تحليل المعادن التي تنتجها هفوب 1.19 وسوس-2 الخلايا باستخدام مجهر إلكتروني مع Microanalysis الأشعة السينية المشتتة الطاقة

Summary

نقدم بروتوكولا لمقارنة حالة المعادن في حويصلات صدر عن اثنين من خطوط الخلية العظام البشرية: هفوب 1.19 وسوس-2. حللت ملفاتهم التمعدن من الأليزارين الأحمر-S (ع-ق) تلطيخ، الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) الخفيفة التصور والتصوير الميكروسكوب الإلكتروني (TEM) الإرسال والطاقة المشتتة الأشعة السينية سليكية (EDX).

Abstract

يعرض هذا الفيديو استخدام مجهر إلكتروني مع الطاقة المشتتة الأشعة السينية سليكية (EDX TEM) مقارنة حالة المعادن في حويصلات صدر عن اثنين من خطوط الخلية العظام البشرية: هفوب 1.19 وساوس-2. هذه خطوط الخلية، بعد العلاج مع حمض الأسكوربيك (أإ)، وبيتا-جليسيروفوسفاتي (β-GP)، الخضوع ترانسديفيرينتييشن أوستيوجينيك كاملة من انتشار التمعدن وتنتج مصفوفة حويصلات (MVs) التي تؤدي إلى نويات الاباتيت في المصفوفة خارج الخلية (ECM).

استناداً إلى تلطيخ الأليزارين الأحمر-S (ع-ق) وتحليل تكوين المعادن في الخلية ليساتيس باستخدام الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) أو في حويصلات استخدام التصوير تيم تليها كوانتيتيشن EDX وتعيين أيون، يمكننا أن نستنتج أن osteosarcoma سوس-2 وأوستيوبلاستيك خلايا هفوب 1.19 تكشف عن ملامح متميزة من التمعدن. سوس-2 الخلايا طاغية أكثر كفاءة من الخلايا هفوب 1.19 وتنتج الرواسب المعدنية الكبيرة التي لا تظهر تحت الأشعة فوق البنفسجية ولكن تشبه هيدروكسيباتيت (ها) في أن لديهم بدائل أكثر من Ca وو.

النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام هذه التقنيات تسمح بنا إلى الاستنتاج بأن عملية تمعدن يختلف تبعاً لنوع الخلية. ونحن نقترح أن أصل وخصائص من حويصلات سلفا على المستوى الخلوي، نوع المعادن.

Introduction

العظام نوع من النسيج الضام، ويتألف من جزأين: العضوية (خلايا وألياف الكولاجين) والمعدنية (مركبات الكالسيوم والفوسفات). العناصر المعدنية الرئيسية في العظام، أباتيتيس¹. أنواع مختلفة من الخلايا المختصة تمعدن في العظام (خلايا الاوستيوبلاستس) والأسنان (أودونتوبلاستس) في الغضروف (تشوندروسيتيس) تنظيم الخطوات الأولية التمعدن بإنتاج بروتينات المصفوفة خارج الخلية (ECM) والإفراج عن مصفوفة حويصلات (MVs) (الشكل 1). MVs هي 100-300 نانومتر القطر الحويصلات التي تتراكم الكالسيوم والفوسفات تيسير التنو الاباتيت وربط الكولاجين^2،3في وقت لاحق. ثم، تتفكك MVs للإفراج عن أباتيتيس إلى الوسط خارج الخلية. لا تزال أباتيتيس تنمو على اتصال بألياف الكولاجين وتشكل مصفوفة العظام. التمعدن تدعمه إمدادات ثابتة من ف_أنا و Ca^{2 +} في الوسط خارج الخلية. بعض البيانات المنشورة مؤخرا الدعم لدينا نموذج^4،5. لا طاغية الأنسجة الرخوة تحت الظروف الفسيولوجية. ومع ذلك، قد يحدث تكلس حمل خارج الرحم تحت الظروف المرضية مثل تكلس الأوعية الدموية³. يمكن أن تنتج خلايا الأوعية الدموية التي تحصل على النمط الظاهري osteoblast MVs حمل نويات أباتيتيس والشروع في تمعدن في طبقات الجدار الآنسي وإينتيمال من الأوعية الدموية. منذ تكلس حمل خارج الرحم تشبه endochondral العادي التمعدن³، فهم الآليات الجزيئية التمعدن العظمى الخلايا وتشوندروسيتيس ينبغي أن توفر بعض القرائن على حمل خارج الرحم تكلس الأنسجة الرخوة التي شكلت.

وينظم وضع أنسجة الهيكل العظمى الإنزيمات المختلفة، عوامل النمو، والمروجين أو مثبطات التمعدن. إجراءات معادية للأنسجة-غير محددة الفوسفاتيز القلوية (طنب) (الشكل 1) واكتونوكليوتيدي بيروفوسفاتاسي/فوسفوديستريس أنا (NPP1)، جنبا إلى جنب مع أنكيرين (عنك)، يتحكم تركيز بيروفوسفات غير العضوية (PP_أنا) ⁶-PP_أنا، مثبط قوية لتشكيل هكتار، وهي تحلل قبل تناب؛ NPP1 هيدروليزيس تريفوسفاتيس النوكليوتيدات لتشكيل PP_أنا بينما الصادرات PP_أنا عنك الخلية إلى إدارة المحتوى في المؤسسة. قد تنظم نسبة Pi/PPi الاباتيت تشكيل^7،8 مع⁹من النتائج المرضية المحتملة.

هو إثراء الغشاء أم في أيون النقل البروتينات التي تيسر الترسيب الأولية من الكالسيوم والفوسفات داخل MVs أثناء عملية نويات (الشكل 1). نقل الفوسفات 1 (PiT) يساعد على إدماج ف_أنا ولدت في الفضاء بيريفيسيكولار إلى^10،MVs¹¹. يمكن إشراك أنيكسينس في الربط والنقل من Ca^{2 +} وفي العملية الفيزيائية الحيوية التي يبدأ تمعدن في^12،التجويف المتوسط¹³. أننا نفضل الفرضية، اقترح في وقت سابق التمعدن داخل الحويصلات إينتراسيتوبلاسميك من نويات الداخلية من اباتيت داخل MV قبل انتشاره في^14،ECM¹⁵. وأكد النمذجة في المختبر تحريض Ca^{2 +}/P_أنا مجمعات تشكيل في بروتيوليبوسوميس مصنوعة من PS و AnxA5¹⁶. قد يشير هذا إلى أن التراكم من Ca^{2 +}, ف_أنا، تمتلك مجمعات AnxA5 و PS في اطواف الدهن من مثل زغيبات ميمبرانيسريبريسينت لب نويات (NC) الاباتيت داخل ممقابل أنيكسينس وطنب أيضا ملزمة الكولاجين القدرات التي قد تكون مفيدة في وضع MVs على طول ألياف الكولاجين، وتنشيط الدعوة التمعدن في إدارة المحتوى في المؤسسة. أ فتوين وأوستيوبونتين (أوبن)¹⁷, معروفة كمثبطات لتشكيل الاباتيت التي قد تبطئ انتشار التمعدن على سقالة collagenous. التنو ونشر الأحداث متميزة، والسابق السابق لهذا الأخير، وكلاهما قد تكون ذات صلة بعملية تمعدن المرضية.

لاكتشاف كيف يمكن تغيير كيمياء مجمعات فوسفات الكالسيوم التمعدن الفسيولوجية وتكلس حمل خارج الرحم، من الضروري تحديد المعادن التي تنتجها الخلايا. أباتيتيس مجموعة من الكالسيوم والفوسفات التي تحتوي على معادن مع كريستال العام وحدة خلية الصيغة Ca₁₀(ص₄)₆X₂، حيث X = Cl، واو، أوهايو. كانت تصنف على النحو التالي¹⁸: فلوراباتيتي (FA) Ca₁₀(ص₄)₆و₂،₁₀(ص₄) تشلوراباتيتي (CA) Ca₆Cl₂ وهيدروكسيباتيت (ها) Ca₁₀(ص. ب₄ )₆(OH)₂.

اختيار خطوط الخلايا أوستيوبلاست للحث على تشكيل المعادن حاسم، حيث يسلك كل خط خلية مكانة متميزة التمعدن. في هذا التقرير، قارنا التنو المعادن بنموذجين الخلية البشرية المحددة التمعدن: هفوب أوستيوبلاستيك 1.19 الخلايا والخلايا osteosarcoma ساوس-2. Osteosarcoma المستمدة من الخلايا تستخدم عادة كنماذج أوستيوبلاستيك وخلايا سوس-2 حافظوا على الطابع أوستيوبلاستيك الأكثر نضجاً¹⁹ بينما خلايا غير متمايزة هفوب الأجنة البشرية تستخدم على نطاق واسع كنموذج لطبيعية أوستيوبلاستيك ²⁰من التفريق. حللت ملفاتهم التمعدن بأساليب مختلفة: تلطيخ الأليزارين الأحمر-S (ع-ق) والأشعة فوق البنفسجية التصور الضوء (الأشعة فوق البنفسجية) وانتقال تصوير الميكروسكوب الإلكتروني (TEM)، الأشعة السينية المشتتة الطاقة سليكية (EDX) كوانتيتيشن وأيون رسم الخرائط. ميزة ال EDX عبر التقنيات البديلة المستخدمة في الدراسات السابقة أنه يعطي النتائج الكمية والنوعية لاستبدال أيون في الاباتيت بلورات^4،5،21. وكان الهدف الشامل المتمثل في استخدام ال EDX للعثور على طريقة بسيطة للتصوير والتحديد الكمي لتوزيع أيونات Ca، و و Cl في المعادن المختلفة من أنواع مختلفة من الخلايا خلال مراحل متميزة من عملية تعدين. هذا الأسلوب قد استخدمت بنجاح، على سبيل المثال، لرصد تفاعل جسيمات نانوية الزنك مع المواد الكيميائية تتعايش وآثارها مجتمعة على الكائنات المائية²². وفي دراسة أخرى، اتسمت فوتوكاتاليست نحاس في مواد التيتانيوم في محلول مائي على نطاق واسع عن طريق قياس الطيف الكتلي بلازما الحث يقترن الانبعاثات الضوئية (برنامج المقارنات الدولية-OES)، فيسيسوربشن N2 (الرهان)، زرد، تجاه الأشعة فوق البنفسجية DRS، قدم الأشعة تحت الحمراء، رامان التحليل الطيفي، وال EDX والفوتوكهروكيميائيه قياسات²³. وكان هدفنا المقارنة بين الأصل وخصائص من حويصلات والمعادن في اثنين من خطوط الخلية لفهم الآلية التي يتحكم التمعدن خلال التمايز العظمى.

الشكل 1 . مخطط للخطوات الأولية التمعدن في الخلايا العظمى التي تنطوي على تركيب البروتينات المصفوفة خارج الخلية (ECM) والإفراج عن مصفوفة حويصلات (MVs) من الغشاء. MVs تتراكم الكالسيوم من خلال عمل الكالسيوم ملزم البروتينات وأننيكسينس والفوسفات، عن طريق العمل نقل الفوسفات غير العضوي (PiT) متبوعاً بنشاط الأنسجة غير محددة القلوية الفوسفاتيز (تناب)، الذي ديفوسفوريلاتيس PP_أنا إلى ف_أنا، مما ييسر التنو الاباتيت. ثم MVs تتفكك والإفراج عن أباتيتيس إلى الوسط خارج الخلية. هو استمرار التمعدن بإمدادات ثابتة من ف_أنا و Ca^{2 +} في المتوسط خارج الخلية^4،5. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Protocol

1-الخلية الثقافة والعلاج

1. وضع جميع المواد الضرورية تحت غطاء محرك السيارة الاندفاق الصفحي وتعقيم لهم تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. وسائل الإعلام الثقافة: خليط 1:1 من لحم الخنزير في F12 ودميم وسائل الإعلام مع 2.5 ملم لام الجلوتامين تستكمل مع البنسلين يو/مليلتر 100، 100 ستربتوميسين U/mL، 0.3 ملغ/مل G418 و 10% مصل بقرى الجنين (FBS) (v/v) للجنين البشري هفوب 1.19 SV40 كبيرة تي مستضد transfected خلايا الاوستيوبلاستس، و 5A المتوسطة مكوي مع 1.5 مم L-الجلوتامين تكملة مع 100 يو/مليلتر البنسلين والستربتوميسين يو/مليلتر و 15% 100 FBS (v/v) للخلايا البشرية osteosarcoma سوس-2.
2. الثقافة خلايا سوس-2 في 37 درجة مئوية في جو من 5% والخلايا هفوب 1.19 في 34 درجة مئوية في جو من 5% أول أكسيد الكربون₂ CO_2- نقل الثقافات الخلية، أما الخلايا 1.19 أو سوس-2 هفوب، من الحاضنة إلى هود الاندفاق الصفحي وتغيير في المتوسط إلى 10 مل متوسطة ثقافة جديدة مع FBS.
3. احتضان خلايا دون المنبهات (يستريح الخلايا) أو تحفيز لهم مع 50 ميكروغرام/ملليلتر "حمض الأسكوربيك" (أإ) تليها 7.5 مم β-جليسيروفوسفاتي (β-GP)، أعدت في وقت سابق من الماء عالي النقاوة وتصفيتها من خلال 0.22 ميكرومتر حقنه مرشحات. إضافة المنبهات من أنابيب بلاستيكية ميكروسينتريفوجي على سطح المتوسط الثقافة. بلطف يقلب الطبق الثقافة واحتضان لمدة 7 أيام.

2-الكشف عن المعادن الكالسيوم

1. أغسل الثقافات الخلية مع "المخزن المؤقت للفوسفات المالحة" (برنامج تلفزيوني: 125 ملم كلوريد الصوديوم، 5 ملم بوكل، 10 مم نا₂هبو₄، 1 مم خ₂ص₄، ودرجة الحموضة 7.0).
2. إضافة 5 مل من 2 ٪ (g:100 مل) ع-S في برنامج تلفزيوني، pH 5.0 واحتضان لوحات لمدة 30 دقيقة وصمة عار المعادن.
3. أغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني. بعناية إضافة برنامج تلفزيوني على الحائط صحن، وليس محاولة لتدمير المعادن.
4. مراقبة المعادن الكالسيوم تحت مجهر خفيفة مقلوب والتقاط صور.

3-تصور تحقيقات تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية

1. للخلية ليساتيس، تعامل الثقافات الخلية، أما الراحة أو تحفز لمدة 7 أيام، وفقا لبروتوكول الهضم كولاجيناز²⁴.
2. جمع المتوسطة من الثقافات الخلية وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني.
3. هضم الخلايا مع 3 مل كولاجيناز U/mL 500 في حل من 0.25 م السكروز، 0.12 متر كلوريد الصوديوم، 0.01 م بوكل، و 0.02 م تريس-HCl العازلة، الأس الهيدروجيني 7.45، في 37 درجة مئوية ح 3.
4. ميكانيكيا كشط الخلايا وتحويلها إلى أنابيب بلاستيكية ميكروسينتريفوجي وتمرير عليها 10 مرات عن طريق حقنه ش مل 40 1 مع 0.5 × 16 إبرة.
5. الطرد المركزي في عينات ز × 500 لمدة 5 دقائق.
6. تجاهل المادة طافية وتعليق بيليه الخلية في 500 ميليلتر الاصطناعية الغضروف الليمفاوية (SCL، 100 ملم كلوريد الصوديوم، عيار 12.7 ملم بوكل، مم 0.57 مجكل₂، 1.83 مم ناكو₃ملم 0.57 نة₂بو₄، 5.5 ملم د-الجلوكوز، السكروز 63 ملم، 16.5 ملم حبيس، درجة الحموضة 7.4).
7. نقل هيدروكسيباتيت (ها)، فلوراباتيتي (اتحاد كرة القدم) ومساحيق تشلوراباتيتي (كاليفورنيا) من الزجاجات على ترانسيلوميناتور الأشعة فوق البنفسجية مع ملعقة واستخدامها كعناصر تحكم.
8. نقل ليساتيس الخلية من أنابيب بلاستيكية مع نصائح البلاستيك ووضع بعناية على ترانسيلوميناتور الأشعة فوق البنفسجية.
9. تأخذ الصور تحت المرئية وفوق البنفسجية الخفيفة.

4-إعداد تحقيقات لل EDX

1. إعداد المعادن لتلطيخ السلبية
   1. تعليق 2.5 ملغ المنتجة صناعيا هكتار، كاليفورنيا، واتحاد كرة القدم المعادن²⁵ في 500 ميليلتر من المياه واحتضانها في 37 درجة مئوية في جو من 5% CO₂ لح 1.
   2. تتخذ الشبكات ني مش 300 فورمفار/الكربون من المربع مع الملقط المكافحة الساكنة، ووضع على لوحة متعددة جيدا خزف وإسقاط 10 ميليلتر من المعلقات هكتار، كاليفورنيا، واتحاد كرة القدم في الشبكات.
   3. الجاف للعينات لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
2. إعداد يستريح وحفز الخلايا لتضمين ²⁶
   1. جمع المتوسطة من الثقافات الخلية وغسل الخلايا مع الحساسية الفسيولوجية (PD) متوسطة (125 ملم كلوريد الصوديوم، 5 ملم بوكل، 10 مم NaHCO₃، 1 مم خ₂ص₄، الجلوكوز 10 مم، 20 مم هيبيس، درجة الحموضة 7.4).
   2. إصلاح الخلايا مع 5 مل مزيج جلوتارالديهيدي paraformaldehyde/1% (g:100 مل) (g:100 مل) 3% في 100 ملم فوسفات الصوديوم العازلة، الرقم الهيدروجيني 7.2، عن ح 1 في درجة حرارة الغرفة تحت غطاء الدخان.
   3. تغسل الخلايا مع 5 مل من 100 ملم فوسفات الصوديوم العازلة وإزالة المخزن المؤقت بعد الغسل بلطف.
   4. في غرفة مظلمة، postfix العينات مع 2 مل أكسيد أوزميوم (g:100 مل) 1% في 100 ملم فوسفات الصوديوم العازلة، الرقم الهيدروجيني 7.2، لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة تحت غطاء الدخان.
   5. إزالة أكسيد الازميوم والاستفادة منه.
   6. تغسل الخلايا مع 5 مل من 100 ملم فوسفات الصوديوم العازلة.
   7. ثم يذوي العينات في مختبرين 5 مل من سلسلة الحل الإيثانول متدرج في درجة حرارة الغرفة: 25% (من المجلد) لمدة 5 دقائق، 50% (عن طريق المجلد) لمدة 10 دقائق، 75% (من المجلد) لمدة 15 دقيقة، 90% (بالمجلد) لمدة 20 دقيقة. وأخيراً استخدام الإيثانول المطلقة مرتين واحتضانها ل 30 دقيقة وح 12.
   8. ميكانيكيا تتخلص الخلايا من أطباق بيتري البلاستيك على الثقافة، وجمع في أنابيب بلاستيكية ميكروسينتريفوجي والطرد المركزي العينات من 130 غ س ل 1 دقيقة.
   9. إزالة في supernatants وتعليق الخلايا الموجودة في 1 مل مزيج من راتنج الأبيض LR والايثانول المطلقة بنسبة 1:2 وحدة تخزين.
   10. مزيج جيد من محتوى الأنابيب الزجاجية قبل استعمالها، واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   11. الطرد المركزي العينات من 130 غ س ل 1 دقيقة.
   12. إزالة سوبيرناتانتس وكرر الخطوة السابقة باستخدام 1 مل من 1:1 مزيج من راتنج الأبيض LR والايثانول المطلقة.
   13. يخلط جيدا واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   14. الطرد المركزي العينات من 130 غ س ل 1 دقيقة.
   15. قم بإزالة في سوبيرناتانتس.
   16. وأخيراً، أضف 1 مل راتنج LR الأبيض النقي للعينات مرتين واحتضانها ح 1 في درجة حرارة الغرفة في أنابيب بلاستيكية.
   17. وضع 500 ميكروليتر من كل عينة في كبسولات الجيلاتين.
       ملاحظة: تتم تسمية العينات باستخدام ورقة صغيرة من الورق وقلم رصاص حتى لا تدمر الراتنج التسميات.
   18. إغلاق كبسولات الجيلاتين ووضعها في أنابيب بلاستيكية ميكروسينتريفوجي والطرد المركزي في غ س 130 لمدة 1 دقيقة في دوار البديل التدريجي.
   19. إزالة الكبسولات من الأنابيب البلاستيكية باستخدام مضخة فراغ.
   20. نقل العينات إلى الفرن وبلمره في 56 درجة مئوية ح 48.
   21. إعداد الكتل بتصاعد لهم في الحامل والتشذيب لهم للهرم.
   22. وضع الحامل أولتراميكروتومي وإرفاق السكين الترا 45° الماس وملئه بالمياه؛ تذكر أن تقوم بتنظيف الشفرة من فقاعات الهواء عرضية.
   23. ثم قطع المقاطع (700 Å) باستخدام سكين الماس إلى حمام المياه.
   24. مجموعة قصاصات باستخدام جفن الأبقار ومكان لهم على الجانب اللامع من 300 فورمفار/الكربون مش الشبكة ني وتجفيفها.
   25. تحضير خلات اليورانيل 2.5% (من المجلد) في الإيثانول المطلقة في الظلام تحت غطاء دخان. تبقى خلات اليورانيل في حاوية رائدة، وتذكر أن لا تلتقط الرواسب.
   26. في غرفة مظلمة، كونتيرستاين الشبكات أباتيتيس الاصطناعية وعينات الخلايا مع خلات اليورانيل 2.5% (من المجلد) في الإيثانول لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة تحت غطاء الدخان.
   27. غسل الشبكات في الإيثانول 50% (حسب المجلد)، ثم في المياه وجاف في درجة حرارة الغرفة ح 24. وأخيراً، وضع الشبكات في المربع.

5-تيم-EDX التحليل

1. تيم التصوير بواسطة مجهر إلكترون انتقال (TEM) مجهزة بكامل نطاق "الأشعة السينية المشتتة الطاقة" سليكية نظام (EDX) و 11 ميجا بكسل الكاميرا
   1. إعداد حامل البريليوم للمراقبة للمعادن والخلايا. استخدام أدوات المكافحة الساكنة.
   2. إزالة زوج مسامير ورفع لوحة البريليوم والغسالة البريليوم بعيداً عن بقية التجنيب.
   3. جبل الشبكة، والجانب اللامع، على الحامل.
   4. وضع الغسالة البريليوم والبريليوم لوحة والمسمار مسامير ربط محكم بعناية.
   5. وضع الحامل في فراغ الغرفة وتشغيل مضخة فراغ.
   6. حالما يتحقق من فراغ، برفق إدراج الحامل في قاعة التصوير وقم بتشغيل الحزمة.
   7. على جهاز العرض الفلورسنت، تعيين المعلمات الفتحة من المجهر. إجراء تصحيح الاستجماتيزم الصورة؛ تعيين التكبير، والتركيز، والإطار؛ والتقاط صور تيم في بير 50، 000 X.
2. وقف التصوير والأشعة السينية سليكية للتحليل الطيفي والتركيبية
   1. إدراج الطاقة المشتتة لكشف "بالأشعة السينية" (EDX) في دائرة التصوير الميكروسكوب الإلكتروني (الجذعية) انتقال المسح الضوئي.
   2. ضبط حدة الصورة في وضع التركيز.
   3. التقاط صور الجذعية في بير 15، 000 X.
   4. حدد نقطة في العينة للأشعة السينية سليكية وجمع الأطياف.
   5. الحصول على البيانات عن طريق جمع كافة الأوزان الذرية لجميع العناصر في الجدول الدوري في العينة (كنسبة 100%)، ومما يدل على المحتوى للعناصر المحددة: كاليفورنيا وو Cl ف (كالذرى %). ثم، حساب نسب Ca أو و Cl إلى ف لكل عينة.
3. تعيين أيون
   1. قم بتحديد عناصر مثل الكالسيوم والفلور والكلور والفوسفور لجعل التعيين أيون وتنفيذ خرائط EDX للعناصر المحددة في العينات.
   2. الحصول على البيانات التي تشير إلى إضفاء الطابع المحلي على تحليل العناصر: كاليفورنيا وو Cl ف (كالذرى في المائة) وحساب التعريب المشارك (في المائة) من كاليفورنيا، و أو Cl مع ف لكل عينة.

النتائج

تيم EDX يسمح للتصوير في المختبر لمصفوفة حويصلات (MVs) الصادرة عن مينيراليزينج الخلايا والمعادن التي تنتجها ممقابل النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام هذه التقنية تثبت أنه يمكن المضي في عملية تمعدن بطريقة مختلفة في أنواع مختلفة من الخلايا. خطوط الخلية اثنين تلقي...

Discussion

في هذه الورقة، وصفناها البروتوكولات للتلوين، تحديد فلوراباتيتي ضوء الأشعة فوق البنفسجية، ق ع وال EDX في المختبر تصوير MVs صدر عن مينيراليزينج الخلايا والمعادن التي تنتجها MVs. فمن الممكن لمعالجة كافة الأساليب المذكورة أعلاه باتباع بعض خطوات استكشاف الأخطاء وإصلاحها الشائعة. وللحص?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Ham’s DMEM/F12 media mixture	PAA	E15-813	1:1, for human fetus hFOB 1.19 SV40 large T antigen transfected osteoblasts (ATCC CRL-11372)
McCoy’s 5A medium	PAA	E82312-0025	for human osteosarcoma Saos-2 cells (ATCC HTB-85)
Antibiotics mixture (penicillin/streptomycin)	Sigma	P0781-100ML	100 U/mL each
G-418	Sigma	68168	0.3 mg/mL
FBS	Gibco	10270	10% for hFOB 1.19 and 15% for Saos-2
AA	Sigma	A-5960	50 µg/mL
ß-GP	Sigma	G9422-100G	7.5 mM
Bio-Gel HTP Gel	Bio-Rad	130-0420	for HA
FA			synthesized by us
CA			synthesized by us
Sodium phosphate buffer Na2HPO4/NaH2PO4 mixture	Sigma	S7907/S8282	0.1 M, pH 7.2
PBS			pH 7.0, prepared by us
AR-S in PBS	Sigma	A5533-25G	0.5 g/100 mL, pH 5.0
Collagenase type IA	Sigma	C2674	500 U/mL
SCL buffer			prepared by us
Deionized wather			produced by us
Ethanol	POCh	BA6480111	absolut 99.8% and solutions 25, 50, 75, 90%
Uranyl acetate in 50% ethanol	Polysciences Inc.	21447-25	0.25 g/10 mL
PD medium			pH 7.4, prepared by us
Fixation mixture (paraformaldehyde/glutaraldehyde)	Sigma	158127/G-6257	3%:1%
Post-fixation OsO4	Sigma	75633	1%
LR White resin in ethanol	Polysciences Inc.	17411-MUNC 500g	1:2, 1:1, 100%
Acetone	CHEMPUR	111024800	pure
Tool
Cryogenic vials	Corning Inc.	430487	1.2 mL
Plastic Petri culture dishes	Falcon	353003	100 mm
Plastic tubes	Falcon	352096 and 352070	15 and 50 mL
Serological pipettes	Falcon and VWR	357521 and 612-3700	1 and 10 mL
Plastic microcentrifuge tubes	Sigma	Z688312 and Z628034	1.5 mL black and 2 mL transparent
Plastic tips	VWR	613-0364, 613-0239 and 613-1050	0.1-10 µL natural, 1-200 µL yellow and 200-1000 µL blue
Plastic racks	Light Labs	A-7055-Z, A-7053-C	green for tubes, orange for micro tubes and blue for TEM probes
Laminar Hera Save	Thermo Scientific Co.	KS12	HEPA filter (H14 according to DIN EN 1822)
Incubators Hera Cell	Thermo Scientific Co.	150	34°C for hFOB 1.19 and 37°C for Saos-2
Fume hood	POLON	WCS-2	for TEM stainings
Glass bottles	SIMAX	1632414501050 and 1632414501100	50 and 100 mL
Quartz glass tubes	SIMAX	638422010100	Ø 10 mm, L 100 mm
Pump	IBS Integra Biosciences	VACUSAFE comfort	for vacuum
Oven	Memmert	UNE 400	56°C
Porcelain multi-well plate	Rosenthal technik	229/12	12 wells
Glass beakers	SIMAX	632417010025	25 mL
Glass bottles	Pocord	DIN22	10 mL
Plastic box	Agar Scientific Ltd.		for darkness
Snap Fit Gelatin Capsules	Agar Scientific Ltd.	G3741	size 1
Formvar/Carbon 300 Mesh Ni grids in box	Agar Scientific Ltd.	S162N3	film on the shiny side
Silicon cell scraper	Sigma	SIAL0010-100EA	size 1.8/25 cm
Syringe with needle	BogMark	007	syringe 1 mL 40 U, needle 0.5 x 16
Syringe	Chirana	CH005L	5 mL
Centrifuge	MPW Medical Instruments	MPW-350R	130 x g and 500 x g
UV transluminator	UVP	M-20	for visible and UV light
Ultramicrotome	LKB	NOVA	700Å sections
Block holder	LKB	E6711	round shape
Diamond knife	DiATOME	Ultra 45°	size 3
Eyelash holder			bovine, prepared by us
Forceps	ROTH	2855.1	antistatic for grids
Spatulas set	ROTH	E286.1	antistatic for powders
Imaging
Inverted Light Microscope	Zeiss with Canon	AxioObserver Z1 equipped with PowerShot G9	Phase contrast, Transmitted light, 20 x objective, RGB filters
Transmission Electron Microscope	TEM Jeol Co. with Oxford Instruments and SiS-Olympus	JEM-1400 TEM equipped with full range INCA Energy Dispersive X-ray microanalysis (EDX) System and 11 Megapixel MORADA G2 camera	magnification 50,000X for TEM and 15,000X for STEM and EDX
Camera body and lenses	Nikon	Nikon D7100 Nikkor AF Micro 105 mm f/2.8D Nikkor AF-S 50 mm f/1.8G Nikkor AF 28 mm f/2.8D	for movie recordings
Microphone	MXL Mics	Tempo	for voice recordings