Mineraller hFOB 1.19 tarafından üretilen ve SAO'lar-2 hücreleri kullanarak transmisyon elektron mikroskobu ile enerji dağıtıcı x-ışını Microanalysis Analizi

Özet

Biz iki kemiğin insan hücre hatları ile yayımlanan veziküller mineraller durumunu karşılaştırmak için bir iletişim kuralı mevcut: hFOB 1.19 ve SAO'lar-2. Qafqaz profillerini Alizarin Red-boyama, ultraviyole (UV) ışık görselleştirme, transmisyon elektron mikroskobu (TEM) görüntüleme ve enerji dağıtıcı x-ışını microanalysis (EDX) tarafından S (AR-S) analiz edildi.

Özet

Bu video enerji dağıtıcı x-ışını microanalysis (TEM-EDX) iki kemiğin insan hücre hatları ile yayımlanan veziküller mineraller durumunu karşılaştırmak için iletim elektron mikroskobu kullanımını sunar: hFOB 1.19 ve SAO'lar-2. Askorbik asit (AA) ve β-gliserofosfat (β-GP) ile tedavi sonrası bu hücre satırları Qafqaz için nükleer silahların yayılmasına karşı gelen tam osteojenik transdifferentiation geçmesi ve apatit çekirdekleşme tetiklemek matris veziküller (MVs) üretmek hücre dışı matriks (ECM).

Alizarin Red-S (AR-S) boyama ve mineraller ultraviyole (UV) ışık kullanarak hücre lysates veya veziküller ardından EDX Nefelometri ve iyon eşleme TEM Imaging'i kullanma kompozisyon analizi dayalı, biz o osteosarkom sonucuna SAO'lar-2 ve osteoblastik hFOB 1.19 hücreler ayrı Qafqaz profilleri ortaya koyuyor. SAO'lar-2 hücreleri hFOB 1.19 hücreleri daha verimli bir şekilde mineralize ve UV ışığı altında görünür olmayan ancak onlar-si olmak daha fazla Ca ve F oyuncu değişikliği hidroksiapatit (HA) açısından benzerdirler büyük maden yatakları üretmek.

Bu teknikleri kullanarak elde edilen sonuçları Qafqaz sürecinin hücre türüne bağlı olarak farklı olduğunu sonuçlandırmak sağlamak. Hücresel düzeyde, kökeni ve veziküller özelliklerini mineraller türünü kazanmakla, öneriyorum.

Giriş

Kemik bağ dokusu iki kısımdan oluşur bir türüdür: organik (hücreleri ve kollajen lifler) ve mineral (kalsiyum ve fosfat bileşikleri). Ana mineral kemikleri apatitler¹bileşenleridir. Qafqaz yetkili hücreler kemik (dokusunu), diş (odontoblasts) ve kıkırdak (kondrosit) farklı türde hücre dışı matriks (ECM) proteinler üreten ve matris bırakmadan Qafqaz ilk adımları düzenleyen veziküller (MVs) (Şekil 1). MVs kalsiyum ve fosfat apatit çekirdekleşme kolaylaştırmak biriken ve daha sonra bağlamak kollajen^2,3' e 100-300 nm çapında veziküller vardır. Sonra hücre dışı ortama apatitler serbest bırakmak için MVs parçalanır. Apatitler kollajen lifleri ile temas halinde büyümeye ve kemik matris oluşturmak devam. Qafqaz P_ben ve Ca^{2 +} ekstraselüler ortamda sürekli tedarik tarafından sürekli. Kısa bir süre önce bazı veriler bizim model^4,5desteği. Yumuşak dokular fizyolojik koşullar altında mineralize değil. Ancak, ektopik kalsifikasyon vasküler kalsifikasyon³gibi patolojik şartlar altında meydana gelebilir. Osteoblast fenotip elde damar hücreleri apatitler çekirdekleşme teşvik ve kan damarlarının duvar medial ve intimal katmanlarındaki Qafqaz başlatmak MVs üretebilir. Ektopik kalsifikasyon beri normal endochondral Qafqaz³Qafqaz kemik hücreleri moleküler mekanizmaları anlama, benzer ve kondrosit bazı ipuçları vardır yumuşak dokuların ektopik önkol kemiğinde kireçlenme. sağlamalıdır kurdu.

İskelet doku gelişimi çeşitli enzimler, büyüme faktörleri ve rehberleri veya Qafqaz inhibitörleri tarafından düzenlenir. Uzlaşmaz eylem doku ettiren alkalen fosfataz (TNAP) (Şekil 1) ve ectonucleotide pyrophosphatase/fosfodiesteraz ben (NPP1), ankyrin (ANK), ile birlikte inorganik pirofosfat (PP_ben) konsantrasyonu kontrol eder ⁶. PP_ben, HA oluşumu, güçlü bir inhibitörü TNAP; hidrolize NPP1 nükleotit trifosfatlar arasında ANK PP_ben için ECM hücreden verir iken PP_ben oluşturmak üzere hidrolize. Pi/ÜFE oranı apatit oluşumu^7,8 olası patolojik sonuçları⁹ile düzenleyen.

MV membran çekirdekleşme sürecinde (Şekil 1) kalsiyum ve fosfat MVs içinde yağış ilk kolaylaştırmak iyon taşıma proteinlerde zenginleştirilmiştir. Fosfat ışınlama 1 (çukur) MVs^10,11perivesicular uzayda oluşturulan P_ben dahil etmek için yardımcı olur. Annexins bağlama ve Ca^{2 +} ulaşım ve Qafqaz MV lümen^12,13' te başlattığı biyofiziksel süreç içinde tutulabilir. Biz daha önce apatit ECM^14,15dakika sonra onun yayılma önce MV içinde iç çekirdekleşme intrasitoplazmik keseleri içinde Qafqaz için önerilen hipotez, iyilik. Vitro modelleme indüksiyon Ca^{2 +}/P_ben kompleksleri oluşumu PS ve AnxA5¹⁶yapılan proteoliposomes doğruladı. Bu o birikimi gösteriyor olabilir sahip Ca^{2 +}, P_ben, lipid sallar, microvilli gibi membranesrepresent (NC) çekirdekleşme özünü apatit MVs. Annexins ve TNAP içinde AnxA5 ve PS kompleksleri ayrıca kollajen bağlayıcı kapasiteleri MVs kollajen lifleri boyunca koyarak ve ECM Qafqaz yayılmasını teşvik edici olarak yararlı olabilir. Fetuin A ve osteopontin (OPN)¹⁷, Qafqaz kolajen iskele üzerinde yayılmasını yavaşlatmak apatit oluşumu inhibitörleri olarak bilinir. Çekirdekleşme ve yayılma farklı olaylar, ikincisi, önceki eski vardır ve her ikisi de patolojik Qafqaz işlemi için uygun olmayabilir.

Kalsiyum fosfat kompleksleri Kimya fizyolojik Qafqaz ve ektopik kalsifikasyon nasıl değişebilir keşfetmek için hücreleri tarafından üretilen mineraller tanımlamak gereklidir. Apatitler kalsiyum ve fosfat genel kristal birim hücre formülü Ca₁₀(PO₄)₆X₂ile mineraller içeren bir grup, burada X = Cl, F, OH. ¹⁸aşağıdaki gibi sınıflandırılır: fluorapatite (FA) Ca₁₀(PO₄)₆F₂, chlorapatite (CA) Ca₁₀(PO₄)₆Cl₂ ve hidroksiapatit (HA) Ca₁₀(PO₄ )₆(OH)₂.

Her hücre kültürünü Qafqaz ayrı bir profil sergileyen bu yana osteoblast hücre hatları seçimi mineral oluşumu ikna etmek için çok önemlidir. Bu raporda, Qafqaz iki insan hücre modelleri tarafından mineraller çekirdekleşme karşılaştırıldığında: osteoblastik hFOB 1.19 hücreleri ve SAO'lar-2 osteosarkom hücreleri. Osteosarkom kaynaklı hücreler osteoblastik modelleri olarak yaygın olarak kullanılır ve farklılaşmamış insan fetal hFOB hücreler yaygın olarak normal osteoblastik bir model olarak kullanılır iken SAO'lar-2 hücreleri en olgun osteoblastik karakter¹⁹ korunmuş farklılaşma²⁰. Qafqaz profillerini farklı yöntemlerle analiz edildi: Alizarin Red-S (AR-S) boyama, ultraviyole (UV) ışık görselleştirme, transmisyon elektron mikroskobu (TEM) görüntü, enerji dağıtıcı x-ışını microanalysis (EDX) Nefelometri ve iyon eşleme. TEM-EDX avantaj önceki çalışmalarda kullanılan alternatif teknikleri bu apatit kristallerinin^4,5,21' iyon değiştirme nicel ve nitel sonuçlar veren şeydir. TEM-EDX kullanarak genel amacı görüntüleme ve miktar hücreler farklı türdeki çeşitli mineraller Ca, F ve Cl iyonu dağıtım Qafqaz sürecin farklı aşamalarında için basit bir yöntem bulmak oldu. Bu yöntem başarılı bir şekilde, örneğin, coexisting kimyasallar ile çinko nano tanecikleri ve Sucul organizmalar²²kombine etkileri etkileşimi izlemek için kullanılmıştır. Başka bir çalışmada, bir bakır photocatalyst sulu çözüm titanyum malzemeleri hakkında kapsamlı İndüktif Eşleşmiş Plazma optik emisyon spektrometresi (ICP-OES), N2 physisorption (bahis), ile karakterize edildi XRD, UV-vis DRS, FT-IR, Raman Spektroskopi, TEM-EDX ve fotoelektrokimyasal ölçümler²³. Amacımız kökeni ve veziküller ve mineraller Qafqaz kemik farklılaşma sırasında kontrol mekanizmasını anlamak için iki hücre satırı özelliklerini karşılaştırmak için oldu.

Resim 1 . Qafqaz kemik hücreleri içeren hücre dışı matriks (ECM) protein sentezi ve membran matris veziküller (MVs) sürümünden ilk adımların düzenini. MVs kalsiyum kalsiyum bağlayıcı proteinler, annexins ve inorganik fosfat ışınlama (çukur) eylem yoluyla hangi dephosphorylates doku non-spesifik alkalen fosfataz (TNAP), etkinlik tarafından takip fosfat eylem yoluyla birikir PP_ben böylece apatit çekirdekleşme kolaylaştırmak P_ben. O zaman, MVs parçalanır ve hücre dışı ortama apatitler bırakın. Qafqaz P_ben ve Ca^{2 +} hücre dışı orta^4,5sabit tedarik tarafından sürekli. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Protokol

1. hücre kültür ve tedavi

1. Laminar akış başlık altında tüm gerekli malzemeleri koymak ve onları UV ışık altında sterilize. Kültür Medya: 1:1 karışımı insan fetusu hFOB 1.19 SV40 büyük T antijen transfected için jambon F12 ve DMEM medya ile 2.5 mM L-glutamin 100 U/mL penisilin, 100 U/mL streptomisin, 0.3 mg/mL G418 ve % 10 ile Fetal sığır Serum (FBS) (v/v) desteklenen değil dokusunu ve 1.5 mM L-glutamin 100 U/mL penisilin, 100 U/mL streptomisin ve % 15 ile takviye ile McCoy'un 5A orta FBS (v/v) insan osteosarkom SAO'lar-2 hücreleri için.
2. Kültür bir atmosferde % 5 CO₂ 34 ° C'de hFOB 1.19 hücreleri ve SAO'lar-2 hücreleri 37 ° c % 5'lik bir atmosferde CO_2. Kuluçka makinesi laminar akış hood için hücre kültürleri, her iki hFOB 1.19 veya SAO'lar-2 hücreleri, transfer ve orta 10 mL taze kültür orta FBS ile değiştirin.
3. Uyarıcılar (resting hücreleri) olmayan hücreler kuluçkaya veya onları 50 µg/mL askorbik asit (AA) 7.5 mM β-Ultrasaf Su daha önce hazırlanan ve 0,22 µm şırınga filtreler aracılığıyla filtre gliserofosfat (β-GP), ardından ile teşvik. Plastik microcentrifuge tüpler kültür ortamının yüzeyine gelen uyarıcılar ekleyin. Yavaşça kültür çanak karıştırın ve 7 gün boyunca kuluçkaya.

2. kalsiyum mineraller tespiti

1. Hücre kültürleri fosfat tampon tuzlu su ile yıkamak (PBS: 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1 mM KH₂PO₄, pH 7,0).
2. %2 (g:100 mL) 5 mL ekleyin AR-S PBS, pH 5,0 ve plakalar mineraller leke 30 dk için kuluçkaya.
3. 3 kez PBS ile yıkayın. Dikkatle PBS çanak duvara ekleyin, mineraller yok değil çalışın.
4. Kalsiyum mineraller bir ters ışık mikroskobu altında gözlemlemek ve fotoğraf çekmek.

3. görsel olarak UV ışık altında probları

1. Hücre lysates için hücre kültürleri, dinlenme ya da 7 gün için uyarılmış göre collagenase sindirim Protokolü²⁴tedavi.
2. Orta hücre kültürleri toplamak ve PBS hücrelerle yıkayın.
3. 3 mL 500 U/mL collagenase 0.25 M sukroz, 0,12 M NaCl, 0.01 M KCl ve 0,02 M Tris-HCl tampon, pH 7,45, 37 ° c 3 h için bir çözümde hücrelerle sindirmek.
4. Mekanik olarak hücreleri kazımak, onları plastik microcentrifuge tüpler için aktarmak ve 0,5 × 16 iğne ile 1 mL 40 U şırınga ile 10 kat geçirin.
5. 500 × g 5 min için de örnekler santrifüj kapasitesi.
6. Süpernatant atın ve hücre Pelet sentetik kıkırdak lenf (SCL, 100 mM NaCl, 12,7 mM KCl, 0,57 mM MgCl₂, 1.83 mM NaHCO₃, 0,57 mM NaH₂PO₄, 5.5 mM D-glikoz, 63 mM sukroz, 16.5 mM Hepes, pH 7,4) 500 µL içinde askıya alma.
7. Hidroksiapatit (HA), fluorapatite (FA) ve chlorapatite (CA) tozlar UV transilluminator şişe bir spatula ile aktarmak ve denetimleri kullanın.
8. Hücre lysates plastik ipuçları ile Plastik tüpler aktarmak ve dikkatle UV transilluminator yer.
9. Görüntü altında görünür ve UV ışık al.

4. probları TEM-EDX için hazırlanması

1. Mineraller negatif boyama için hazırlanması
   1. Sentetik üretilen HA, CA ve SK mineraller²⁵ 2,5 mg deiyonize su 500 µL içinde askıya alma ve % 5 CO₂ 1 h için bir ortamda 37 ° C'de kuluçkaya.
   2. Formvar/karbon 300 Ni kafes ızgaralar kutusundan statik olmayan forseps ile almak, bir porselen çok iyi tabağa yerleştirin ve HA, CA ve SK süspansiyonlar 10 µL ızgaralar üzerinde bırak.
   3. Örnekleri, oda sıcaklığında 30 dk için kuru.
2. İstirahat hazırlık ve teşvik hücreleri ²⁶ katıştırma için
   1. Orta hücre kültürleri toplamak ve fizyolojik Desensitizasyon (PD) Orta (125 mM NaCl, 5 mM KCL, 10 mM NaHCO₃, 1 mM KH₂PO₄, 10 mM glikoz, 20 mM HEPES, pH 7,4) hücrelerle yıkayın.
   2. 5 mL % 3 (g:100 mL) paraformaldehyde/1% (g:100 mL) oxazolidin 100 mM sodyum fosfat tampon pH 7.2, duman başlık altında oda sıcaklığında 1 h için karışımı ile hücreleri tamir.
   3. 5 mL 100 mM sodyum fosfat tampon de hücrelerle yıkama ve arabellek yıkandıktan sonra yavaşça çıkarın.
   4. Karanlık odada 2 mL % 1 (g:100 mL) osmiyum tetroxide 100 mM sodyum fosfat tampon pH 7.2, duman başlık altında oda sıcaklığında 20 dakika örnekleriyle postfix.
   5. Osmiyum tetroxide kaldırın ve kullanmak o.
   6. 5 mL 100 mM sodyum fosfat tampon de hücrelerle yıkayın.
   7. Sonra 5 mL aliquots oda sıcaklığında bir kademeli etanol çözüm serisinin örneklerinde kurutmak: % 25 (VOL) 5 min için % 50 oranında (VOL) 10 dakika için % 75 (VOL) 15 dakika, % 90 (VOL) 20 dk için. Son olarak mutlak etanol iki kez kullanmanız ve 30 dk ve 12 h için kuluçkaya.
   8. Mekanik olarak hücreleri plastik Petri kültür yemeklerini kazımak, plastik microcentrifuge tüpler içine toplamak ve 130 x g 1 dk. için de örnekler santrifüj kapasitesi.
   9. Supernatants kaldırın ve LR beyaz reçine ve hacim oranı 1:2, mutlak etanol karışımından 1 mL hücrelerde askıya alma.
   10. Cam tüpler kullanımdan önce içeriği karıştırın ve oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.
   11. 130 x g 1 dk. için de örnekler santrifüj kapasitesi.
   12. Supernatants çıkarın ve 1 mL LR beyaz reçine ve mutlak etanol 1:1 karışımı kullanarak önceki adımı yineleyin.
   13. Mix iyi ve oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.
   14. 130 x g 1 dk. için de örnekler santrifüj kapasitesi.
   15. Supernatants kaldırın.
   16. Son olarak, 1 mL saf LR beyaz reçine örnekleri için iki kez ekleyin ve Plastik tüpler içinde oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.
   17. Her örneğinin 500 µL jelatin kapsül yerleştirin.
       Not: Örnekleri reçine etiketleri yok etmez küçük bir yaprak kağıt ve bir kalem kullanılarak etiketlenir.
   18. Jelatin kapsül kapatın, plastik microcentrifuge tüpler içine koydum ve 130 x g 1dk swing-out Open End için de santrifüj kapasitesi.
   19. Kapsüller bir vakum pompası ile Plastik tüpler kaldırın.
   20. Örnekleri için fırın taşımak ve 48 h için 56 ° C'de polimerize.
   21. Bloklar onları yuvasına montaj ve onları Piramide süsleme hazırlayın.
   22. Sahibi ultramicrotome koymak, elmas Ultra 45 ° bıçak eklemek ve deiyonize su ile doldurun; arızi hava kabarcıkları gelen bıçak temiz unutmayın.
   23. Sonra deiyonize su banyosu üzerine elmas bıçak kullanma bölümlerine (700 Å) kesti.
   24. Ni ızgara sığır kirpik ve onları Formvar/karbon 300 parlak tarafında mesh yer kullanarak artıkları ayarla ve onları kurutun.
   25. 2.5 oranında (VOL) uranyl asetat içinde belgili tanımlık karanlık bir duman başlık altında mutlak etanol içinde hazırlamak. Uranyl asetat kurşun kabında tutun ve tortu açmamanı unutmayın.
   26. Karanlık odada, ızgaralar, sentetik apatitler ve hücre örnekleri ile 2.5 oranında (VOL) uranyl asetat etanol duman başlık altında oda sıcaklığında 20 dakika içinde counterstain.
   27. Kılavuzlar içinde % 50 etanol (vol. tarafından), sonra deiyonize suyla yıkayın ve 24 saat için oda sıcaklığında kuru. Son olarak, ızgaralar ve metin kutusuna koy.

5. TEM-EDX Analizi

1. TEM görüntüleme bir transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile donatılmış tam kapsamlı enerji dağıtıcı x-ışını microanalysis ile (EDX) sistem ve 11 megapiksel kamera
   1. Bir berilyum tutucu mineraller ve hücreleri gözlem için hazırlayın. Antistatik araçları kullanın.
   2. Vida çifti kaldırın ve Asansör berilyum plaka ve berilyum yıkayıcı hizmetkar kalan uzak.
   3. Kılavuz, parlak tarafı, tutucu üzerinde binin.
   4. Dikkatle berilyum yıkayıcı ve berilyum tabak yerleştirin ve sabitleme vidaları sıkıca vidalayın.
   5. Sahibi vakum odanın içine koymak ve vakum pompası üzerinde açın.
   6. Bir kez bir vakum elde, yavaşça sahibi görüntüleme odanın içine takın ve denge aletinin üstüne açın.
   7. Floresan monitörde mikroskop diyafram parametrelerini ayarlamak. Görüntü astigmat düzeltmesi gerçekleştirmek; Zum, odaklama ve çerçeve ayarla; ve 50, büyütme oranında TEM fotoğraf çekmek 000 X.
2. KÖK görüntüleme ve x-ışını microanalysis spektral ve kompozisyon analizi için
   1. Enerji dağıtıcı x-ışını (EDX) dedektörü tarama transmisyon elektron mikroskobu (kök) görüntüleme odanın içine yerleştirin.
   2. Odak modu görüntü keskinliğini ayarlamak.
   3. KÖK görüntüler 15, büyütme oranında tutar 000 X.
   4. X-ışını microanalysis için örnek bir nokta seçin ve spectra toplamak.
   5. Örnek (% 100) olarak periyodik tabloda tüm öğeler için tüm atom ağırlıklarının özetliyor ve seçili öğeleri içeriğini belirten veri elde etmek: Ca, F, Cl ve P (olarak atomik %). Sonra her örnek için Ca, F veya Cl p oranları hesaplamak.
3. İyon eşleme
   1. Kalsiyum, Flor, klor ve iyon eşleme yapmak ve EDX haritalar seçilen öğelerin örnekleri gerçekleştirmek için fosfor gibi öğeleri seçin.
   2. Verileri analiz öğeleri lokalizasyonu belirtmek suretiyle elde etmek: Ca, F, Cl ve P (olarak atomik %) ve Co lokalizasyonu (% olarak) Ca, F veya Cl P ile her örnek için hesaplar.

Sonuçlar

TEM-EDX matris veziküller (MVs) hücreleri mineralizing tarafından yayımlanan ve Qafqaz sürecinin farklı şekilde devam edebilirsiniz bu tekniği kullanarak elde edilen sonuçları göstermek Mvs tarafından üretilen mineral vitro görüntüleme sağlar hücreleri çeşitli türleri. İki hücre satırları aynı osteoblastik transdifferentiation tedavi alınan henüz AR-S tarafından kanıtlanan uyarılan SAO'lar-2 hücreleri 1,19 dokusunu, hFOB çok daha etkili b...

Tartışmalar

Geçerli kağıt AR-S için boyama, UV ışık fluorapatite tanımlaması iletişim kurallarını açıkladığımız ve TEM-EDX vitro görüntüleme hücreleri mineralizing tarafından yayımlanan MVs ve minerallerin MVs. tarafından üretilen Tüm yöntemleri ortak bazı sorun giderme adımlarını takip ederek yukarıda belirtilen adrese mümkündür. En iyi sonuçları elde etmek için birkaç önemli adımlar dikkatle yapılmalıdır. İlk olarak, (asidik olan) AA kültür ortamının pH 7.4 koruma...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Ham’s DMEM/F12 media mixture	PAA	E15-813	1:1, for human fetus hFOB 1.19 SV40 large T antigen transfected osteoblasts (ATCC CRL-11372)
McCoy’s 5A medium	PAA	E82312-0025	for human osteosarcoma Saos-2 cells (ATCC HTB-85)
Antibiotics mixture (penicillin/streptomycin)	Sigma	P0781-100ML	100 U/mL each
G-418	Sigma	68168	0.3 mg/mL
FBS	Gibco	10270	10% for hFOB 1.19 and 15% for Saos-2
AA	Sigma	A-5960	50 µg/mL
ß-GP	Sigma	G9422-100G	7.5 mM
Bio-Gel HTP Gel	Bio-Rad	130-0420	for HA
FA			synthesized by us
CA			synthesized by us
Sodium phosphate buffer Na2HPO4/NaH2PO4 mixture	Sigma	S7907/S8282	0.1 M, pH 7.2
PBS			pH 7.0, prepared by us
AR-S in PBS	Sigma	A5533-25G	0.5 g/100 mL, pH 5.0
Collagenase type IA	Sigma	C2674	500 U/mL
SCL buffer			prepared by us
Deionized wather			produced by us
Ethanol	POCh	BA6480111	absolut 99.8% and solutions 25, 50, 75, 90%
Uranyl acetate in 50% ethanol	Polysciences Inc.	21447-25	0.25 g/10 mL
PD medium			pH 7.4, prepared by us
Fixation mixture (paraformaldehyde/glutaraldehyde)	Sigma	158127/G-6257	3%:1%
Post-fixation OsO4	Sigma	75633	1%
LR White resin in ethanol	Polysciences Inc.	17411-MUNC 500g	1:2, 1:1, 100%
Acetone	CHEMPUR	111024800	pure
Tool
Cryogenic vials	Corning Inc.	430487	1.2 mL
Plastic Petri culture dishes	Falcon	353003	100 mm
Plastic tubes	Falcon	352096 and 352070	15 and 50 mL
Serological pipettes	Falcon and VWR	357521 and 612-3700	1 and 10 mL
Plastic microcentrifuge tubes	Sigma	Z688312 and Z628034	1.5 mL black and 2 mL transparent
Plastic tips	VWR	613-0364, 613-0239 and 613-1050	0.1-10 µL natural, 1-200 µL yellow and 200-1000 µL blue
Plastic racks	Light Labs	A-7055-Z, A-7053-C	green for tubes, orange for micro tubes and blue for TEM probes
Laminar Hera Save	Thermo Scientific Co.	KS12	HEPA filter (H14 according to DIN EN 1822)
Incubators Hera Cell	Thermo Scientific Co.	150	34°C for hFOB 1.19 and 37°C for Saos-2
Fume hood	POLON	WCS-2	for TEM stainings
Glass bottles	SIMAX	1632414501050 and 1632414501100	50 and 100 mL
Quartz glass tubes	SIMAX	638422010100	Ø 10 mm, L 100 mm
Pump	IBS Integra Biosciences	VACUSAFE comfort	for vacuum
Oven	Memmert	UNE 400	56°C
Porcelain multi-well plate	Rosenthal technik	229/12	12 wells
Glass beakers	SIMAX	632417010025	25 mL
Glass bottles	Pocord	DIN22	10 mL
Plastic box	Agar Scientific Ltd.		for darkness
Snap Fit Gelatin Capsules	Agar Scientific Ltd.	G3741	size 1
Formvar/Carbon 300 Mesh Ni grids in box	Agar Scientific Ltd.	S162N3	film on the shiny side
Silicon cell scraper	Sigma	SIAL0010-100EA	size 1.8/25 cm
Syringe with needle	BogMark	007	syringe 1 mL 40 U, needle 0.5 x 16
Syringe	Chirana	CH005L	5 mL
Centrifuge	MPW Medical Instruments	MPW-350R	130 x g and 500 x g
UV transluminator	UVP	M-20	for visible and UV light
Ultramicrotome	LKB	NOVA	700Å sections
Block holder	LKB	E6711	round shape
Diamond knife	DiATOME	Ultra 45°	size 3
Eyelash holder			bovine, prepared by us
Forceps	ROTH	2855.1	antistatic for grids
Spatulas set	ROTH	E286.1	antistatic for powders
Imaging
Inverted Light Microscope	Zeiss with Canon	AxioObserver Z1 equipped with PowerShot G9	Phase contrast, Transmitted light, 20 x objective, RGB filters
Transmission Electron Microscope	TEM Jeol Co. with Oxford Instruments and SiS-Olympus	JEM-1400 TEM equipped with full range INCA Energy Dispersive X-ray microanalysis (EDX) System and 11 Megapixel MORADA G2 camera	magnification 50,000X for TEM and 15,000X for STEM and EDX
Camera body and lenses	Nikon	Nikon D7100 Nikkor AF Micro 105 mm f/2.8D Nikkor AF-S 50 mm f/1.8G Nikkor AF 28 mm f/2.8D	for movie recordings
Microphone	MXL Mics	Tempo	for voice recordings