önceden ısıtılmış RPMI-0 ile çıkarın.
8. Toplamak ve havuzu OLP_pool astarlanmalıdır CD8⁺ T hücreleri adım 2.10. Ayarlamak OLP_pool CD8 astarlanmalıdır⁺ T hücre konsantrasyonu 1 x 10⁶ hücre/ml 25 U/mL IL-2 ve 7 Il-50 U/mL içeren serum-Alerjik orta. 1 mL/iyi OLP_pool Geniş puls Periton makrofajlar içerir 48-şey plaka ekleyin.
9. Dört gün sonra 48-şey plaka ortamda doldurmak. Kaldırmak ve 48-şey kültür tabak içinde kültür ortamının yaklaşık 400 μL atın. Taze serum-Alerjik orta içeren 100 U/ml IL-2 500 μL ve 7 Il-100 U/mL her kuyunun içine ekleyin. 37 ° C ve % 5 CO₂hücre kültür.
10. Üç ya da dört gün sonra incelemek OLP_pool restimulated CD8⁺ T hücreleri OLP_pool özgü, Qa-1-sınırlı yanıt için enzim bağlı immunospot tahlil (ELISPOT) tarafından. Bu noktadan sonra CD8 yeniden uyarmak⁺ T hücreleri her 7-10 gün.
    Not: Makrofajlar OLP_pool astarlanmalıdır CD8 yeniden uyarılması için tercih edilen⁺ T hücreleri. Biz fark CD8⁺ T hücreleri yeniden makrofaj tarafından uyarılan büyüdü DCs içinde vitroiyi.

4. OLP_pool özgü tespiti, Qa-1-sınırlı yanıt olarak bir OLP_pool restimulated CD8 T hücre⁺ hattı

Not: OLP_pool özgü, Qa-1-sınırlı yanıt olarak bir OLP_pool restimulated CD8⁺ T hücre IFNγ salgılanması stimülasyon C1R veya C1R huzurunda OLP_pool tarafından takip tarafından belirlenir. Qa-1^b hücreleri bir IFNγ ELISPOT tahlil kullanarak. C1R hücreleri ticari olarak elde edilebilir. C1R. Qa-1^b hücreleri Qa-1 lentiviral vektör C1R hücrelerle transducing tarafından oluşturulur.

1. 100 μL/iyi bir yakalama anti-IFN-γ antikor (PBS) kaplama arabellekte bir ELISPOT plaka kuyu seyreltilmiş ekleyin.

Mühür ve bir gecede 4 ° c plaka kuluçkaya.

İkinci gününde yakalama anti-IFN-γ antikor içeren kaplama arabellek atın ve 200 μL/iyi-blocking çözüm (serum-Alerjik orta) ekleyin ve oda sıcaklığında 2 h plaka kuluçkaya.

C1R ve C1R ışınlatayım. Qa-1^b hücreleri 9.600 rad ile.

1. Alternatif olarak, C1R ve C1R tedavi. Qa-1^b hücreleri mitomycin dışında o tesir süresi 30 dk olacak adım 2.2 içinde açıklandığı gibi C ile.

C1R ve C1R ayarlayın. 4 x 10⁶ hücre/ml serum serbest ortamda qa-1^b hücreleri.

Plaka engelleme çözümde atmak ve C1R ve C1R ekleyin. Qa-1^b hücreleri 50 μL/iyi (200.000 hücreler/de) ve karışımı.

100 x 50 μL/iyi OLP_pool hisse senedi (serum-Alerjik orta) seyreltilmiş ve düzgün karıştırın. Plaka, oda sıcaklığında 2-3 h için kuluçkaya.

OLP_pool restimulated CD8 ayarlamak⁺ T hücreleri 1-2 x 10⁶ hücre/mL 7 Il-150 U/mL içeren serum-Alerjik orta ve 50 μL/iyi (50.000-100.000 hücreler/de) plaka ekleyin. Plaka (58 x g) 5 dk santrifüj kapasitesi.

37 ° C ve % 5 CO₂ plaka gecede kuluçkaya.

Hücre süspansiyon Aspire edin. Wells deiyonize (DI) su (250 μL/de) ile 2 kere yıkayın. Her yıkama adımında 5 min için emmek kuyu izin.

Yıkama wells 3 kez ile yıkayın tampon (%0,05 Tween20 içeren PBS). Her yıkama adımında 1 dk. için emmek kuyu izin. Yıkama arabellek atmak.

Seyreltme arabellekte (% 10 fetal sığır serum (FBS) içeren PBS) seyreltilmiş algılama antikor 100 μL ekleyin.

Plakayı 2s için oda sıcaklığında kuluçkaya.

Algılama antikor çözüm atın. Wells her yıkama adımında 1 dk. için emmek için 3 kez 250 µL/iyi yıkamak arabellek ı. izin wells ile yıkayın.

100 μL/kuyu, 1: 100 seyreltme seyreltme arabellekte seyreltilmiş enzim eşlenik (Streptavidin-HRP) ekleyin.

Plakalar, oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.

Enzim eşlenik çözüm atın. Wells her yıkama adımında 1 dk. için emmek için 4 kez 250 µL/iyi yıkamak arabellek ı. izin wells ile yıkayın.

Wells 2 kez 250 µL/iyi yıkamak arabellek II (PBS) ile yıkayın.

100 µL substrat çözeltisi (mix 1 damla = 20 µL AEC Kromojen, AEC substrat 1 mL ile), her şey için ekleyin. Monitör spot geliştirme 5 ile 60 dk için.

İstenen sonuçları görünmeye başlar, substrat reaksiyon wells distile su ile yıkayarak durdurur.

Plakayı 2s için oda sıcaklığında kuruması veya kadar tamamen kuru bir gecede. Tabakaların altında plastik tepsi kaldırılması kurutma kolaylaştıracaktır. Analiz edilir kadar tabak mühürlü bir plastik torba karanlık içinde saklayın.

Noktalar el ile diseksiyon mikroskop altında incelemek veya bir ELISPOT plaka okuyucu kullanarak numaralandırır. Şekil 2' deki temsilcisi sonucunu görmek.

5. bireysel peptidler OLP_pool içinde bir OLP_pool özgü CD8 Qa-1 kısıtlı IFN γ salgılanması için teşvik tespiti⁺ T hücre satırı

1. OLP_pool özel bir OLP_pool özgü CD8 Qa-1-restrictred IFN γ salgı teşvik bireysel peptidler belirlemek⁺ T hücre hattı ile yukarıda açıklanan IFN γ ELISPOT tahlil (son konsantrasyon kullanılan her bireysel peptid ELISOPT için tahlil 10 μg/mL'dir). Şekil 3' te temsilcisi sonuçları görürsünüz.
   Not: OLP özel, Qa-1-restircted yanıt en az üç kez C1R huzurunda yanıtının bir yanıt olarak tanımlanır. Qa-1^b hücreleri ama OLP olmadan. MOG OLP çalışma, OLP68, OLP96 ve OLP105 bütün bu ölçüt araya geldi. Bu nedenle, üç OLPs potansiyel Qa-1 epitopları¹² (şekil 3) içerir. Ancak, OLP105 sürekli olarak en güçlü yanıt verdi; Bu nedenle OLP105 ayrıntılı bir analiz yapılır (şekil 4 ve şekil 5)¹².

6. bir OLP_pool özgü CD8 Epitope özgü, Qa 1 kısıtlı yanıtta uyaran bir 15-mer OLP en iyi Qa-1 Epitope tanımlaması⁺ T hücre satırı

1. C - ve N-kesilmiş ölümcül peptidler, şekil 4' te gösterildiği gibi 15-mer OLP sentez.
2. Bir OLP özgü CD8 IFN γ salgı incelemek⁺ uyarıcı CD8 T hücre satır⁺ T hücreleri ile her kesilmiş peptidler hem de ebeveyn 15-mer OLP C1R veya C1R huzurunda. Yukarıdaki kullanarak Qa-1^b hücreleri IFN γ ELISPOT tahlil nitelendirdi. ELISPOT tayini için kullanılan her bireysel peptid son konsantrasyonu 10 μg/mL'dir. Bir peptid durumunda en iyi Qa-1 epitope tanımlanır peptid: 1) sürekli olarak özgün 15-mer peptid, C1R huzurunda karşılaştırıldığında benzer ya da daha sert IFN γ cevap verir. Qa-1^b hücreleri; 2) 8 - 10-mer (tercih edilen 9-mer peptid) arasında olduğu için MHC ilişkili peptid uzunlukları olan-ben molekülleri^15,17. Şekil 5 Temsilcisi sonuçları görmek.

Sonuçlar

Tasarım bir protein tüm uzunluğu kapsayan bir OLP Kütüphanesi

N-terminus adlı bir protein başlamak, her peptid 15 amino asitler (15-mer) olur. Bu nedenle, ilk peptid pozisyonu 1 pozisyona 15 açıklıklı. N-terminus ikinci peptid, 11 amino asit tarafından ilk peptid C-terminus ile çakışıyor. Bu nedenle, ikinci peptid pozisyon 19 konuma 5 açıklıklı. Peptidler C-terminus protein (şekil 1

Tartışmalar

Burada, Qa-1 epitopları bir protein analizi için bir protokol anlatmıştık. Bu iletişim kuralı ile ilgili olarak çeşitli stratejiler de daha önce bildirildi. İlk, allojeneik CD8⁺ T hücre satırları ve klonlar Qdm¹tanımlanması için kullanılmıştır. İkinci olarak, bir sözde Qa-1-bağlama motif Qdm analiz HSP60p216-224 ve TCRBV8.1 epitope^9,18tanımlanması için kullanıldı. Üçüncüsü, bireysel örtüşen p...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
The protein to be analyzed	N/A	N/A	Sequence of the protein can be obtained from NCBI
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	Cat#: D2650 SIGMA	DMSO should be sterile and cell culture tested.
Kb-/-Db-/- mice	The Lackson Laboratory	Stock#: 019995	We used Taconic H2-KbH2-Db doube knockout mice (Cat#: 4215-F and 4215-M) which however are not available anymore.
AIM V Serum Free Medium	ThermoFisher Scientific	Cat#: 12055091
2-mercaptoethanol	ThermoFisher Scientific	Cat#: 21985023
Sodium pyruvate	ThermoFisher Scientific	Cat#: 11360070
Nonessential Amino Acids	ThermoFisher Scientific	Cat#: 11140076
Dynabeads CD8 Positive Isolation Kit	ThermoFisher Scientific	Cat#: 11333D
Bio-Gel P-100	Bio-Rad	Cat#: 150-4171
Phoshate Balanced Solution (PBS)	ThermoFisher Scientific	Cat#: 20012027
Trasfer pipette	Globe Scientific	Mfg#: 137238
Murine M-CSF	PeproTech	Cat#: 315-02
48-well tissue culture plates	USA Scientific	Cat#: CC7682-7548
Corning Costar TC-treated Multiple well Plates, 96-well, V-shaped bottom	Sigma-Aldrich	Cat#: Z372129 Sigma
1ml deep 06-well PP plate, sterile	USA Scientific	Item#: 1896-1110
Recombinant murine IL-2	PeproTech	Cat#: 212-12
Recombinant murine IL-7	PeproTech	Cat#L: 217-17
Capture anti-IFN-γ antibody	BD Biosciences	Cat#: 551881
ELISPOT plate	Sigma-Aldrich	Cat#: S2EM004M99
C1R	ATCC	Cat#: ATCC CRL-1993
C1R.Qa-1b			Custom made (GenBank access#: NM_010398.3)
Qa-1 lentiviral vector	GeneCopoeia	Product#: Mm02955
Detection anti-IFN-γ antibody	BD Biosciences	Cat#: 551881
Tween20	Sigma-Aldrich	Cat#: P9416
Streptavidin-HRP	BD Biosciences	Cat#: BD557630
AEC substrate	BD Biosciences	Cat#: 551951
ImmunoSpot Analyzer	ImmunoSpot		Any immunoSpot analyer should work for this purpose.