JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы представляем протокол для сравнения состояния минералов в везикулы, выпущенное две человеческие кости клеточных линий: hFOB 1.19 и Saos-2. Их минерализации профили были проанализированы по ализарин красный-S (AR-S) окрашивание, ультрафиолетового (УФ) света визуализации, передачи изображений электронной микроскопии (ТЕА) и энергии, дисперсионный рентгеновский микроанализ (EDX).

Аннотация

Это видео представляет использование просвечивающей электронной микроскопии с энергии, дисперсионный рентгеновский микроанализ (ТЕА-EDX) для сравнения состояния минералов в везикулы, выпущенное две человеческие кости клеточных линий: hFOB 1.19 и Saos-2. Эти клеточные линии, после лечения с аскорбиновой кислотой (AA) и β-Глицерофосфат (β-GP), пройти полный Остеогенные transdifferentiation от распространения к минерализации и производим Матричные везикулы (МВС) которые вызывают нуклеации апатита в внеклеточная матрица (ECM).

Основываясь на окрашивание ализарин красный-S (AR-S) и анализ состава минералов в lysates клетки с помощью ультрафиолетового (УФ) света или пузырьки с помощью изображений ТЕА, следуют EDX количественный и Ион сопоставления, можно заключить, что остеосаркома Saos-2 и osteoblastic hFOB 1.19 клетки раскрыть собственный минерализации профили. Saos-2 клетки минерализации более эффективно, чем hFOB 1.19 клетки и производят больше полезных ископаемых, которые не видны под УФ света, но похожи на гидроксиапатита (га) в том, что они имеют больше Ca и F замен.

Результаты, полученные с помощью этих методов позволяет нам заключить, что процесс минерализации отличается в зависимости от типа ячейки. Мы предлагаем, что, на клеточном уровне, происхождение и свойства везикулы предопределить тип минералов.

Введение

Кость — это тип соединительной ткани, состоящей из двух частей: органические (клетки и коллагеновые волокна) и минеральных (соединений кальция и фосфата). Основные минеральные компоненты в кости, Апатиты1. Различные типы минерализации компетентных клеток в кости (остеобласты), зубы (odontoblasts) и хряща (хондроцитов) регулируют первоначальные шаги минерализации, производя белков внеклеточного матрикса (ECM) и выпускать матрица везикулы (МВС) (рис. 1). МВС являются 100-300 Нм диаметр пузырьков, которые накапливаются кальция и фосфатов, содействия апатита нуклеации и впоследствии связать коллаген2,3. Затем MVs дезинтегрируют выпустить апатитов внеклеточных среды. Апатиты продолжают расти при контакте с коллагеновых волокон и формируют костной матрицы. Минерализация подкрепляется постоянные поставки P,я и Ca2 + в внеклеточных среды. Некоторые недавно опубликованные данные поддерживают нашу модель4,5. Мягких тканей не минерализации в физиологических условиях. Однако эктопической кальцификации может произойти в патологических условиях например сосудистой кальцификации3. Сосудистые клетки, которые приобретают остеобластов фенотипом могут производить MVs, которые вызывают нуклеации апатитов и инициировать минерализации в медиальной и интимы слои стенки кровеносных сосудов. Начиная с эктопической кальцификации напоминают нормальный endochondral минерализация3, понимание молекулярных механизмов минерализация костных клеток и хондроцитов следует обеспечить некоторые подсказки на Эктопическая кальцификация мягких тканей, которые являются сформирован.

Развитие скелетных тканей регулируется различные ферменты, факторы роста и промоутеров или ингибиторов минерализации. Антагонистическое действие ткани неспецифические щелочной фосфатазы (TNAP) (рис. 1) и ectonucleotide пирофосфатаза/фосфодиэстеразы я (NPP1), вместе с Анкирины (АНК), контролирует концентрации неорганических пирофосфат (PPя) 6. PPя, мощным ингибитором формирования HA, гидролизуется по TNAP; NPP1 гидролизует нуклеотидов трифосфаты сформировать PP,я пока ANK экспортирует PP,я из ячейки в ECM. Pi/PPi соотношение может регулировать апатита формирования7,8 возможных патологических последствий9.

Мембрана MV обогащается в ионный транспорт белков, которые облегчают начальный осадков кальция и фосфатов внутри векторы во время процесса нуклеации (рис. 1). Фосфат транспортер 1 (Пит) помогает включить Pя сгенерирована perivesicular пространства в МВС10,11. Аннексины могут быть вовлечены в привязке и транспорта Ca2 + и в процессе биофизических, который инициирует минерализации в MV просвета12,13. Мы выступаем за гипотеза, предложил ранее, для минерализации в интрацитоплазматической пузырьков внутреннего нуклеации апатита внутри мВ до его распространения в ECM14,15. В vitro моделирования подтвердил индукции формирования Ca2 +/ pя комплексов в proteoliposomes из16Л.С. и AnxA5. Это может означать, что накопление Ca2 +, P,я, AnxA5 и ПС комплексов в липидной плоты микроворсинки как membranesrepresent нуклеации ядро (NC) апатита в пределах Мпротив Аннексины и TNAP обладают также коллаген привязки возможности, которые могут быть полезны в размещении MVs вдоль волокон коллагена и в стимулировании распространения минерализации в ECM. Fetuin A и Остеопоэтин (OPN)17, известны как ингибиторы формирования апатита, которая может замедлить распространение минерализации на коллагеновых эшафот. Зарождения и распространения являются различные события, бывший до последнего, и оба могут быть актуальными для процесса патологических минерализации.

Чтобы узнать, как химический состав кальция фосфат комплексов могут изменить физиологических минерализации и эктопической кальцификации, это необходимо для идентификации минералов, производимые клеток. Апатиты группа кальция и фосфатов, содержащие минералы с общего кристалл блок клеток формулой Ca10(PO4)6X2, где X = Cl, F, OH. Они классифицируются следующим образом18: fluorapatite (ФА) Ca6F10(PO4)2, хлорапатитом (CA) Ca10(PO4)6Cl2 и гидроксиапатита (HA) Ca10(PO4 )6(OH)2.

Выбор остеобластов клеточных линий, чтобы побудить минеральные образования имеет решающее значение, поскольку в каждой ячейке строки экспонатов собственный профиль минерализации. В настоящем докладе, мы сравнили нуклеации минералов на две отдельных клеток человека модели минерализации: osteoblastic hFOB 1.19 клетки и клетки остеосаркома Saos-2. Остеосаркома, полученных клетки обычно используются как osteoblastic модели и Saos-2 клетки сохранили наиболее зрелой osteoblastic характер19 пока недифференцированные человеческого плода hFOB клетки широко используются как модель для нормальной osteoblastic дифференциация20. Их минерализации профили были проанализированы различными методами: пятнать ализарин красный-S (AR-S), ультрафиолетового (УФ) света визуализации, передачи электронной микроскопии (ТЕА) изображений, энергии энергодисперсионный рентгеновский микроанализ (EDX) количественный и Ион сопоставление. Преимущество ТЕА-EDX над альтернативные методы, используемые в предыдущих исследованиях является, что она дает количественные и качественные результаты замены иона в апатита кристаллов4,5,21. Общая цель использования ТЕА-EDX состояла в том, чтобы найти простой способ для создания образов и количественной оценки распределения ионов Ca, F и Cl в различных минералов из различных типов клеток на различных этапах процесса минерализации. Этот метод успешно используется, например, для контроля взаимодействия цинка наночастиц с сосуществующих химических веществ и их совокупное воздействие на водные организмы22. В другом исследовании, медные фотокатализатор на титановые материалы в водном растворе широко характеризуется с помощью индуктивно связанной плазмы оптической эмиссионной спектрометрии (ICP-OES), N2 physisorption (BET), Дифракционные, UV-vis DRS, FT-IR, Раман спектроскопия, ТЕА-EDX и фотоэлектрохимические измерения23. Нашей целью было сравнить происхождение и свойства везикулы и минералов в двух клеточных линий, чтобы понять механизм, который управляет минерализации при костной дифференциации.

figure-introduction-7383
Рисунок 1 . Схема из первоначальных шагов минерализации в костных клеток, синтез белков внеклеточного матрикса (ECM) и выпуска Матричные везикулы (МВС) от мембраны. МВС накопления кальция через действия кальция связывания белков, Аннексины и фосфат, через действие неорганического фосфата транспортера (Пит) следуют активности тканей неспецифической щелочной фосфатазы (TNAP), который dephosphorylates PPя Pя, способствуя апатита зародышеобразования. Затем MVs распадаться и отпустите апатитов внеклеточных среды. Минерализация поддерживается постоянной поставке P,я и Ca2 + в внеклеточной средний4,5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. клетки культуры и лечение

  1. Положите все необходимые материалы под капотом ламинарного потока и стерилизовать их под УФ светом. Средства массовой информации культуры являются: 1:1 смесь ветчины F12 и DMEM СМИ с 2,5 мм L-глютамин дополнена 100 ед/мл пенициллин, 100 ед/мл стрептомицина, 0,3 мг/мл G418 и 10% плода Bovine сыворотки (ФБС) (v/v) для человеческого плода hFOB 1.19 SV40 большой T антигена transfected остеобласты и средний Маккоя 5а с 1,5 мм L-глютамин 100 ед/мл пенициллин, 100 ед/мл стрептомицина и 15% FBS (v/v) для клеток человека остеосаркома Saos-2.
  2. Культура клетки hFOB 1.19 в 34 ° C в атмосферу 5% CO2 и Saos-2 клетки при 37 ° C в атмосферу 5% CO2. Передача культур клеток, либо hFOB 1.19 или Saos-2 клетки, от инкубатора для Ламинарный шкаф и изменения среды до 10 мл свежей питательной среды с FBS.
  3. Инкубировать клетки без стимуляторов (отдых клетки) или стимулировать их с 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты (AA) следуют 7,5 мм β-Глицерофосфат (β-GP), подготовленных ранее в сверхчистой воды и фильтруют через 0,22 мкм шприц фильтры. Добавьте стимуляторов из трубы пластиковые microcentrifuge на поверхность питательной среды. Аккуратно перемешать культуры блюдо и инкубировать в течение 7 дней.

2. Определение минералов кальция

  1. Мыть клеточных культур с фосфатного буфера физиологический (PBS: 125 мм NaCl, 5 мм KCl, 10 мм Na2HPO4, 1 мм х2PO4, pH 7.0).
  2. Добавьте 5 мл 2% (g:100 мл) AR-S в PBS, pH 5,0 и инкубировать пластины для 30 минут, чтобы пятно минералов.
  3. Вымойте 3 раза с PBS. Тщательно добавить PBS на стене блюдо, не пытаться уничтожить минералов.
  4. Соблюдать минералов кальция под Перевернутый световой микроскоп и принимать изображения.

3. Визуализация зондов под УФ света

  1. Для lysates клетки лечить культур клеток, отдыхает или стимулировали за 7 дней, согласно протоколу пищеварение коллагеназы24.
  2. Собирать средства от клеточных культур и вымыть клетки с PBS.
  3. Дайджест клетки с 3 мл 500 коллагеназы ед/мл в растворе 0,25 М сахарозы, 0,12 М NaCl, 0,01 М KCl и 0,02 М трис-HCl буфере, рН 7.45, при 37 ° C в течение 3 ч.
  4. Механически очистите клетки, их передачу microcentrifuge пластиковые трубы и передавать их 10 раз через 1 мл 40 U шприц с иглой 0.5 × 16.
  5. Центрифугуйте образцы на 500 g × 5 мин.
  6. Отменить супернатант и приостановить Пелле клеток в 500 мкл синтетических хряща лимфы (SCL, 100 мм NaCl, 12,7 мм KCl, 0,57 MgCl2, 1,83 мм NaHCO3, 0,57 NaH2PO4, 5.5 мм D-глюкоза, сахароза 63 мм, 16,5 мм Hepes, рН 7,4).
  7. Передача гидроксиапатита (га), fluorapatite (ФА) и хлорапатитом (CA) порошков из бутылки на УФ transilluminator с помощью шпателя и использовать в качестве элементов управления.
  8. Передача lysates клетки из пластиковых труб с наконечники и тщательно место на transilluminator УФ.
  9. Возьмите изображения под видимой и УФ света.

4. Подготовка зонды для ТЕА EDX

  1. Подготовка минералов для отрицательных пятнать
    1. Приостановить 2,5 мг синтетическим HA, CA и FA минералы25 500 мкл деионизированной воды и инкубировать при 37 ° C в атмосферу 5% CO2 на 1 ч.
    2. Возьмите Formvar/углерода 300 Mesh Ni сетки из коробки с Антистатический пинцет, место на нескольких хорошо тарелка и падение 10 мкл HA, CA и FA суспензий на сетках.
    3. Сухие образцы для 30 мин при комнатной температуре.
  2. Подготовка отдыхает и стимулировал клетки для встраивания 26
    1. Собирать среднего от клеточных культур и вымыть клетки с физиологической десенсибилизации (PD) средний (125 мм NaCl, 5 KCL, 10 мм NaHCO3, 1 мм х2PO4, глюкоза 10 мм, 20 мм HEPES, рН 7,4).
    2. Исправьте клетки с 5 мл смеси 3% (g:100 мл) paraformaldehyde/1% (g:100 мл) глютаральдегид в буфере натрия фосфат 100 мм, pH 7.2, за 1 ч при комнатной температуре под зонт.
    3. Вымыть клетки с 5 мл 100 мм натрия фосфат буфера и аккуратно удалить буфер после стирки.
    4. В темной комнате постфиксная образцы с 2 мл 1% (g:100 мл) осмия тетраоксид в буфере натрия фосфат 100 мм, pH 7.2, для 20 мин при комнатной температуре под зонт.
    5. Удаление осмия тетраоксид и использовать его.
    6. Вымойте клетки с 5 мл, натрия фосфат буфера 100 мм.
    7. Затем, обезвоживает образцы в 5 мл аликвоты градуированных этанола раствор серии при комнатной температуре: 25% (об.) за 5 мин, 50% (об.) за 10 мин, 75% (об.) за 15 мин, 90% (об.) за 20 мин. Наконец, используйте абсолютного этанола дважды и Инкубируйте 30 мин и 12 ч.
    8. Механически скрести клетки от пластиковых культуры Петри, собирать в пробирки пластиковые microcentrifuge и Центрифугуйте образцы на 130 x г за 1 мин.
    9. Удаление supernatants и приостановить клеток в 1 мл смеси LR белой смолы и абсолютного этанола в том соотношении 1:2.
    10. Хорошо перемешайте содержимое стеклянных трубок перед использованием и Инкубируйте 30 мин при комнатной температуре.
    11. Центрифугуйте образцы на 130 x г за 1 мин.
    12. Удаление supernatants и повторите предыдущий шаг, используя 1 мл раствора 1:1 смесь LR белой смолы и абсолютного этанола.
    13. Хорошо перемешайте и Инкубируйте 30 мин при комнатной температуре.
    14. Центрифугуйте образцы на 130 x г за 1 мин.
    15. Удаление supernatants.
    16. Наконец добавить 1 мл чистого белого LR смолы в образцы дважды и инкубировать 1 час при комнатной температуре в пластиковых тубах.
    17. Поместите 500 мкл каждого образца в желатиновых капсулах.
      Примечание: Образцы помечены с помощью небольшой лист бумаги и карандаш, чтобы смола не уничтожить этикетки.
    18. Закройте желатиновых капсул, поместите их в пластиковый microcentrifuge трубы и центрифуги на 130 x г за 1 мин в ротор.
    19. Удаление капсулы из пластиковых трубок с помощью вакуумного насоса.
    20. Перемещение образцов в печь и полимеризоваться в 56 ° C в течение 48 часов.
    21. Подготовьте блоки, монтируя их в держатель и обрезки их пирамиды.
    22. Вставьте держатель ultramicrotome, прикрепить Алмазный нож Ultra 45° и заполнить его с дейонизированной водой; не забудьте очистить лезвие от случайных пузырьков.
    23. Затем вырежьте разделов (700 Å) с использованием алмазный нож на деионизованной воде ванны.
    24. Установите обрезки с помощью бычьего ресниц и место, где их на блестящей стороне 300 Formvar/углерода сетки сетка Ni и высушите их.
    25. Подготовьте ацетат уранила 2,5% (об.) в абсолютного этанола в темноте под вытяжного шкафа. Держите уранила ацетат в контейнере свинца и не забудьте забрать в отложениях.
    26. В темной комнате counterstain сетки синтетических апатитов и образцы клетки с 2,5% (об.) уранила ацетат в этиловом спирте в течение 20 минут при комнатной температуре под зонт.
    27. Для очистки сетки в 50% этанола (vol.), затем в деионизированной воде и сушат при комнатной температуре в течение 24 ч. Наконец Положите сетки в поле.

5. ТЕА EDX анализ

  1. ТЕА изображений, просвечивающий электронный микроскоп (ТЕА) оснащены полный диапазон энергии энергодисперсионный рентгеновский микроанализ (EDX) системы и 11 мегапиксельной камерой
    1. Подготовьте бериллия держатель для наблюдения клеток и минералов. Антистатические средства используйте.
    2. Удаление пары винтов и поднимите пластину бериллия и бериллия шайбы от остальной части фиксатор.
    3. Смонтируйте сетки, блестящей стороной вверх, на держателе.
    4. Тщательно место бериллия Стиральная машина и плита бериллия и плотно завинтите винты крепления.
    5. Поместите держатель в вакуумной камере и включите вакуумный насос.
    6. Как только достигнуто вакуума аккуратно вставьте держатель в тепловизионной камеры и включите луча.
    7. На флуоресцентные монитора установите параметры диафрагмы микроскопа. Коррекции астигматизма изображения; Установите зум, фокус и рамы; и принимать ТЕА изображения в масштабе 50, 000 X.
  2. СТЕБЕЛЬ изображений и рентгеновского микроанализа для анализа спектральных и композиционные
    1. Вставьте энергии дисперсионных детектор рентгеновского (EDX) в зале сканирования электронной микроскопии (STEM) передачи изображений.
    2. Отрегулируйте резкость изображения в режиме focus.
    3. Возьмите стволовых изображений с увеличением 15, 000 X.
    4. Выберите точку в образце для рентгеновского микроанализа и собирать спектров.
    5. Получение данных путем суммирования всех атомных масс для всех элементов таблицы Менделеева в примере (как 100%) и показывая содержимое отдельных элементов: Ca, F, Cl и P (как атомная %). Затем рассчитайте коэффициенты Ca, F или Cl до P для каждого образца.
  3. Ион сопоставление
    1. Выберите элементы, такие как кальций, фтор, хлор и фосфора Ион сопоставления и выполнить EDX карт выбранных элементов в образцах.
    2. Получение данных, указав локализации анализируемых элементов: Ca, F, Cl и P (как атомная %) и рассчитать Сопредседатель локализации (в %) ЦС, F или Cl с P для каждого образца.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

ТЕА-EDX позволяет для обработки изображений в vitro Матричные везикулы (МВС) выпущенный минерализация клетки и полезных ископаемых, выпускаемые Мпротив результаты, полученные с помощью этой методики продемонстрировать, что процесс минерализации может проходит...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В текущем документе мы описали протоколы для окрашивания, УФ света идентификации fluorapatite AR-S и ТЕА-EDX в vitro изображений МВС, выпущенное минерализация клетки и минералов производимых MVs. Это позволяет решить все методы, упомянутые выше, после некоторых общих неполадок. Чтобы получ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они имеют никакого конфликта интересов.

Благодарности

МК и ASK ручной операции и LB подготовлены чертежи и сделал фильм. ASK написал рукопись, LB написал сценарий и MK подготовил таблицу. SM, RB и SP критически прочитать таблицу, сценарий и рукописи. Авторы хотели бы поблагодарить Hanna Chomontowska за ее превосходную помощь с ultramicrotomy а также Шимон Suski и Henryk Bilski за их прекрасную помощь с ТЕА-EDX анализа. Авторы хотели бы поблагодарить д-р Патрик рощи для коррекции профессионального английского языка и Барбара Sobiak для записи инструкции.

Эта работа была поддержана грант N N401 140639 от польского министерства науки и высшего образования спросить, за счет субсидий из национального научного центра, Польша 2016/23/N/NZ4/03313 фунтов и 2016/23/N/NZ1/02449 в МК, BIOIMAGINE Проект РП7 ЕС : Био-изображений в исследования инноваций и образования, GA № 264173 и уставных фондов из Ненцки Института экспериментальной биологии, польской академии наук.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagent
Ham’s DMEM/F12 media mixturePAAE15-8131:1, for human fetus hFOB 1.19 SV40 large T antigen transfected osteoblasts (ATCC CRL-11372)
McCoy’s 5A mediumPAAE82312-0025for human osteosarcoma Saos-2 cells (ATCC HTB-85)
Antibiotics mixture (penicillin/streptomycin)SigmaP0781-100ML100 U/mL each
G-418Sigma681680.3 mg/mL
FBSGibco1027010% for hFOB 1.19 and 15% for Saos-2
AASigmaA-596050 µg/mL
ß-GPSigmaG9422-100G7.5 mM
Bio-Gel HTP GelBio-Rad130-0420for HA
FAsynthesized by us
CAsynthesized by us
Sodium phosphate buffer Na2HPO4/NaH2PO4 mixtureSigmaS7907/S82820.1 M, pH 7.2
PBSpH 7.0, prepared by us
AR-S in PBSSigmaA5533-25G0.5 g/100 mL, pH 5.0
Collagenase type IASigmaC2674500 U/mL
SCL bufferprepared by us
Deionized watherproduced by us
EthanolPOChBA6480111absolut 99.8% and solutions 25, 50, 75, 90%
Uranyl acetate in 50% ethanolPolysciences Inc.21447-250.25 g/10 mL
PD mediumpH 7.4, prepared by us
Fixation mixture (paraformaldehyde/glutaraldehyde)Sigma158127/G-62573%:1%
Post-fixation OsO4Sigma756331%
LR White resin in ethanolPolysciences Inc.17411-MUNC 500g1:2, 1:1, 100%
AcetoneCHEMPUR111024800pure
Tool
Cryogenic vialsCorning Inc.4304871.2 mL
Plastic Petri culture dishesFalcon353003100 mm
Plastic tubesFalcon352096 and 35207015 and 50 mL
Serological pipettesFalcon and VWR357521 and 612-37001 and 10 mL
Plastic microcentrifuge tubesSigmaZ688312 and Z6280341.5 mL black and 2 mL transparent
Plastic tipsVWR613-0364, 613-0239 and 613-10500.1-10 µL natural, 1-200 µL yellow and 200-1000 µL blue
Plastic racksLight LabsA-7055-Z, A-7053-Cgreen for tubes, orange for micro tubes and blue for TEM probes
Laminar Hera SaveThermo Scientific Co.KS12HEPA filter (H14 according to DIN EN 1822)
Incubators Hera CellThermo Scientific Co.15034°C for hFOB 1.19 and 37°C for Saos-2
Fume hoodPOLONWCS-2for TEM stainings
Glass bottlesSIMAX1632414501050 and 163241450110050 and 100 mL
Quartz glass tubesSIMAX638422010100Ø 10 mm, L 100 mm
PumpIBS Integra BiosciencesVACUSAFE comfortfor vacuum
OvenMemmertUNE 40056°C
Porcelain multi-well plateRosenthal technik229/1212 wells
Glass beakersSIMAX63241701002525 mL
Glass bottlesPocordDIN2210 mL
Plastic boxAgar Scientific Ltd.for darkness
Snap Fit Gelatin CapsulesAgar Scientific Ltd.G3741size 1
Formvar/Carbon 300 Mesh Ni grids in boxAgar Scientific Ltd.S162N3film on the shiny side
Silicon cell scraperSigmaSIAL0010-100EAsize 1.8/25 cm
Syringe with needleBogMark007syringe 1 mL 40 U, needle 0.5 x 16
SyringeChiranaCH005L5 mL
CentrifugeMPW Medical InstrumentsMPW-350R130 x g and 500 x g
UV transluminatorUVPM-20for visible and UV light
UltramicrotomeLKBNOVA700Å sections
Block holderLKBE6711round shape
Diamond knifeDiATOMEUltra 45°size 3
Eyelash holderbovine, prepared by us
ForcepsROTH2855.1antistatic for grids
Spatulas setROTHE286.1antistatic for powders
Imaging
Inverted Light MicroscopeZeiss with CanonAxioObserver Z1 equipped with PowerShot G9Phase contrast, Transmitted light, 20 x objective, RGB filters
Transmission Electron MicroscopeTEM Jeol Co. with Oxford Instruments and SiS-OlympusJEM-1400 TEM equipped with full range INCA Energy Dispersive X-ray microanalysis (EDX) System and 11 Megapixel MORADA G2 cameramagnification 50,000X for TEM and 15,000X for STEM and EDX
Camera body and lensesNikonNikon D7100
Nikkor AF Micro 105 mm f/2.8D
Nikkor AF-S 50 mm f/1.8G
Nikkor AF 28 mm f/2.8D 		for movie recordings
MicrophoneMXL MicsTempofor voice recordings

Ссылки

  1. Buckwalter, J. A., Cooper, R. R. Bone structure and function. Instr. Course Lect. 36, 27-28 (1987).
  2. Anderson, H. C. Molecular biology of matrix vesicles. Clin. Orthop. Relat. Res. 314, 266-280 (1995).
  3. Anderson, H. C. Matrix vesicles and calcification. Curr Rheumatol. 5 (3), 222-226 (2003).
  4. Bolean, M., Simão, A. M. S., Barioni, M. B., Favarin, B. Z., Sebinelli, H. G., Veschi, E. A., Janku, T. A. B., Bottini, M., Hoylaerts, M. F., Itri, R., Millán, J. L., Ciancaglini, P. Biophysical aspects of biomineralization. Biophys Rev. 9 (5), 747-760 (2017).
  5. Bottini, M., Mebarek, S., Anderson, K. L., Strzelecka-Kiliszek, A., Bozycki, L., Simão, A. M. S., Bolean, M., Ciancaglini, P., Bandorowicz Pikula, J., Pikula, S., Magne, D., Volkmann, N., Hanein, D., Millán, J. L., Buchet, R. Matrix vesicles from chondrocytes and osteoblasts: Their biogenesis, properties, functions and biomimetic models. Biochim Biophys Acta. 1862 (3), 532-546 (2018).
  6. Hessle, L., Johnson, K. A., Anderson, H. C., Narisawa, S., Sali, A., Goding, J. W., Terkeltaub, R., Millan, J. L. Tissue-nonspecific alkaline phosphatase and plasma cell membrane glycoprotein-1 are central antagonistic regulators of bone mineralization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 (14), 9445-9449 (2002).
  7. Garimella, R., Bi, X., Anderson, H. C., Camacho, N. P. Nature of phosphate substrate as a major determinant of mineral type formed in matrix vesicle-mediated in vitro mineralization: An FTIR imaging study. Bone. 38 (6), 811-817 (2006).
  8. Thouverey, C., Bechkoff, G., Pikula, S., Buchet, R. Inorganic pyrophosphate as a regulator of hydroxyapatite or calcium pyrophosphate dihydrate mineral deposition by matrix vesicles. Osteoarthr. Cartil. 17, 64-72 (2009).
  9. Terkeltaub, R. A. Inorganic pyrophosphate generation and disposition in pathophysiology. Am. J. Phys. 281 (1), 1-11 (2001).
  10. Guicheux, J., Palmer, G., Shukunami, C., Hiraki, Y., Bonjour, J. P., Caverzasio, J. A novel in vitro culture system for analysis of functional role of phosphate transport in endochondral ossification. Bone. 27 (1), 69-74 (2000).
  11. Yadav, M. C., Bottini, M., Cory, E., Bhattacharya, K., Kuss, P., Narisawa, S., Sah, R. L., Beck, L., Fadeel, B., Farquharson, C., Millán, J. L. Skeletal mineralization deficits and impaired biogenesis and function of chondrocyte-derived matrix vesicles in Phospho1(-/-) and Phospho1/Pi t1 double-knockout mice. J. Bone Miner. Res. 31 (6), 1275-1286 (2016).
  12. Thouverey, C., Malinowska, A., Balcerzak, M., Strzelecka-Kiliszek, A., Buchet, R., Dadlez, M., Pikula, S. Proteomic characterization of biogenesis and functions of matrix vesicles released from mineralizing human osteoblast-like cells. J. Proteome. 74 (7), 1123-1134 (2011).
  13. Wang, W., Xu, J., Kirsch, T. Annexin-mediated Ca2+ influx regulates growth plate chondrocyte maturation and apoptosis. J. Biol. Chem. 278 (6), 3762-3769 (2003).
  14. Nollet, M., Santucci-Darmanin, S., Breuil, V., et al. Autophagy in osteoblasts is involved in mineralization and bone homeostasis. Autophagy. 10 (11), 1965-1977 (2014).
  15. Boonrungsiman, S., Gentleman, E., Carzaniga, R., Evans, N. D., McComb, D. W., Porter, A. E., Stevens, M. M. The role of intracellular calcium phosphate in osteoblast-mediated bone apatite formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (35), 14170-14175 (2012).
  16. Genge, B. R., Wu, L. N., Wuthier, R. E. In vitro modeling of matrix vesicle nucleation: synergistic stimulation of mineral formation by annexin A5 and phosphatidylserine. J. Biol. Chem. 282 (36), 26035-26045 (2007).
  17. Jahnen-Dechent, W., Schäfer, B., Ketteler, M., McKee, M. D. Mineral chaperones: a role for fetuin-A and osteopontin in the inhibition and regression of pathologic calcification. J. Mol. Med. (Berl). 86 (4), 379-389 (2008).
  18. Suchanek, W., Yoshimura, M. Processing and properties of hydroxyapatite-based biomaterials for use as hard tissue replacement implants. J. Miner. Res. 13 (1), 94-117 (1998).
  19. Pautke, C., Schieker, M., Tischer, T., Kolk, A., Neth, P., Mutschler, W., Milz, S. Characterization of osteosarcoma cell lines MG-63, Saos-2 and U-2 OS in comparison to human osteoblasts. Anticancer Res. 24 (6), 3743-3748 (2004).
  20. Yen, M. -L., Chien, C. -C., Chiu, I. -M., Huang, H. -I., Chen, Y. -C., Hu, H. -I., Yen, B. L. Multilineage differentiation and characterization of the human fetal osteoblastic 1.19 cell line: a possible in vitro model of human mesenchymal progenitors. Stem Cells. 25 (1), 125-131 (2007).
  21. Brittle, S. W., Foose, D. P., O'Neil, K. A., Sikon, J. M., Johnson, J. K., Stahler, A. C., Ryan, J. D., Higgins, S. R., Sizemore, I. E. A raman-based imaging method for characterizing the molecular adsorption and spatial distribution of silver nanoparticles to hydrated mineral surfaces. Environ Sci Technol. , (2018).
  22. Liu, N., Wang, Y., Ge, F., Liu, S., Xiao, H. Antagonistic effect of nano-ZnO and cetyltrimethyl ammonium chloride on the growth of Chlorella vulgaris: Dissolution and accumulation of nano-ZnO. Chemosphere. 196, 566-574 (2018).
  23. Tasbihi, M., Kočì, K., Troppová, I., Edelmannová, M., Reli, M., Čapek, L., Schomäcker, R. Photocatalytic reduction of carbon dioxide over Cu/TiO2 photocatalysts. Environ Sci Pollut Res Int. , (2017).
  24. Chen, N. X., O'Neill, K. D., Chen, X., Moe, S. M. Annexin-Mediated Matrix Vesicle Calcification in Vascular Smooth Muscle Cells. J. Bone Miner. Res. 23 (11), 1798-1805 (2008).
  25. Strzelecka-Kiliszek, A., Bozycki, L., Mebarek, S., Buchet, R., Pikula, S. Characteristics of minerals in vesicles produced by human osteoblasts hFOB 1.19 and osteosarcoma Saos-2 cells stimulated for mineralization. J. Inorg. Bioch. 171, 100-107 (2017).
  26. Thouverey, C., Strzelecka-Kiliszek, A., Balcerzak, M., Buchet, R., Pikula, S. Matrix vesicles originate from apical membranę microvilli of mineralizing osteoblast-like Saos-2 cells. J. Cell. Biochem. 106 (1), 127-138 (2009).
  27. Cazalbou, S., Eichert, D., Ranz, X., Drouet, C., Combes, C., Harmand, M. F., Rey, C. Ion exchanges in apatites for biomedical application. J. Mater. Sci. Mater. Med. 16 (5), 405-409 (2005).
  28. Kraus, D. Consolidated data analysis and presentation using an open-source add-in for the Microsoft Excel® spreadsheet software. Med. Writ. 23 (1), 25-28 (2014).
  29. Kawasaki, K., Buchanan, A. V., Weiss, K. M. Biomineralization in humans: making the hard choices in life. Annu. Rev. Genet. 43, 119-142 (2009).
  30. Bonucci, E. Bone mineralization. Front. Biosci. 17, 100-128 (2012).
  31. Veis, A., Dorvee, J. R. Biomineralization mechanisms: A new paradigm for crystal nucleation in organic matrices. Calcif. Tissue Int. 93 (4), 307-315 (2013).
  32. Nudelman, F., Lausch, A. J., Sommerdijk, N. A., Sone, E. D. In vitro models of collagen biomineralization. J. Struct. Biol. 183 (2), 258-269 (2013).
  33. Alliston, T. Biological regulation of bone quality. Curr. Osteoporos. Rep. 12 (3), 366-375 (2014).
  34. Wang, W., Kirsch, T. Retinoic acid stimulates annexin-mediated growth plate chondrocyte mineralization. J. Cell Biol. 157 (6), 1061-1069 (2002).
  35. Wang, W., Xu, J., Kirsh, T. Annexin V and terminal differentiation of growth plate chondrocytes. Exp. Cell Res. 305 (1), 156-165 (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

136EDX

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены