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Resumen

Presentamos un protocolo para comparar el estado de los minerales en vesículas por dos líneas de células de hueso humano: hFOB 1.19 y Saos-2. Sus perfiles de mineralización fueron analizados por alizarina rojo-S (AR-S) coloración, visualización luz de ultravioleta (UV), la proyección de imagen de microscopía electrónica (TEM) transmisión y microanálisis por energía dispersiva por rayos x (EDX).

Resumen

Este video presenta el uso de microscopía electrónica de transmisión con microanálisis de rayos x dispersiva de energía (TEM-EDX) para comparar el estado de los minerales en vesículas por dos líneas de células de hueso humano: hFOB 1.19 y Saos-2. Estas líneas celulares, después del tratamiento con ácido ascórbico (AA) y β-glicerofosfato (β-GP), experimentar transdifferentiation osteogénico completado de proliferación a la mineralización y producen vesículas de matriz (MVs) que provocan la nucleación de apatita en la matriz extracelular (ECM).

Basado en la tinción de rojo de alizarina-S (AR-S) y análisis de la composición de minerales en los lysates de la célula con luz ultravioleta (UV) o en vesículas usando proyección de imagen de TEM seguido por EDX cuantificación y mapeo de ion, podemos inferir que el osteosarcoma Saos-2 y osteoblástica las células hFOB 1.19 revelan perfiles de mineralización distinta. Las células SAOS-2 mineralizar más eficientemente que las células hFOB 1.19 y producen depósitos minerales más grandes que no son visibles bajo luz UV, pero son similares a la hidroxiapatita (HA) en que tienen sustituciones más Ca y F.

Los resultados obtenidos con estas técnicas nos permiten concluir que el proceso de mineralización es diferente dependiendo del tipo de célula. Proponemos que, a nivel celular, el origen y las propiedades de las vesículas predeterminan el tipo de minerales.

Introducción

El hueso es un tipo de tejido conectivo compuesto de dos partes: orgánica (células y fibras de colágeno) y minerales (compuestos de calcio y fosfato). Los principales componentes minerales en los huesos son apatitas1. Diferentes tipos de células competentes de mineralización en el hueso (osteoblastos), dientes (odontoblastos) y cartílago (condrocitos) regulan los pasos iniciales de mineralización produciendo proteínas de la matriz extracelular (ECM) y liberación de matriz vesículas (MVs) (figura 1). MVs son vesículas de 100 a 300 nm de diámetro que acumulan calcio y fosfato facilita la nucleación de apatita y posteriormente se unen al colágeno2,3. Entonces, MVs se desintegran para liberar apatitas al medio extracelular. Las apatitas continúan creciendo en contacto con las fibras de colágeno y forman la matriz ósea. La mineralización es sostenida por el suministro constante de P y Ca2 + en el medio extracelular. Algunos datos publicados recientemente apoyan nuestro modelo4,5. Los tejidos blandos no mineralizarse bajo condiciones fisiológicas. Sin embargo, la calcificación ectópica puede ocurrir en condiciones patológicas tales como calcificación vascular3. Las células vasculares que adquieren el fenotipo de osteoblastos pueden producir MVs que inducen la nucleación de apatitas e inician la mineralización en las capas íntimas y mediales de la pared de los vasos sanguíneos. Desde calcificación ectópica se asemejan a endocondral normal mineralización3, entender los mecanismos moleculares de la mineralización de las células óseas y condrocitos deben proporcionar algunas pistas sobre la calcificación ectópica de los tejidos blandos que son formado.

El desarrollo de tejidos esqueléticos está regulado por diversas enzimas, factores de crecimiento y promotores o inhibidores de la mineralización. La acción antagónica de la fosfatasa alcalina no específica de tejido (TNAP) (figura 1) y ectonucleotide pirofosfatasa/fosfodiesterasa I (NPP1), junto con ankyrin (ANK), controla la concentración de pirofosfato inorgánico (PP) 6. PP, un potente inhibidor de la formación de HA, es hidrolizado por TNAP; NPP1 hidroliza trifosfatos de nucleótidos para formar PP mientras ANK las exportaciones de PP de la célula al ECM. La proporción Pi/PPi puede regular la formación de apatita7,8 con posibles consecuencias patológicas9.

La membrana de MV se enriquece en proteínas de transporte de iones que facilitan la precipitación inicial de calcio y fosfato en el MVs durante el proceso de nucleación (figura 1). El transportador de fosfato 1 (hoyo) ayuda a incorporar P genera en el espacio perivesicular en la MVs10,11. Anexinas pueden estar implicado en el atascamiento y el transporte de Ca2 + y en el proceso biofísico que inicia la mineralización en el MV lumen12,13. Privilegiamos la hipótesis, sugerida anteriormente, para la mineralización dentro de vesículas intracitoplasmáticas de nucleación interna de apatita dentro de la MV antes de su propagación en el ECM14,15. Modelado in vitro confirmaron la inducción de la Ca2 +/P complejos formación en proteoliposomes de PS y AnxA516. Esto puede indicar que la acumulación de Ca2 +, P, complejos AnxA5 y PS en las balsas lipídicas de las microvellosidades-como membranesrepresent el núcleo nucleación (NC) de apatita dentro de Mvs anexinas y TNAP también poseen colágeno vinculante capacidades que pueden ayudar en la colocación de MVs a lo largo de las fibras de colágeno y en estimular la propagación de la mineralización en el ECM. Fetuin A y17de la osteopontina (OPN), son conocidos como inhibidores de la formación de apatita que puede ralentizar la propagación de la mineralización en el andamio colagenosa. Nucleación y propagación son eventos distintos, el primero anterior a éste, y ambos pueden ser relevantes para el proceso de mineralización patológica.

Para descubrir cómo puede cambiar la química de complejos de fosfato de calcio calcificación ectópica y mineralización fisiológica, es necesario identificar los minerales producidos por las células. Apatitas son un grupo de calcio y fosfato que contiene minerales con el cristal general unidad celular fórmula Ca10(PO4)6X2, donde X = Cl, F, OH. Se clasifican de la siguiente manera18: Fluorapatito (FA) Ca10(PO4)6F2y chlorapatite (CA) Ca10(PO4)6Cl2 de hidroxiapatita (HA) Ca10(PO4 )6(OH)2.

La elección de las líneas celulares de osteoblastos para inducir la formación de minerales es crucial, puesto que cada línea celular exhibe un perfil distinto de mineralización. En este informe, en comparación con la nucleación de minerales por dos modelos de células humanas las de mineralización: células osteoblásticas hFOB 1.19 y células de osteosarcoma Saos-2. Las células derivadas de osteosarcoma se utilizan comúnmente como modelos osteoblásticos y células Saos-2 conservan la más madura de carácter osteoblástico19 mientras que las células indiferenciadas hFOB fetal humano son ampliamente utilizadas como modelo para osteoblástica normal diferenciación20. Sus perfiles de mineralización se analizaron mediante diferentes métodos: tinción rojo de alizarina-S (AR-S), ULTRAVIOLETA (UV) luz la visualización, la proyección de imagen de microscopía electrónica (TEM) transmisión, cuantificación de microanálisis (EDX) de rayos x dispersivo energía y ion asignación. La ventaja de TEM-EDX sobre alternativas técnicas utilizadas en estudios previos es que da resultados cuantitativos y cualitativos de la sustitución de iones en cristales de apatita4,5,21. El objetivo de utilizar las TEM-EDX era encontrar un método simple para la proyección de imagen y cuantificación de la distribución de los iones Ca, F y Cl en varios minerales de diferentes tipos de células en distintas etapas del proceso de mineralización. Este método ha sido utilizado con éxito, por ejemplo, para monitorear la interacción de las nanopartículas de zinc con productos químicos coexistentes y sus combinados efectos en organismos acuáticos22. En otro estudio, un fotocatalizador cobre en materiales de titanio en solución acuosa se caracterizó ampliamente por medio de espectrometría de emisión óptica de plasma acoplado inductivamente (ICP-OES), N2 physisorption (BET), DRX, DRS de UV-vis, FT-IR, Raman Espectroscopia, TEM-EDX y fotoelectroquímicos medidas23. Nuestro objetivo fue comparar el origen y las propiedades de las vesículas y los minerales en dos líneas celulares para entender el mecanismo que controla la mineralización durante la diferenciación ósea.

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Figura 1 . Esquema de los pasos iniciales de la mineralización en las células óseas que implican la síntesis de proteínas de matriz extracelular (ECM) y liberación de vesículas de la matriz (MVs) de la membrana. MVs acumulan calcio a través de la acción de proteínas calcio, anexinas y fosfato, a través de la acción de un transportador de fosfato inorgánico (PiT) seguido por la actividad de tejido no-fosfatasa alcalina específica (TNAP), que desfosforila PP a P, facilitando así el nucleation de la apatita. Entonces, MVs se desintegren y liberen apatitas al medio extracelular. La mineralización es sostenida por el suministro constante de P y Ca2 + en el medio extracelular4,5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Protocolo

1. la cultura y el tratamiento de la célula

  1. Poner todos los materiales necesarios bajo la campana de flujo laminar y esterilización bajo luz UV. Los medios de cultivo son: una mezcla 1:1 del jamón de medios F12 y DMEM con 2,5 mM L-glutamina suplementada con 100 U/mL de penicilina, 100 estreptomicina U/mL 0.3 mg/mL G418 y 10% suero bovino Fetal (FBS) (v/v) para antígeno de T grande de SV40 feto humano hFOB 1.19 transfectadas osteoblastos y medio de McCoy 5A 1,5 mM L-glutamina suplementada con 100 U/mL de penicilina, 100 estreptomicina U/mL y 15% FBS (v/v) para las células de osteosarcoma humano Saos-2.
  2. La cultura hFOB 1.19 células a 34 ° C en una atmósfera de 5% CO2 y células Saos-2 a 37 ° C en una atmósfera de 5% CO2. Cultivos de células, o células de 1.19 o Saos-2 hFOB, la transferencia desde la incubadora a la campana de flujo laminar y cambiar el medio a 10 mL de medio de cultivo fresco con FBS.
  3. Incube las células sin estimuladores (las células de reclinación) o estimular con 50 μg/mL de ácido ascórbico (AA) seguido por 7.5 mM β-glicerofosfato (β-GP), preparado en agua ultrapura y filtrada a través de filtros de la jeringuilla de 0,22 μm. Añadir los estimuladores de los tubos de microcentrífuga de plástico sobre la superficie del medio de cultivo. Suavemente Remueva la placa de cultivo e incubar durante 7 días.

2. detección de minerales de calcio

  1. Lavar los cultivos celulares con tampón fosfato salino (PBS: 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM de Na2HPO4, 1 m m KH2PO4, pH 7.0).
  2. Añadir 5 mL de 2% (g:100 mL) AR-S en PBS, pH 5.0 e incubar las placas durante 30 min a los minerales de la mancha.
  3. Lavar 3 veces con PBS. Cuidadosamente añadir PBS a la pared del plato, tratar de no destruir los minerales.
  4. Observar minerales calcio bajo un microscopio de luz invertido y tomar imágenes.

3. visualización de sondas bajo luz UV

  1. Para lysates de la célula, tratamiento de cultivos celulares, ya sea descansando o estimulado por 7 días, según la colagenasa digestión protocolo24.
  2. Reunir el medio de cultivos celulares y lavan las células con PBS.
  3. Digerir las células con 3 mL de 500 colagenasa U/mL en una solución de 0.25 M sacarosa, 0.12 M de NaCl, 0.01 M KCl y 0.02 M Tris-HCl buffer, pH 7,45, a 37 ° C durante 3 horas.
  4. Mecánicamente raspar las células transferirlas a tubos de microcentrífuga de plástico y pasar 10 veces a través de una jeringa de U 1 mL 40 0,5 × 16 aguja.
  5. Centrifugar las muestras a 500 x g durante 5 minutos.
  6. Deseche el sobrenadante y suspender el sedimento celular en 500 μl de la linfa de cartílago sintético (SCL, 100 mM NaCl, 12,7 mM KCl, 0,57 mM MgCl2, 1,83 mM NaHCO3, 0,57 mM NaH2PO4, 5,5 mM D-glucosa, sacarosa de 63 mM, 16,5 mM Hepes, pH 7,4).
  7. Transferencia de la hidroxiapatita (HA), Fluorapatito (FA) y polvos chlorapatite (CA) de las botellas en el transiluminador de UV con una espátula y utilizar como controles.
  8. Transferir los lysates de la célula de los tubos de plástico con puntas de plástico y coloque cuidadosamente sobre el transiluminador de UV.
  9. Tomar imágenes en el visible y UV luz.

4. preparación de sondas de TEM-EDX

  1. Preparación de minerales para la tinción negativa
    1. Suspender 2,5 mg de sintéticamente producido HA, CA y FA minerales25 en 500 μl de agua desionizada e incubar a 37 ° C en una atmósfera de 5% CO2 para 1 h.
    2. Toma rejillas de Formvar carbón 300 malla Ni de la caja con pinzas antiestáticas, coloque en un Platón de varios pocillos de porcelana y colocar 10 μl de las suspensiones HA, CA y FA en las rejillas.
    3. Secar las muestras durante 30 min a temperatura ambiente.
  2. Preparación de la reclinación y estimula las células para empotrar 26
    1. Recoger medio de los cultivos celulares y lavan las células con el medio fisiológico desensibilización (PD) (125 mM NaCl, 5 mM KCL, 10 mM NaHCO3, 1 mM KH2PO4, glucosa 10 mM, 20 mM HEPES, pH 7,4).
    2. Fijar las células con 5 mL de una mezcla de glutaraldehído de paraformaldehyde/1% (g:100 mL) (mL g:100) de 3% en tampón de fosfato de sodio de 100 mM, pH 7.2, por 1 h a temperatura ambiente bajo la campana.
    3. Lavar las células con 5 mL de tampón de fosfato de sodio 100 mM y retire suavemente el buffer después del lavado.
    4. En el cuarto oscuro, postfix las muestras con 2 mL de tetróxido de osmio 1% (g:100 mL) en tampón de fosfato de sodio de 100 mM, pH 7.2, por 20 min a temperatura ambiente bajo la campana.
    5. Retire el tetróxido de osmio y utilizarlo.
    6. Lavar las células con 5 mL de 100 mM de tampón fosfato de sodio.
    7. Entonces, deshidratan las muestras en alícuotas de 5 mL de una serie de solución de etanol gradual en la temperatura ambiente: 25% (vol.) por 5 min, 50% (por volumen) por 10 min, 75% (por volumen) durante 15 min., 90% (en volumen) por 20 min. Finalmente utilizar etanol absoluto dos veces e incubar durante 30 min y 12 h.
    8. Mecánicamente raspar las células de los platos de cultura de Petri plásticos, recoger en tubos de microcentrífuga de plástico y centrifugar las muestras a 130 x g durante 1 minuto.
    9. Eliminar el sobrenadante y suspender las células en 1 mL de una mezcla de la resina LR White y etanol absoluto en una proporción de volumen de 1:2.
    10. Mezclar bien el contenido de los tubos de vidrio antes de su uso e incubar durante 30 min a temperatura ambiente.
    11. Centrifugar las muestras a 130 x g durante 1 minuto.
    12. Eliminar el sobrenadante y repetir el paso anterior con 1 mL de una mezcla 1:1 de resina LR White y etanol absoluto.
    13. Mezclar bien e incubar durante 30 min a temperatura ambiente.
    14. Centrifugar las muestras a 130 x g durante 1 minuto.
    15. Eliminar el sobrenadante.
    16. Finalmente, añadir 1 mL de resina pura LR White a las muestras dos veces e incubar durante 1 h a temperatura ambiente en tubos de plástico.
    17. Coloque 500 μl de cada muestra en cápsulas de gelatina.
      Nota: Las muestras se etiquetan usando una pequeña hoja de papel y un lápiz para que la resina no destruya las etiquetas.
    18. Cierre de las cápsulas de gelatina, poner en los tubos de microcentrífuga de plástico y centrifugar a 130 x g durante 1 min en un rotor de salida.
    19. Retire las cápsulas de los tubos de plástico con una bomba de vacío.
    20. Mover las muestras en el horno y polimerizar a 56 ° C durante 48 h.
    21. Preparar los bloques de montaje en el soporte y ajuste a la pirámide.
    22. Poner el soporte en el ultramicrótomo, coloque el cuchillo del diamante Ultra 45° y llenar con agua desionizada; no olvide limpiar la lámina de burbujas incidentales.
    23. Luego cortar secciones (700 Å) usando el cuchillo del diamante en el baño de agua desionizada.
    24. Fijar los trozos utilizando pestañas bovina y el lugar en el lado brillante del carbón/Formvar 300 malla rejilla Ni y séquelos.
    25. Preparación de acetato de uranilo de 2.5% (por volumen) en etanol absoluto en la oscuridad bajo una campana de humos. Mantenga el acetato de uranilo en un recipiente de plomo y no olvide recoger el sedimento.
    26. En el cuarto oscuro, contratinción las rejillas de las apatitas sintéticas y muestras de células con acetato de uranilo de 2.5% (por volumen) de etanol por 20 min a temperatura ambiente bajo la campana.
    27. Lave las rejillas en etanol 50% (por volumen), luego en agua desionizada y secar a temperatura ambiente durante 24 h. Por último, poner las rejillas en la caja.

5. TEM-EDX análisis

  1. Proyección de imagen de TEM de un microscopio electrónico de transmisión (TEM) equipado con microanálisis de energía dispersiva de rayos x de gama completa (EDX) sistema y 11 megapíxeles cámara
    1. Preparar un soporte de berilio para la observación de células y minerales. Utilice herramientas antiestáticas.
    2. Quitar el par de tornillos y levante la placa de berilio y berilio arandela lejos del resto del retenedor.
    3. Monte el grid, el lado brillante hacia arriba, en el soporte.
    4. Con cuidado coloque la arandela de berilio y berilio placa y atornille firmemente los tornillos de fijación.
    5. Poner el soporte en la cámara de vacío y encienda la bomba de vacío.
    6. Una vez que se consigue un vacío, suavemente inserte el soporte en la cámara de proyección de imagen y gire en la viga.
    7. En la pantalla fluorescente, configure los parámetros de la abertura del microscopio. Realizar la corrección de astigmatismo la imagen; establecer el zoom, enfoque y marco; y tomar imágenes TEM en un aumento de 50, 000 X.
  2. Proyección de imagen de madre y microanálisis de rayos x para análisis espectral y composición
    1. Insertar el detector de energía dispersiva por rayos x (EDX) en la cámara imágenes de la microscopia electrónica (STEM) exploración de transmisión.
    2. Ajustar la nitidez de la imagen en el modo de enfoque.
    3. Tomar imágenes de la madre en un aumento de 15, 000 X.
    4. Seleccione un punto en la muestra para el microanálisis de rayos x y recoger los espectros.
    5. Obtener datos por la suma de los pesos atómicos de todos los elementos de la tabla periódica en la muestra (como 100%) y lo que significa el contenido de elementos seleccionados: Ca, Cl, F y P (% atómico). A continuación, calcular los ratios de Ca, F o Cl p para cada muestra.
  3. Asignación de ion
    1. Seleccionar elementos como el calcio, flúor, cloro y fósforo para hacer mapeo de ion y realizar mapas de EDX de los elementos seleccionados en las muestras.
    2. Obtener datos indicando la localización de los elementos analizados: Ca, Cl, F y P (% atómico) y calcular la co-localización (en %) de Ca, F o Cl p para cada muestra.

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Resultados

TEM-EDX permite el en vitro la proyección de imagen de vesículas de la matriz (MVs) lanzadas por mineralización de las células y de los minerales producidos por Mfrente a los resultados obtenidos con esta técnica demuestran que el proceso de mineralización puede proceder de manera diferente en varios tipos de células. Las líneas dos celulares recibieron el mismo tratamiento de transdiferenciación osteoblástica, pero estimulada células Saos-2 más eficientement...

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Discusión

En el documento actual, describen los protocolos para AR-S coloración, identificación de luz UV de Fluorapatito y TEM-EDX en vitro la proyección de imagen de MVs por mineralización de las células y de los minerales producidos por MVs. Es posible tratar todos los métodos mencionados siguiendo algunos pasos de solución de problemas comunes. Para obtener resultados óptimos, deben realizarse varios pasos críticos cuidadosamente. En primer lugar, es mejor añadir AA (que es ácido) seguida por β-GP...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de interés.

Agradecimientos

MK y pedir realizar operaciones manuales y LB había preparado dibujos e hizo la película. PREGUNTA escribió el manuscrito, LB escribió el guión y MK había preparado la mesa. SM, RB y SP leen críticamente la tabla, el script y el manuscrito. Los autores desean agradecer a Hanna Chomontowska por su excelente asistencia ultramicrotomía como Szymon Suski y Henryk Bilski por su excelente ayuda con análisis de TEM-EDX. Los autores desean dar las gracias a Dr. Patrick para corrección de inglés profesional y Barbara Sobiak para las instrucciones de la grabación.

Este trabajo fue financiado por beca N N401 140639 del Ministerio polaco de ciencia y educación superior para pedir, por subvenciones del Centro Nacional de ciencia, Polonia 2016/23/N/NZ4/03313 LB y 2016/23/N/NZ1/02449 a MK, UE FP7 proyecto BIOIMAGINE : BIO-proyección de imagen en investigación, innovación y educación, GA Nº 264173 y por los fondos legales del Instituto de Biología Experimental Nencki, Polaco Academia de Ciencias.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagent
Ham’s DMEM/F12 media mixturePAAE15-8131:1, for human fetus hFOB 1.19 SV40 large T antigen transfected osteoblasts (ATCC CRL-11372)
McCoy’s 5A mediumPAAE82312-0025for human osteosarcoma Saos-2 cells (ATCC HTB-85)
Antibiotics mixture (penicillin/streptomycin)SigmaP0781-100ML100 U/mL each
G-418Sigma681680.3 mg/mL
FBSGibco1027010% for hFOB 1.19 and 15% for Saos-2
AASigmaA-596050 µg/mL
ß-GPSigmaG9422-100G7.5 mM
Bio-Gel HTP GelBio-Rad130-0420for HA
FAsynthesized by us
CAsynthesized by us
Sodium phosphate buffer Na2HPO4/NaH2PO4 mixtureSigmaS7907/S82820.1 M, pH 7.2
PBSpH 7.0, prepared by us
AR-S in PBSSigmaA5533-25G0.5 g/100 mL, pH 5.0
Collagenase type IASigmaC2674500 U/mL
SCL bufferprepared by us
Deionized watherproduced by us
EthanolPOChBA6480111absolut 99.8% and solutions 25, 50, 75, 90%
Uranyl acetate in 50% ethanolPolysciences Inc.21447-250.25 g/10 mL
PD mediumpH 7.4, prepared by us
Fixation mixture (paraformaldehyde/glutaraldehyde)Sigma158127/G-62573%:1%
Post-fixation OsO4Sigma756331%
LR White resin in ethanolPolysciences Inc.17411-MUNC 500g1:2, 1:1, 100%
AcetoneCHEMPUR111024800pure
Tool
Cryogenic vialsCorning Inc.4304871.2 mL
Plastic Petri culture dishesFalcon353003100 mm
Plastic tubesFalcon352096 and 35207015 and 50 mL
Serological pipettesFalcon and VWR357521 and 612-37001 and 10 mL
Plastic microcentrifuge tubesSigmaZ688312 and Z6280341.5 mL black and 2 mL transparent
Plastic tipsVWR613-0364, 613-0239 and 613-10500.1-10 µL natural, 1-200 µL yellow and 200-1000 µL blue
Plastic racksLight LabsA-7055-Z, A-7053-Cgreen for tubes, orange for micro tubes and blue for TEM probes
Laminar Hera SaveThermo Scientific Co.KS12HEPA filter (H14 according to DIN EN 1822)
Incubators Hera CellThermo Scientific Co.15034°C for hFOB 1.19 and 37°C for Saos-2
Fume hoodPOLONWCS-2for TEM stainings
Glass bottlesSIMAX1632414501050 and 163241450110050 and 100 mL
Quartz glass tubesSIMAX638422010100Ø 10 mm, L 100 mm
PumpIBS Integra BiosciencesVACUSAFE comfortfor vacuum
OvenMemmertUNE 40056°C
Porcelain multi-well plateRosenthal technik229/1212 wells
Glass beakersSIMAX63241701002525 mL
Glass bottlesPocordDIN2210 mL
Plastic boxAgar Scientific Ltd.for darkness
Snap Fit Gelatin CapsulesAgar Scientific Ltd.G3741size 1
Formvar/Carbon 300 Mesh Ni grids in boxAgar Scientific Ltd.S162N3film on the shiny side
Silicon cell scraperSigmaSIAL0010-100EAsize 1.8/25 cm
Syringe with needleBogMark007syringe 1 mL 40 U, needle 0.5 x 16
SyringeChiranaCH005L5 mL
CentrifugeMPW Medical InstrumentsMPW-350R130 x g and 500 x g
UV transluminatorUVPM-20for visible and UV light
UltramicrotomeLKBNOVA700Å sections
Block holderLKBE6711round shape
Diamond knifeDiATOMEUltra 45°size 3
Eyelash holderbovine, prepared by us
ForcepsROTH2855.1antistatic for grids
Spatulas setROTHE286.1antistatic for powders
Imaging
Inverted Light MicroscopeZeiss with CanonAxioObserver Z1 equipped with PowerShot G9Phase contrast, Transmitted light, 20 x objective, RGB filters
Transmission Electron MicroscopeTEM Jeol Co. with Oxford Instruments and SiS-OlympusJEM-1400 TEM equipped with full range INCA Energy Dispersive X-ray microanalysis (EDX) System and 11 Megapixel MORADA G2 cameramagnification 50,000X for TEM and 15,000X for STEM and EDX
Camera body and lensesNikonNikon D7100
Nikkor AF Micro 105 mm f/2.8D
Nikkor AF-S 50 mm f/1.8G
Nikkor AF 28 mm f/2.8D 		for movie recordings
MicrophoneMXL MicsTempofor voice recordings

Referencias

  1. Buckwalter, J. A., Cooper, R. R. Bone structure and function. Instr. Course Lect. 36, 27-28 (1987).
  2. Anderson, H. C. Molecular biology of matrix vesicles. Clin. Orthop. Relat. Res. 314, 266-280 (1995).
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  4. Bolean, M., Simão, A. M. S., Barioni, M. B., Favarin, B. Z., Sebinelli, H. G., Veschi, E. A., Janku, T. A. B., Bottini, M., Hoylaerts, M. F., Itri, R., Millán, J. L., Ciancaglini, P. Biophysical aspects of biomineralization. Biophys Rev. 9 (5), 747-760 (2017).
  5. Bottini, M., Mebarek, S., Anderson, K. L., Strzelecka-Kiliszek, A., Bozycki, L., Simão, A. M. S., Bolean, M., Ciancaglini, P., Bandorowicz Pikula, J., Pikula, S., Magne, D., Volkmann, N., Hanein, D., Millán, J. L., Buchet, R. Matrix vesicles from chondrocytes and osteoblasts: Their biogenesis, properties, functions and biomimetic models. Biochim Biophys Acta. 1862 (3), 532-546 (2018).
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