Análise de minerais produzidos por hFOB 1.19 e Saos-2 células usando microscopia eletrônica de transmissão com energia dispersiva microanálise de raios-x

Resumo

Apresentamos um protocolo para comparar o estado de minerais em vesículas lançadas por duas linhas de células de osso humano: hFOB 1.19 e Saos-2. Seus perfis de mineralização foram analisados por alizarina Red-S (AR-S) coloração, visualização de luz ultravioleta (UV), imagem de microscopia eletrônica (TEM) de transmissão e microanálise de raios-x energia dispersiva (EDX).

Resumo

Este vídeo apresenta o uso da microscopia eletrônica de transmissão com microanálise de raios-x energia dispersiva (EDX-TEM) para comparar o estado de minerais em vesículas lançadas por duas linhas de células de osso humano: hFOB 1.19 e Saos-2. Estas linhas de celular, após o tratamento com ácido ascórbico (AA) e β-glicerofosfato (β-GP), submetido a completa transdiferenciação celular osteogênico de proliferação de mineralização e produzir vesículas de matriz (MVs) que desencadeiam a nucleação de apatita na matriz extracelular (ECM).

Com base na coloração de vermelho de alizarina-S (AR-S) e análise da composição dos minerais em lisados celulares usando luz ultravioleta (UV) ou em vesículas utilizando imagens TEM seguida por íon mapeamento e quantificação de EDX, podemos inferir que osteossarcoma Saos-2 e osteoblásticas células hFOB 1.19 revelaram perfis distintos de mineralização. SAOS-2 células mineralize mais eficientemente do que as células hFOB 1.19 e produzem maiores depósitos minerais que não são visíveis sob luz UV, mas são semelhantes a hidroxiapatita (HA), em que eles têm mais Ca e F substituições.

Os resultados obtidos com estas técnicas nos permitem concluir que o processo de mineralização difere dependendo do tipo de célula. Propomos que, a nível celular, a origem e as propriedades das vesículas predeterminar o tipo de minerais.

Introdução

Osso é um tipo de tecido conjuntivo composto de duas partes: orgânico (células e fibras colágenas) e mineral (compostos de cálcio e fosfato). Os principais componentes minerais nos ossos são apatites¹. Diferentes tipos de células competentes de mineralização no osso (osteoblastos), dentes (odontoblastos) e cartilagem (condrócitos) regulam os passos iniciais da mineralização através da produção de proteínas da matriz extracelular (ECM) e liberando a matriz vesículas (MVs) (Figura 1). MVs são vesículas de diâmetro de nm de 100-300 que acumulam cálcio e fosfato, facilitando a nucleação de apatita e posteriormente vincular a colágeno^2,3. Em seguida, MVs desintegrar-se para liberar apatites para o meio extracelular. Os apatites continuam a crescer em contato com as fibras de colágeno e formam a matriz óssea. A mineralização é sustentada pela oferta constante de P_eu e Ca^{2 +} no meio extracelular. Alguns dados publicados recentemente apoiar nosso modelo^4,5. Tecidos moles não mineralize sob condições fisiológicas. No entanto, calcificação ectópica pode ocorrer sob condições patológicas como calcificação vascular³. Células vasculares que adquirem o fenótipo de osteoblastos podem produzir MVs que induzem a nucleação de apatites e iniciar a mineralização nas camadas da parede medial e da íntima dos vasos sanguíneos. Desde calcificação ectópica se assemelham a endocondral normal mineralização³, compreender os mecanismos moleculares da mineralização das células ósseas e condrócitos devem fornecer algumas pistas sobre gravidez ectópica calcificação dos tecidos moles que são formada.

O desenvolvimento dos tecidos esqueléticos é regulado por diversas enzimas, fatores de crescimento e promotores ou inibidores de mineralização. A ação antagonista de tecido-inespecíficos da fosfatase alcalina (TNAP) (Figura 1) e ectonucleotide pyrophosphatase/fosfodiesterase eu (NPP1), juntamente com ankyrin (ANK), controla a concentração de pirofosfato inorgânico (PP_eu) ⁶. PP_eu, um potente inibidor da formação de HA, é hidrolisado por TNAP; NPP1 hidrolisa trifosfatos de nucleotídeos para formar PP_eu enquanto ANK exporta-PP_eu da célula para o ECM. A proporção de Pi/PPi pode regular apatita formação^7,8 , com possíveis consequências patológicas⁹.

A membrana de MV é rico em proteínas de transporte de íons que facilitam a precipitação inicial do cálcio e fosfato dentro os MVs durante o processo de nucleação (Figura 1). O transportador de fosfato 1 (PiT) ajuda a incorporar P_eu gerados no espaço perivesicular para o MVs^10,11. Anexinas podem estar envolvidas na ligação e transporte de Ca^{2 +} e no processo de Biofísica que inicia a mineralização na MV lúmen^12,13. Favorecemos a hipótese, sugerida anteriormente, para mineralização dentro de vesículas intracitoplasmática de nucleação interna de apatita dentro o MV antes de sua propagação na ECM^14,15. Modelagem em vitro confirmou a indução de Ca^{2 +}/ p_eu complexos formação em proteoliposomes feitas de PS e AnxA5¹⁶. Isso pode indicar que a acumulação de Ca^{2 +}, P_eu, AnxA5 e PS complexos em balsas lipídicas de membranesrepresent microvilli-como o núcleo de nucleação (NC) de apatita dentro Mvs anexinas e TNAP também possuem ligação de colágeno capacidades que podem ser úteis na colocação de MVs ao longo de fibras de colagénio e, para estimular a propagação da mineralização em ECM. Fetuin A e osteopontin (OPN)¹⁷, são conhecidos como inibidores da formação de apatita que pode abrandar a propagação de mineralização no cadafalso colágenas. Nucleação e propagação são eventos distintos, o primeiro anterior a último, e ambos podem ser relevantes para o processo de mineralização patológica.

Para descobrir como a química de complexos de fosfato de cálcio pode alterar mineralização fisiológica e calcificação ectópica, é necessário identificar os minerais produzidos por células. Apatites são um grupo de cálcio e fosfato contendo minerais com cristal geral unidade célula fórmula Ca₁₀(PO₄)₆X₂, onde X = Cl, F, OH. Eles são classificados como segue¹⁸: fluorapatita (FA) Ca₁₀(PO₄)₆F₂, chlorapatite (CA) Ca₁₀(PO₄)₆Cl₂ e hidroxiapatita (HA) Ca₁₀(PO₄ )₆(OH)₂.

A escolha de linhas de células osteoblast para induzir a formação de minerais é crucial, pois cada linha celular apresenta um perfil distinto de mineralização. Neste relatório, nós comparamos a nucleação de minerais por dois modelos de célula selecionada humana de mineralização: células osteoblásticas hFOB 1.19 e osteossarcoma Saos-2 células. Osteossarcoma-derivado de células são comumente usadas como modelos osteoblásticas e Saos-2 células têm preservado o caráter osteoblástica mais maduro¹⁹ enquanto células indiferenciadas hFOB fetal humano são amplamente utilizadas como um modelo para o normal osteoblástica diferenciação de²⁰. Seus perfis de mineralização foram analisados por métodos diferentes: coloração vermelho de alizarina-S (AR-S), ultravioleta (UV) luz visualização, imagem de microscopia eletrônica (TEM) de transmissão, energia dispersiva raio-x (EDX) de microanálise quantificação da e íon mapeamento. A vantagem da temperatura-EDX sobre alternativas técnicas utilizadas em estudos anteriores é que dá resultados quantitativos e qualitativos de substituição iônica em cristais de apatita a^4,5,21. O objetivo geral de usar TEM-EDX foi encontrar um método simples para geração de imagens e quantificação da distribuição dos íons Ca, F e Cl em vários minerais de diferentes tipos de células durante estágios distintos do processo de mineralização. Este método tem sido utilizado com sucesso, por exemplo, para monitorar a interação de nanopartículas de zinco com produtos químicos coexistentes e seus efeitos combinados em organismos aquáticos²². Em outro estudo, um photocatalyst cobre em materiais de titânio em solução aquosa foi extensivamente caracterizado por espectrometria de emissão óptica de plasma indutivo (ICP-OES), physisorption N2 (BET), XRD, DRS UV-vis, FT-IR, Raman espectroscopia, TEM-EDX e photoelectrochemical medidas²³. Nosso objetivo foi comparar a origem e propriedades de vesículas e minerais em duas linhas de celular para entender o mecanismo que controla a mineralização durante a diferenciação óssea.

Figura 1 . Esquema das etapas iniciais de mineralização em células ósseas envolvendo a síntese de proteínas da matriz extracelular (ECM) e a liberação das vesículas de matriz (MVs) da membrana. MVs acumulam cálcio através da ação de proteínas de ligação de cálcio, anexinas e fosfato, através da ação do transportador de fosfato inorgânico (PiT) seguido pela actividade de tecido não-específica da fosfatase alcalina (TNAP), que dephosphorylates PP_eu P_eu, facilitando assim a nucleação de apatita. Em seguida, MVs desintegrar-se e liberar apatites para o meio extracelular. A mineralização é sustentada pela oferta constante de P_eu e Ca^{2 +} no meio extracelular^4,5. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

1. cultura e tratamento da pilha

1. Coloque todo o material necessário, sob a capa de fluxo laminar e esterilizá-los sob luz UV. Os meios de cultura são: uma mistura 1:1 de presunto é mídia F12 e DMEM com 2,5 mM L-glutamina suplementado com 100 penicilina U/mL, 100 U/mL estreptomicina, 0,3 mg/mL G418 e 10% de soro Fetal bovino (FBS) (v/v) para antígeno grande do T de feto humano hFOB 1.19 SV40 transfectadas osteoblastos e meio de 5A McCoy com 1,5 mM L-glutamina suplementado com 100 penicilina U/mL, 100 U/mL Estreptomicina e 15% FBS (v/v) para as células humanas osteossarcoma Saos-2.
2. Cultura de células hFOB 1.19 34 ° c numa atmosfera de 5% de CO₂ e células Saos-2 a 37 ° C numa atmosfera de 5% CO_2. Transferência de culturas de células, células de 1.19 ou Saos-2 ou hFOB, da incubadora para o bairro de fluxo laminar e mudar o médio a 10 mL de meio de cultura fresco com FBS.
3. Incubar as células sem estimuladores (células de descanso) ou estimulá-los com 50 µ g/mL ácido ascórbico (AA) seguido de 7,5 mM β-glicerofosfato (β-GP), preparado anteriormente em água ultrapura e filtrada através de filtros de seringa 0,22 µm. Adicione os estimuladores de tubos de plástico microcentrifuga sobre a superfície do meio de cultura. Suavemente agitar o prato de cultura e incubar durante 7 dias.

2. detecção de minerais de cálcio

1. Lave as culturas de células com salina de tampão fosfato (PBS: 125 mM de NaCl, 5 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1mm KH₂PO₄, pH 7,0).
2. Adicionar 5 mL de 2% (g:100 mL) AR-S em PBS, pH 5,0 e incubar as placas durante 30 min manchar os minerais.
3. Lavar 3 vezes com PBS. Cuidadosamente adicionar PBS para a parede de prato, não tente destruir os minerais.
4. Observar minerais cálcio sob um microscópio invertido e tirar fotos.

3. visualização das sondas sob luz UV

1. Para lisados celulares, trate as culturas de células, ou descansando ou estimulada por 7 dias, de acordo com a digestão de colagenase protocolo²⁴.
2. Coletar o meio de culturas de células e lavar as células com PBS.
3. Digeri as células com 3 mL de 500 colagenase U/mL em uma solução de 0,25 M de sacarose, 0.12 M NaCl, 0,01 M KCl e buffer de 0,02 M Tris-HCl, pH 7,45, a 37 ° C por 3 h.
4. Raspar as células mecanicamente, transferi-los para tubos de plástico microcentrifuga e passá-las 10 vezes através de uma seringa de U 1 mL 40 com 0,5 × 16 de agulha.
5. Centrifugar as amostras a 500 × g por 5 min.
6. Desprezar o sobrenadante e suspender o centrifugado em 500 µ l de linfa de cartilagem sintética (SCL, 100 mM de NaCl, 12,7 mM KCl, 0,57 mM MgCl₂, 1,83 mM NaHCO₃, 0,57 mM NaH₂PO₄, 5,5 mM D-glicose, sacarose 63mm, 16,5 mM Hepes, pH 7,4).
7. Transferir a hidroxiapatita (HA), fluorapatita (FA) e chlorapatite (CA) pós de garrafas em transiluminador de UV com uma espátula e utilizar como controles.
8. Transferir os lisados celulares dos tubos de plástico com pontas de plástico e coloque cuidadosamente o transiluminador UV.
9. Tire fotos sob visível e UV luz.

4. preparação de sondas de temperatura-EDX

1. Preparação de minerais para a coloração negativa
   1. Suspender a 2,5 mg de produzido sinteticamente minerais HA, CA e FA²⁵ em 500 µ l de água deionizada e incubar a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO₂ por 1h.
   2. Tirar grades Formvar/carbono 300 Mesh Ni da caixa com pinça antiestática, coloque em um prato de porcelana multi bem e soltar 10 µ l de suspensões HA, CA e FA nas grades.
   3. Seca as amostras por 30 min à temperatura ambiente.
2. Preparação de descansar e estimulou as células para a incorporação de ²⁶
   1. Coletar o médio das culturas de células e lavar as células com o meio de dessensibilização fisiológicos (PD) (125 mM de NaCl, 5 mM KCL, 10mm NaHCO₃, 1mm KH₂PO₄, glicose 10 mM, 20 mM HEPES, pH 7,4).
   2. Fixe as células com 5 mL de uma mistura de 3% (g:100 mL) paraformaldehyde/1% (g:100 mL) de glutaraldeído em tampão de fosfato de sódio de 100 mM, pH 7,2, por 1h à temperatura ambiente sob a coifa.
   3. Lavar as células com 5 mL de tampão de fosfato de sódio de 100 mM e com cuidado, remova o tampão após a lavagem.
   4. No quarto escuro, o postfix as amostras com 2 mL de tetróxido de ósmio (g:100 mL) 1% em tampão de fosfato de sódio de 100 mM, pH 7,2, por 20 min em temperatura ambiente sob a coifa.
   5. Remover o tetróxido de ósmio e utilizá-lo.
   6. Lave as células com 5 mL de tampão de fosfato de sódio de 100 mM.
   7. Então, desidrata-se as amostras em alíquotas de 5 mL de uma série de solução gradual do etanol à temperatura ambiente: 25% (Vol.) por 5 min, 50% (Vol.) por 10 min, 75% (Vol.) por 15 min, 90% (Vol.) por 20 min. Finalmente, usar etanol absoluto duas vezes e incube por 30 min e 12 h.
   8. Mecanicamente, raspar as células desde os plástico Petri pratos de cultura, coletar em tubos de plástico microcentrifuga e centrifugar as amostras a 130 x g por 1 min.
   9. Remover os sobrenadantes e suspender as células em 1 mL de uma mistura de resina de LR White e etanol absoluto em uma relação de volume de 1:2.
   10. Misture bem o conteúdo dos tubos de vidro antes do uso e incube por 30 min à temperatura ambiente.
   11. Centrifugar as amostras a 130 x g por 1 min.
   12. Remover os sobrenadantes e repita a etapa anterior usando 1 mL de uma mistura 1:1 de resina LR White e etanol absoluto.
   13. Misture bem e incube por 30 min à temperatura ambiente.
   14. Centrifugar as amostras a 130 x g por 1 min.
   15. Remova os sobrenadantes.
   16. Finalmente, adicionar 1 mL de resina pura LR White para as amostras de duas vezes e incubar por 1h à temperatura ambiente em tubos de plástico.
   17. Coloque 500 µ l de cada amostra em cápsulas de gelatina.
       Nota: As amostras são etiquetadas usando uma pequena folha de papel e um lápis para que a resina não destrói os rótulos.
   18. Fechar as cápsulas de gelatina, coloque-os em tubos de plástico microcentrifuga e centrifugar a 130 x g por 1 min em um rotor basculante.
   19. Remova as cápsulas dos tubos de plástico usando uma bomba de vácuo.
   20. Mover as amostras para o forno e polimerizar a 56 ° C por 48 h.
   21. Prepare os blocos montá-los no suporte e apará-los para a pirâmide.
   22. Colocar o suporte a ultramicrotome, anexar a faca Ultra 45° de diamante e preenchê-lo com água desionizada; Lembre-se de limpar a lâmina de bolhas de ar incidentais.
   23. Então corte seções (700 Å) usando a faca de diamante para o banho de água desionizada.
   24. Definir as sobras usando cílios bovina e lugá-los no lado brilhante da Formvar/carbono 300 malha grade Ni e secá-las.
   25. Prepare o acetato de uranilo 2.5% (Vol.) em etanol absoluto no escuro sob uma coifa. Manter o acetato de uranilo em um recipiente de chumbo e lembre-se de não pegar o sedimento.
   26. No quarto escuro, counterstain as grades de apatites sintéticos e amostras de células com 2,5% (Vol.) acetato de uranilo em etanol por 20 min em temperatura ambiente sob a coifa.
   27. Lavar as grades em etanol a 50% (Vol.), em seguida em água desionizada e secar em temperatura ambiente por 24 h. Finalmente, coloque as grelhas na caixa.

5. TEM EDX-análise

1. Imagem latente TEM por um microscópio eletrônico de transmissão (TEM) equipado com microanálise de raios x dispersiva energia gama completa (EDX) sistema e 11 Megapixel câmera
   1. Prepare-se para a observação de minerais e células um titular de berílio. Use ferramentas antiestáticas.
   2. Remover o par de parafusos e levantar a placa de berílio e a arruela de berílio longe do resto do retentor.
   3. Monte a grade, lado brilhante, no suporte.
   4. Cuidadosamente coloque a arruela de berílio e placa de berílio e Dane-se firmemente os parafusos de fixação.
   5. Coloque o suporte para a câmara de vácuo e ligue a bomba de vácuo.
   6. Depois de um vácuo é alcançado, delicadamente, encaixe o suporte da câmara de imagem e ligue o feixe.
   7. No monitor fluorescente, defina os parâmetros de abertura do microscópio. Realizar correção de astigmatismo de imagem; definir o zoom, foco e quadro; e tirar fotos TEM em uma ampliação de 50, 000 X.
2. Imagem latente do tronco e microanálise de raios-x para análise espectral e composição
   1. Insira o detector de raios-x (EDX) energia dispersiva na microscopia eletrônica (tronco) de imagens câmara de varredura transmissão.
   2. Ajuste a nitidez da imagem no modo de foco.
   3. Tirar fotos de haste em uma ampliação de 15, 000 X.
   4. Selecione um ponto da amostra para microanálise de raios-x e coletar espectros.
   5. Obter dados, somando todos os pesos de atômica para todos os elementos da tabela periódica na amostra (como 100%) e significando o conteúdo de elementos selecionados: Ca, F, Cl e P (como % atômica). Em seguida, calcule os rácios de Ca, F ou Cl de P para cada amostra.
3. Mapeamento de íon
   1. Selecione elementos como cálcio, flúor, cloro e fósforo para fazer o mapeamento de íon e executar mapas EDX dos elementos selecionados nas amostras.
   2. Obter dados indicando a localização dos elementos analisados: Ca, F, Cl e P (como % atômica) e calcular a localização co (em %) do Ca, F ou Cl com P para cada amostra.

Resultados

Temperatura-EDX permite obter a imagem em vitro das vesículas de matriz (MVs) lançadas pela mineralização de células e de minerais produzidos por Mvs. os resultados obtidos usando esta técnica demonstram que o processo de mineralização pode proceder de forma diferente em vários tipos de células. As linhas de duas células receberam o mesmo tratamento de transdiferenciação celular osteoblástica, ainda estimulados Saos-2 células mais eficientemente do que hFO...

Discussão

No jornal atual, descrevemos os protocolos de coloração, identificação de luz UV de fluorapatita AR-S e TEM-EDX em vitro imagem de MVs lançados pela mineralização de células e de minerais produzidos por MVs. É possível abordar todos os métodos mencionados acima, seguindo algumas etapas de solução de problemas comuns. A fim de obter resultados óptimos, vários passos críticos devem ser realizados com cuidado. Primeiro, é melhor adicionar AA (que é ácida) seguido por β-GP (que é alcali...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Ham’s DMEM/F12 media mixture	PAA	E15-813	1:1, for human fetus hFOB 1.19 SV40 large T antigen transfected osteoblasts (ATCC CRL-11372)
McCoy’s 5A medium	PAA	E82312-0025	for human osteosarcoma Saos-2 cells (ATCC HTB-85)
Antibiotics mixture (penicillin/streptomycin)	Sigma	P0781-100ML	100 U/mL each
G-418	Sigma	68168	0.3 mg/mL
FBS	Gibco	10270	10% for hFOB 1.19 and 15% for Saos-2
AA	Sigma	A-5960	50 µg/mL
ß-GP	Sigma	G9422-100G	7.5 mM
Bio-Gel HTP Gel	Bio-Rad	130-0420	for HA
FA			synthesized by us
CA			synthesized by us
Sodium phosphate buffer Na2HPO4/NaH2PO4 mixture	Sigma	S7907/S8282	0.1 M, pH 7.2
PBS			pH 7.0, prepared by us
AR-S in PBS	Sigma	A5533-25G	0.5 g/100 mL, pH 5.0
Collagenase type IA	Sigma	C2674	500 U/mL
SCL buffer			prepared by us
Deionized wather			produced by us
Ethanol	POCh	BA6480111	absolut 99.8% and solutions 25, 50, 75, 90%
Uranyl acetate in 50% ethanol	Polysciences Inc.	21447-25	0.25 g/10 mL
PD medium			pH 7.4, prepared by us
Fixation mixture (paraformaldehyde/glutaraldehyde)	Sigma	158127/G-6257	3%:1%
Post-fixation OsO4	Sigma	75633	1%
LR White resin in ethanol	Polysciences Inc.	17411-MUNC 500g	1:2, 1:1, 100%
Acetone	CHEMPUR	111024800	pure
Tool
Cryogenic vials	Corning Inc.	430487	1.2 mL
Plastic Petri culture dishes	Falcon	353003	100 mm
Plastic tubes	Falcon	352096 and 352070	15 and 50 mL
Serological pipettes	Falcon and VWR	357521 and 612-3700	1 and 10 mL
Plastic microcentrifuge tubes	Sigma	Z688312 and Z628034	1.5 mL black and 2 mL transparent
Plastic tips	VWR	613-0364, 613-0239 and 613-1050	0.1-10 µL natural, 1-200 µL yellow and 200-1000 µL blue
Plastic racks	Light Labs	A-7055-Z, A-7053-C	green for tubes, orange for micro tubes and blue for TEM probes
Laminar Hera Save	Thermo Scientific Co.	KS12	HEPA filter (H14 according to DIN EN 1822)
Incubators Hera Cell	Thermo Scientific Co.	150	34°C for hFOB 1.19 and 37°C for Saos-2
Fume hood	POLON	WCS-2	for TEM stainings
Glass bottles	SIMAX	1632414501050 and 1632414501100	50 and 100 mL
Quartz glass tubes	SIMAX	638422010100	Ø 10 mm, L 100 mm
Pump	IBS Integra Biosciences	VACUSAFE comfort	for vacuum
Oven	Memmert	UNE 400	56°C
Porcelain multi-well plate	Rosenthal technik	229/12	12 wells
Glass beakers	SIMAX	632417010025	25 mL
Glass bottles	Pocord	DIN22	10 mL
Plastic box	Agar Scientific Ltd.		for darkness
Snap Fit Gelatin Capsules	Agar Scientific Ltd.	G3741	size 1
Formvar/Carbon 300 Mesh Ni grids in box	Agar Scientific Ltd.	S162N3	film on the shiny side
Silicon cell scraper	Sigma	SIAL0010-100EA	size 1.8/25 cm
Syringe with needle	BogMark	007	syringe 1 mL 40 U, needle 0.5 x 16
Syringe	Chirana	CH005L	5 mL
Centrifuge	MPW Medical Instruments	MPW-350R	130 x g and 500 x g
UV transluminator	UVP	M-20	for visible and UV light
Ultramicrotome	LKB	NOVA	700Å sections
Block holder	LKB	E6711	round shape
Diamond knife	DiATOME	Ultra 45°	size 3
Eyelash holder			bovine, prepared by us
Forceps	ROTH	2855.1	antistatic for grids
Spatulas set	ROTH	E286.1	antistatic for powders
Imaging
Inverted Light Microscope	Zeiss with Canon	AxioObserver Z1 equipped with PowerShot G9	Phase contrast, Transmitted light, 20 x objective, RGB filters
Transmission Electron Microscope	TEM Jeol Co. with Oxford Instruments and SiS-Olympus	JEM-1400 TEM equipped with full range INCA Energy Dispersive X-ray microanalysis (EDX) System and 11 Megapixel MORADA G2 camera	magnification 50,000X for TEM and 15,000X for STEM and EDX
Camera body and lenses	Nikon	Nikon D7100 Nikkor AF Micro 105 mm f/2.8D Nikkor AF-S 50 mm f/1.8G Nikkor AF 28 mm f/2.8D	for movie recordings
Microphone	MXL Mics	Tempo	for voice recordings