JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تعرض هذه المقالة بروتوكول بسيط واقتصادي لعزله واضحة وتنقية الخلايا الجذعية الوسيطة من نيوزيلندا الأرنب الأبيض السائل الزليلي.

Abstract

الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) هي مصدر الخلية الرئيسية للعلاج يستند إلى الخلية. يمكن استخدامها لهندسة الأنسجة الغضاريف MSCs من تجويف مفصلي السائل الزليلي. MSCs من السائل الزليلي (SF-MSCs) تم النظر في المرشحين الواعدين للتجدد مفصلي، وعلى الفائدة العلاجية المحتملة قد جعلها موضوعا بحثيا هاما في الآونة الأخيرة. MSCs سادس من تجويف الركبة الأرنب النيوزيلندي الأبيض يمكن أن تستخدم كنموذج متعدية أمثل لتقييم الطب التجديدي البشرية. عن طريق المستندة إلى CD90 المغناطيسي تنشيط الخلية فرز التكنولوجيات (ماك)، هذا البروتوكول بنجاح يحصل على أرنب SF-MSCs (ربسف-MSCs) من هذا الطراز أرنب وكذلك يوضح تماما النمط الظاهري ماجستير من هذه الخلايا باغرائهم للتفريق إلى خلايا الاوستيوبلاستس و adipocytes وتشوندروسيتيس. ولذلك، يمكن تطبيق هذا النهج في بحوث علم الأحياء الخلية وهندسة الأنسجة باستخدام معدات بسيطة وإجراءات.

Introduction

وقد اقترح MSCs كمصدر قيم للطب التجديدي، خاصة بالنسبة للآفات الغضروف. على نطاق واسع أن MSCs، بما في ذلك تشوندروسيتيس وخلايا الاوستيوبلاستس، adipocytes، myocytes الهيكل العظمى والخلايا اللحمية الحشوي، توسيع المجالات لزرع الخلايا الجذعية بسبب بهم التوسع ارتفاع معدل ونسب متعددة التمايز المحتملة1. MSCs يمكن أن تكون معزولة من الهيكل العظمى العضلات والزليلي ونخاع العظام والأنسجة الدهنية2،،من34. أن النتائج التي توصل إليها أيضا confirmed وجود MSCs في السائل الزليلي، وقد حددت البحوث السابقة MSCs المستمدة من السائل الزليلي (SF-MSCs) كمرشحين واعدة للتجدد مفصلي5،6.

ومع ذلك، تخضع البحوث والتجارب الإكلينيكية على العينات البشرية للعديد من القضايا الأخلاقية. بدلاً من ذلك، الأرانب كانت وستظل في الأنواع الحيوانية الأكثر استخداماً لإثبات أن زرع MSCs يمكن إصلاح تلف الغضروف. في السنوات الأخيرة، عددا متزايداً من الباحثين درسوا أرنب الخلايا الجذعية الوسيطة (ربمسكس) على حد سواء في المختبر و في فيفو، كهذه الخلايا هي MSCs مماثلة للبشرية في علم وظائف الأعضاء علم الأحياء والأنسجة الخلوية. وبالمثل، ربمسكس قادرة على التمسك بالأسطح البلاستيكية، عرض مورفولوجيا المغزل تنتجها الخلايا الليفية كما هو الحال في MSCs البشرية. وعلاوة على ذلك، أرنب الوسيطة عينات بسيطة وسهلة للحصول على7. بالإضافة إلى ذلك، النقاط الأكثر أهمية هي أن ربمسكس التعبير عن علامات السطحية، مثل CD44، CD90، و CD105، وأن يتم الاحتفاظ بالتفريق بين النسب المتعددة المحتملة، الذي هو الاتفاق مع المعايير المتعلقة بتحديد هوية السكان MSC حددها "المجتمع الدولي" "العلاج الخلوي"8،9. على وجه الخصوص، تشوندروبروجينيتورس السائل الزليلي قادرون على تشوندروجينيسيس غير الضخامي عند فعل TGF-β1، مما يجعلها مصادر خلية مناسبة لتجديد غضروف مفصلي فينوتيبيكالي10،11، 12.

عزل SF-MSCs غير مختلفة إلى حد كبير من الأنسجة الأخرى، بما في ذلك الحبل السري والأنسجة الدهنية والدم ونخاع العظام. حاليا، هي النهج الأكثر شيوعاً للتنقية وفرز لسادس-MSCs التدفق الخلوي والقائم على حبة الفرز إيمونوماجنيتيك، وعلى الرغم من أن أسلوب التدفق الخلوي يتطلب وجود بيئة محددة وأدوات مكلفة للغاية13.

تعرض هذه المقالة إجراء لجمع عينات سائل الزليلي من نيوزيلندا بسيطة وكسبها أرانب بيضاء. أثناء الإجراء، ربسف-MSCs ستابلي الموسعة في المختبر وعزلها ثم مع CD90 إيجابية المغناطيسي الإجراءات المستندة إلى حبة. وأخيراً، البروتوكول يوضح كيفية الحصول على MSCs بدرجة نقاء عالية والجدوى من المصادر خلية المقطوع.

وتتميز المعزولة ربسف-MSCs في هذا البروتوكول، استناداً على مورفولوجيا، والتعبير عن علامات محددة، وبلوريبوتينسي للخلايا الجذعية. إيمونوفينوتيبينج على أساس قياس التدفق يكشف تعبير إيجابي كبير CD44 و CD105، بينما التعبير عن CD45 و CD34 السلبية. وأخيراً، يوضح تحليل في المختبر ربسف-MSCs التفريق بين أوستيوجينيك وأديبوجينيك وتشوندروجينيك من هذه الخلايا.

Protocol

أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية الإقليمية "لجنة الأخلاقيات"، ووافق جميع الإجراءات الحيوان مستشفى رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة من شنتشن الشعب الثانية، جامعة شنتشن.

1-عزل والثقافة ربسف-MSCs

  1. الأعمال التحضيرية لهذا الإجراء الحيوان
    1. تعد نيوزيلندا الإناث الناضجة سكيليتالي الأرانب البيضاء لجمع ربسف-MSCs-إجراء فحص السريري للأرانب قبل إجراء التخدير وبزل المفصل بيوم واحد.
      ملاحظة: يجب أن تشمل الفحوصات الوزن (2.0 2.5 كجم) والجنس (الإناث)، ودرجة حرارة الجسم ومعدل التنفس ومعدل ضربات القلب. الفواصل الزمنية للمعلمة للأرانب السليمة سريرياً هي 30-50 دقيقة لمعدل التنفس، 220-280 دقيقة لمعدل ضربات القلب، و 38-39 درجة مئوية لدرجة حرارة الجسم.
    2. بسرعة الحيوانات من أجل ح 6 قبل التخدير.
  2. الاستعدادات والإجراءات لتخدير الحيوان
    1. كبح جماح الأرنب مع قفص (انظر الجدول للمواد)، وثم ضخ الصوديوم بينتوباربيتال 3% في الوريد الإذن هامشية بجرعة 1 مل/كغ للتخدير العام.
    2. وضع الأرنب في وضع مريح الظهرية راقد.
    3. رصد معدل التنفس ومعدل ضربات القلب، ودرجة حرارة جسم الأرنب أثناء التخدير.
    4. استخدام مرهم طب العيون في عينية لمنع جفاف أثناء التخدير.
    5. تقييم عمق التخدير عقب جويديل لتصنيف14.
  3. إعداد MSCs عزل وزراعة
    1. زراعة ربسف-MSCs، إعداد 500 مل متوسطة الثقافة التجارية (انظر الجدول للمواد) وتستكمل مع الملحق التجاري 10% (انظر الجدول للمواد)، 10% مصل بقرى الجنين (FBS)، و 1% البنسلين والستربتوميسين.
    2. احتضان المتوسطة الثقافة في 37 درجة مئوية في حمام مائي.
    3. إعداد 500 مل من المحلول الملحي العازلة الفوسفات (PBS) لعزل الخلية والخلية الغسيل.
    4. تحضير 100 مل المحلول الملحي متساوي التوتر لإجراء بزل المفصل تجويف الركبة.
  4. جمع uid fl الزلالي المفصلي من الركبة الأرنب
    1. حدد مساحة حوالي 5 × 5 سم في الحجم حول الركبة وحلق شعر الأرانب من هذه المنطقة باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية سلامة.
    2. بدلاً من ذلك، تطهير الموقع الداخلي 3 x مع اليود البوفيدون الحل و 75% إيثانول. ثم قم بتطبيق الستائر العقيمة بعد المنطقة قد تجفف تماما.
    3. حقن 1-2 مل المحلول الملحي متساوي التوتر، استخدام إبر المحاقن معقمة (2 مل)، في تجويف الركبة المشتركة من الفضاء المفصلي الأفقي، تحريك الركبة x 3-4 ومن ثم تمتص من جميع السائل الزليلي في درجة حرارة الغرفة.
    4. تصفية fluid الزليلي من خلال 40 ميكرومتر نايلون خلية مصفاة إزالة أي بقايا داخل ح 4.
  5. ثقافة ربسف-MSCs
    1. جمع fluid التي تمت تصفيتها في 50 مل أنابيب الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي في 1500 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    2. تجاهل المادة طافية بعد الطرد المركزي وتغسل بيليه مع برنامج تلفزيوني، ريسوسبيند بيليه مع المتوسطة ثقافة كاملة ولوحة ثم المتوسطة في أطباق 100 مم.
    3. احتضان الأطباق في 37 درجة مئوية في جو هوميديفيد التي تحتوي على 5% CO2.
    4. بعد 48 ساعة، تجديد الأطباق مع متوسطة جديدة لإزالة أي من الخلايا غير ملتصقة. استبدال في المتوسط مرتين في أسبوع لمدة أسبوعين كمرور 0 (P0).
      ملاحظة: يجب أن يكون هناك نحو 1 × 104 خلايا ملتصقة. هي خلايا قابلة للحياة/مل في سادس/mL2حوالي 2 × 10.
    5. بعد 14 يوما بعد الطلاء الأولى، ينبغي شكلت العديد من المستعمرات في أطباق الثقافة. حدد المستعمرات أكبر من 2 مم في القطر. مارك حيث توجد مستعمرات المحدد عن طريق تتبع محيط بهم في أسفل الطبق.
    6. تجاهل المستعمرات < 2 مم على نطاق واسع، باستخدام الخلية كاشطات. هضم المستعمرات المحدد مع حوالي 5 ميليلتر من التربسين 0.25%، باستخدام اسطوانة استنساخ، وتحويل المستعمرات إلى طبق جديد كمرور 1 (P1).
  6. رعاية الحيوان بعد العمليات الجراحية
    1. اتبع إجراءات التشغيل المؤسسية القياسية لرصد بعد العمليات الجراحية والتعافي من التخدير.
    2. رصد العلامات الحيوية الأرنب كل 10 دقيقة حتى قد وعيه. وأخيراً، نقل الحيوانات واعية إلى القفص. لا يعود أرنب الذي خضع لجراحة لشركة الحيوانات الأخرى حتى أنه تعافي تماما.
    3. بعد انتهاء العملية، تطهير الموقع مع 0.1% البوفيدون اليود، 2 × يوميا لمدة 3 أيام.

2-CD90--الإيجابية المغناطيسي تنشيط الخلية الفرز (أجهزة ماكينتوش) ربسف-MSCs و "الثقافة الأولية"

  1. إعداد نموذج
    1. عندما تصل إلى الخلايا حول 80% كونفلوينسي، نضح المتوسطة، ثم قم بإضافة 1-2 مل من 0.25% يدتا التربسين لكل طبق.
    2. احتضان الأطباق لمدة 2-3 دقيقة للسماح لمفرزة الخلية.
    3. متى يتم فصل الخلايا، إضافة مبلغ مساو من المتوسط الثقافة إلى إلغاء تنشيط التربسين.
    4. يمر بتعليق خلية مصفاة خلية 40 ميكرومتر، وجمع فيلتراتي في أنبوب 15 مل، وتدور ثم أسفل الخلايا في 600 × ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    5. ريسوسبيند بيليه الخلية في أجهزة ماكينتوش تشغيل المخزن المؤقت (برنامج تلفزيوني، الرقم الهيدروجيني 7.2، ألبومين المصل البقري 0.5%، و 2 مم يدتا) وثم عد عدد الخلايا.
  2. وضع العلامات المغناطيسية
    ملاحظة: فرز ربسف-MSCs مع خلية المغناطيسي المنشط فرز مجموعة التي تحتوي على أعمدة وموقفا، والفواصل (انظر الجدول للمواد).
    1. تحديد عدد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير.
    2. الطرد المركزي من تعليق خلية في 300 × ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. نضح تماما المادة طافية.
    3. إضافة ميليلتر 80 من المخزن المؤقت لاستثارة كل 107 مجموع الخلايا.
    4. 107 مجموع الخلايا، إضافة 20 ميليلتر من ميكروبيدس مترافق مع جسم CD90 المضادة أرنب [مونوكلونل].
    5. مزيج الخرز المغناطيسية والخلايا بالتساوي في الأنابيب، ثم احتضانها لهم عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في الظلام.
    6. إضافة 1 مل من المخزن المؤقت كل 107 الخلايا إلى الأنبوب ومن ثم الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية لغسل الخلايا. تجاهل المادة طافية بعد الطرد المركزي.
    7. ريسوسبيند بيليه في 500 ميليلتر من المخزن المؤقت كل 107 الخلايا.
  3. الفاصل المغناطيسي
    1. أجنحة مكان العمود مع العمود إلى الجبهة في المجال المغناطيسي للفاصل المغناطيسي.
    2. شطف العمود الفاصل المغناطيسي (مللي ثانية) مع 500 ميليلتر من المخزن المؤقت كل 107 الخلايا.
    3. نقل تعليق خلية واحدة في العمود. السماح للخلايا سلبية يمر من خلال المجال المغناطيسي لتجاهل هذه الخلايا غير مسمى.
    4. أغسل العمود العاشر 1-2 مع 500 ميليلتر من المخزن المؤقت كل 107 خلايا وتجاهل في التدفق من خلال.
    5. تحويل العمود إلى أنبوب الطرد مركزي (15 مل).
    6. إضافة 1 مل من المخزن المؤقت كل 107 الخلايا في العمود، ومن ثم دفع المكبس فورا إلى العمود لطرد الخلايا المسماة مغناطيسيا.
    7. كرر الإجراء المذكور أعلاه مع عمود مللي ثانية لزيادة نقاء CD90+ الخلايا التي يمكن أن تثري الكسر التيد.
    8. الطرد المركزي من تعليق خلية في 300 × ز لمدة 10 دقائق، ونضح المادة طافية، وريسوسبيند أنه مع المتوسط الثقافة.
  4. الثقافة CD90+ ربسف-MSCs
    1. تلقيح الخلايا في أطباق 100 ملم بعد الفرز المغناطيسي تنشيط الخلية.
    2. احتضان الأطباق في 37 درجة مئوية في حاضنة خلية هوميديفيد مع 5% CO2.
    3. عندما يتم تحقيق التقاء 80-90% من الثقافة الأولية، في حوالي 7-10 أيام، هضم الخلايا ملتصقة مع 0.25% يدتا التربسين والمرور عليها في إضعاف 1:2 لجعل المرور 2 (P2).
    4. استخدام نفس الأسلوب لتمرير الخلايا لمرور 3 (P3)، التي يمكن أن تستخدم لفحوصات في المختبر .
      ملاحظة: بعد الثقافة الفرعية وتنقية، نحو 1 × 107 ربسف-MSCs يتم الحصول عليها.

3-تحديد ربسف-MSCs

  1. تأكيد علامة السطحية من ربسف-MSCs بالتدفق الخلوي
    1. عندما تكون MSCs روافد 80-90% على P3، تغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني وتعاملهم مع 1 مل من 0.25% يدتا التربسين. ثم احتضان MSCs في 37 درجة مئوية لمدة 2-3 دقيقة حتى يتم فصل الخلايا.
    2. حصاد الخلايا باستخدام 10 مل من برنامج تلفزيوني، وتحويلها إلى أنبوب مخروطي (15 مل)، والطرد المركزي لهم في 300 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    3. تجاهل في سوبيرناتانتس. ريسوسبيند بيليه الخلية في 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني وتحويلها إلى أنبوب 1.5 مل.
    4. احتضان إضعاف 1: 100 من أجسام مترافق FITC ومترافق PE (ايستب، فيتك-CD34/PE-CD45، فيتك-CD105/PE-CD44) ح 1 في الظلام في 4 درجات مئوية.
    5. الطرد المركزي هذا الخليط في 300 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني بالطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق في كل مرة. تجاهل في سوبيرناتانتس.
    6. ريسوسبيند الخلايا في 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني ونقل تعليق خلية في أنبوب أسفل المائدة المستديرة (5 مل) وتحليل استخدام cytometer تدفق.
      ملاحظة: الحصول على بيانات عن سيتوميتير مجهزة بقناتين fluorescence: 533/30 و 585/40. لكل الأسفار ايستب، استخدم عنصر التحكم ايستب لضبط الجهد الليزر المناسبة، وتعيين كثافة الحد الأدنى اللازم للحصول على الرسم بياني الأسفار التي تعرض الحواف اليمنى واليسرى من الذروة. جمع الحد ني أحداث 10,000 للتحليلات الإحصائية.
  2. مولتيديفيرينتييشن ربسف-MSCs
    ملاحظة: استخدام P3 ربسف MSCs لفحوصات مولتيديفيرينتييشن في المختبر .
    1. التفريق أوستيوجينيك
      1. إعداد متوسطة التعريفي osteogenic: دميم الأساسية (س 1) التي تحتوي على 50 مم من الأسكوربيك L حمض-2-الفوسفات و 10 ملم من α-جليسيروفوسفاتي، و 100 نانومتر الديكساميتازون.
      2. بذور الخلايا في الخلايا/سم3 102 في لوحة زراعة الأنسجة 6-جيدا والثقافة لهم في الأجل المتوسط التعريفي أوستيوجينيك.
      3. تغيير وسيلة التعريفي كل 3 أيام لمدة 3 أسابيع.
      4. إصلاح الخلايا مع 4% فورمالدهايد لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بعد الانتهاء من التفرقة، ووصمة عار الخلايا مع 1% الأليزارين الأحمر لمدة 5 دقائق ويغسل ثم 3 منهم x مع برنامج تلفزيوني15.
    2. التفريق أديبوجينيك
      1. إعداد متوسطة التعريفي أديبوجينيك: دميم الأساسية (س 1) يتكون من 100 مم الاندوميتاسين و 10 ملغ/مل للأنسولين البشري المؤتلف 1 مم من الديكساميتازون 0.5 مم من 3-إيسوبوتيل-1-زانتين.
      2. علاج P3 ربسف-MSCs لمدة 3 أسابيع في المتوسط التعريفي أديبوجينيك.
      3. بعد 3 أسابيع، وصمة عار vacuoles الدهن محايدة استخدام "النفط الأحمر يا" لتأكيد التمايز أديبوجينيك. إصلاح الخلايا في حل فورمالدهايد 4% لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ومن ثم غسلها x 3 مع برنامج تلفزيوني16.
    3. التفريق تشوندروجينيك
      1. إعداد متوسطة التعريفي تشوندروجينيك: دميم الأساسية (س 1) تتكون من 10 نانوغرام/مل من TGFβ1، 1% في الملحق، 0.35 ملم للأم-برولين، 100 نانومتر الديكساميتازون، 50 مم الأسكوربيك L حمض-2-الفوسفات، و 1 مم من بيروفات صوديوم.
      2. استخدام بيليه استزراع لتحريض تشوندروجينيك. الطرد المركزي 5 × 105 P3 ربسف MSCs-1500 لفة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة في أنبوب البولي بروبلين (15 مل) لتشكيل بيليه.
      3. ثقافة الكريات لمدة 3 أسابيع مع المتوسطة التعريفي تشوندروجينيك.
      4. تغيير كل 3 أيام لمدة 3 أسابيع في المتوسط.
      5. بعد 3 أسابيع التعريفي، تضمين بيليه الخلية مع البارافين والفرع هو إلى شرائح 4 مم، ووصمة عار عليها باستخدام 0.1% أزرق تولويدين لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة17.
  3. مجموع استخراج الحمض النووي الريبي والتحليل الكمي في الوقت الحقيقي تفاعل البوليميراز المتسلسل (قرة-PCR)
    1. عزل الجيش الملكي النيبالي مجموع الخلايا بعد التمايز التعريفي 3 أسابيع باستخدام استخراج الحمض النووي الريبي التجاري كيت (انظر الجدول للمواد).
      1. إزالة المتوسطة الثقافة في الطبق الثقافة ثم قم بإضافة 1 مل كاشف العزلة.
      2. الخلايا من بيبيتينج المتكررة حتى يتم الحل متجانسة. تبني عليه في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق.
      3. نقل الخلية ليساتي في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل.
      4. إضافة 100 ميليلتر من كلوروفورم واهتز باليد 15 س، واحتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق.
      5. الطرد المركزي الأنبوب في ز × 12,000 لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. نقل سوبيرناتانتس في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل جديدة.
      6. إضافة 500 ميليلتر من الايزوبروبانول ويعجل بالجيش الملكي النيبالي لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      7. أجهزة الطرد المركزي في 12,000 × ز لابتداء 10 4 درجات مئوية. بيليه الجيش النيبالي الملكي يجب أن تكون مرئية في الجزء السفلي من الأنبوب.
      8. إزالة المادة طافية، ثم قم بإضافة 500 ميليلتر من الإيثانول 75%. باختصار تدور أنبوب لعدة ثوان ليغسل بيليه الجيش الملكي النيبالي. الطرد المركزي أنه في 7,500 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
      9. إزالة الإيثانول المتبقية.
      10. حل بيليه الجيش الملكي النيبالي في 10 ميليلتر من الماء ديبك ووضع الأنابيب على الجليد.
    2. عكس نسخ مجموع الجيش الملكي النيبالي في كدنا مع توليف الحمض النووي كيت (انظر الجدول للمواد).
      ملاحظة: تنفيذ كافة الإجراءات التالية على الجليد.
      1. إعداد مزيج الرئيسي النسخ العكسي.
      2. إضافة 25 ميليلتر من الجيش الملكي النيبالي الدناز يعامل كل أنبوبة مع 1 ميكروغرام من الجيش الملكي النيبالي.
      3. احتضان الخليط عند درجات الحرارة التالية استخدام بكر cycler حرارية: 26 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة (للسماح هيكساميرس عشوائي يصلب)، 42 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة (النسخ العكسي) و 75 درجة مئوية لمدة 10 دقائق (لإلغاء تنشيط المنتسخة العكسية).
      4. فورا تحليل كدنا الناتجة عن طريق PCR الكمي في الوقت الحقيقي، أو تخزينها في-20 درجة مئوية.
    3. إجراء تحليل التعبير الجيني مع نظام PCR كمي في الوقت الحقيقي.
      1. استخدام مزيج سيد بكر qRT (انظر الجدول للمواد) لإجراء PCR. الإشعال PCR جابده، Runx2، Agg، PPARγ، وترد في الجدول 1.
      2. حساب التعبير الجيني باستخدام الأسلوب 2−ΔΔCT .
      3. إجراء تحليل إحصائي باستخدام البرامج الإحصائية القياسية. استخدام يعني عينة مستقلة اختبار t لمقارنة المجموعة.

النتائج

عزل وتنقية وثقافة ربسف-MSCs:
هذا البروتوكول يستخدم أجهزة ماكينتوش لعزل ربسف-MSCs، استناداً إلى التعبير عن علامة السطحية ماجستير CD90. ويرد في الشكل 1مخطط تدفق عملية ربسف-MSCs عزل وتنقية، وتوصيف والبروتوكول الثقافة في المختبر .

Discussion

يوفر وجود MSCs في السائل الزليلي بديل للعلاج يستند إلى الخلية. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن إصابة مواقع تحتوي على كميات أعلى من الخلايا الجذعية الوسيطة في بهم السائل الزليلي، الذي قد يكون ارتباطاً إيجابيا مع فترة ما بعد إصابة5. قد يكون من المفيد للأنسجة لتعزيز شفاء عفوية بعد إص...

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgements

هذه الدراسة كانت تدعمها ماليا المنح التالية: "مؤسسة العلوم الطبيعية الصينية" (رقم 81572198؛ رقم 81772394)؛ الصندوق لبناء ارتفاع مستوى الانضباط الطبية من جامعة شنتشن (رقم 2016031638)؛ مؤسسة البحوث الطبية في مقاطعة قوانغدونغ، الصين (رقم A2016314)؛ شنتشن العلوم والتكنولوجيا المشاريع (رقم JCYJ20170306092215436؛ لا. JCYJ20170412150609690؛ لا. JCYJ20170413161800287؛ لا. SGLH20161209105517753؛ لا. JCYJ20160301111338144).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
MesenGroStemRDMGro-500 1703Warm in 37 °C water bath before use
MesenGro SupplementStemRDMGro-500 M1512Component of MSCs culture medium
DMEM basicGibco Inc.C11995500BTMSCs differentiation medium
Isotonic saline solutionLitai, China5217080305Cavity arthrocentesis procedure reagent
Phosphate-Buffered Saline (PBS)HyClone Inc.SH30256.01BPBS, free of Ca2+/Mg2+
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco Inc.10099-141Component of MSCs culture medium
Povidone iodine solutionGuangdong, China150605Sterilization agent
75% ethanolLircon, china170917Sterilization agent
0.25% Trypsin/EDTAGibco Inc.25200-056Cell dissociation reagent
1% Penicillin-StreptomycinGibco Inc.15140-122Component of MSCs medium
MACS Running BufferMiltenyiBiotec5160112089Containing phosphate-buffered saline (PBS), 0.5% bovine serum albumin(BSA), and 2 mMEDTA
CD90 antibody conjugated MicroBeadsMiltenyiBiotec5160801456For magnetic activated cell sorting
Sodium pyruvateSigma-AldrichP2256Component of MSCs chondrogenic differentiation
DexamethasoneSigma-AldrichD1756Component of MSCs osteogenic differentiation
ITSBD3543521%, Component of MSCs chondrogenic differentiation
L-prolineSigma-AldrichP56070.35 mM, Component of MSCs chondrogenic differentiation
L-ascorbic acid-2-phosphateSigma-AldrichA896050 mM, Component of MSCs chondrogenic differentiation
3-isobutyl-1-methylxanthineSigma-AldrichI58790.5 mM, Component of adipogenic differentiation
IndomethacinSigma-AldrichI7378100 mM, Component of adipogenic differentiation
TGFβ1Peprotech100-2110 ng/mL, Component of MSCs chondrogenic differentiation
α-glycerophsphateSigma-AldrichG6751Component of MSCs osteogenic differentiation
CD34 Polyclonal Antibody, FITC ConjugatedBiossbs-0646R-FITCHematopoietic stem cells marker
Mouse antirabbit CD44Bio-RadMCA806GAThy-1 membrane glycoprotein (MSCs marker)
CD45 (Monoclonal Antibody)Bio-RadMCA808GAHematopoietic stem cells marker
CD105 antibodyGenetexGTX11415MSCs marker
Isopropyl alcoholSigma-AldrichI9030Precipitates RNA extraction organic phases
TrichloromethaneWenge, China61553Extract total RNA
TrizolInvitrogen15596-018Isolate total RNA
SYBR green master mixTakara Bio, JapanRR420APCR test
cDNA synthesis kitTakara Bio, JapanRR047AReverse-transcribed to complementary DNA
Alizarin RedSigma-AldrichA5533Staining of calcium compounds
Toluidine BlueSigma-Aldrich89640Staining of cartilaginous tissue
Oil Red O solutionSigma-AldrichO1391LLipid vacuole staining
Equipment
MiniMACS SeparatorMiltenyiBiotec130-042-102For magnetic activated cell sorting
MultiStandMiltenyiBiotec130-042-303For magnetic activated cell sorting
MS ColumnsMiltenyiBiotec130-042-201For magnetic activated cell sorting
Cell StrainerFALCON Inc.35234040 μm nylon
HemocytometerISOLAB Inc.075.03.001Cell counting
Falcon 100 mm dishCorning353003Cell culture dish
Microcentrifuge tubeAxygenMCT-150-CRNA Extraction and PCR
Centrifuge TubesSigma-Aldrich91050Gamma-sterilized
High-speed centrifugeEppendorf5804RCentrifuge cells
Carbon dioxide cell incubatorThermo scientific3111Cell culture
Real-Time PCR InstrumentLife TechQuantStudioReal-Time quantitative polymerase chain reaction
Flow cytometerBD Biosciences342975Cell analyzer
PipettorEppendorfO25456FTransfer the liquid
Cloning cylinderSigma-AldrichC3983-50EAIsolate and pick individual cell colonies
Sterile hypodermic syringeDouble-Dove, China131010Arthrocentesis procedure
Rabbit cageZhike, ChinaZC-TGDRestrain the rabbit

References

  1. Oreffo, R. O., Cooper, C., Mason, C., Clements, M. Mesenchymal stem cells: lineage, plasticity, and skeletal therapeutic potential. Stem Cell Reviews. 1 (2), 169-178 (2005).
  2. Asakura, A., Rudnicki, M. A., Komaki, M. Muscle satellite cells are multipotential stem cells that exhibit myogenic, osteogenic, and adipogenic differentiation. Differentiation. 68 (4-5), 245-253 (2001).
  3. De, B. C., Dell'Accio, F., Tylzanowski, P., Luyten, F. P. Multipotent mesenchymal stem cells from adult human synovial membrane. Arthritis Rheumatology. 44 (8), 1928-1942 (2001).
  4. Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular Biology of the Cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).
  5. McGonagle, D., Jones, E., English, A., Emery, P. Enumeration and phenotypic characterization of synovial fluid multipotential mesenchymal progenitor cells in inflammatory and degenerative arthritis. Arthritis & Rheumatism. 50 (3), 817-827 (2004).
  6. Jia, Z., et al. Isolation and characterisation of human mesenchymal stem cells derived from synovial fluid by magnetic activated cell sorting (MACS). Cell Biology International. , (2017).
  7. Bashir, M., et al. Isolation, culture and characterization of New Zealand white rabbit mesenchymal stem cells derived from bone marrow. Asian Journal of Animal & Veterinary Advances. 10 (8), 13-30 (2015).
  8. Song, X., et al. Differentiation potential of rabbit CD90-positive cells sorted from adipose-derived stem cells in vitro. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 53 (1), 1-6 (2016).
  9. Lee, T. C., et al. Comparison of surface markers between human and rabbit mesenchymal stem cells. PLOS One. 9 (11), e111390 (2014).
  10. Stewart, M. C., Chen, Y., Bianchessi, M., Pondenis, H. Phenotypic characterization of equine synovial fluid-derived chondroprogenitor cells. Stem Cell Biology and Research. 3 (1), (2016).
  11. Prado, A. A. F., et al. Characterization of mesenchymal stem cells derived from the equine synovial fluid and membrane. BioMed Central Veterinary Research. 11 (1), 281 (2015).
  12. Yoshimura, H., et al. Comparison of rat mesenchymal stem cells derived from bone marrow, synovium, periosteum, adipose tissue, and muscle. Cell and Tissue Research. 327 (3), 449-462 (2007).
  13. Wu, C. C., et al. Intra-articular injection of platelet-rich fibrin releasates in combination with bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the treatment of articular cartilage defects: an in vivo study in rabbits. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 105 (6), 1536-1543 (2017).
  14. John, T., Lerche, P. . Anesthesia and Analgesia for Veterinary Technicians. , (2011).
  15. Koyama, N., et al. Pluripotency of mesenchymal cells derived from synovial fluid in patients with temporomandibular joint disorder. Life Sciences. 89 (19-20), 741-747 (2011).
  16. Kim, Y. S., et al. Isolation and characterization of human mesenchymal stem cells derived from synovial fluid in patients with osteochondral lesion of the talus. American Journal of Sports Medicine. 43 (2), 399-406 (2015).
  17. Vereb, Z., et al. Immunological properties of synovial fluid-derived mesenchymal stem cell-like cells in rheumatoid arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 74 (Suppl 1), A64-A65 (2015).
  18. Matsukura, Y., Muneta, T., Tsuji, K., Koga, H., Sekija, I. Mesenchymal stem cells in synovial fluid increase after meniscus injury. Clinical Orthopaedics & Related Research. 472 (5), 1357-1364 (2014).
  19. Morito, T., et al. Synovial fluid-derived mesenchymal stem cells increase after intra-articular ligament injury in humans. Rheumatology. 47 (8), 1137-1143 (2008).
  20. Hegewald, A. A., et al. Hyaluronic acid and autologous synovial fluid induce chondrogenic differentiation of equine mesenchymal stem cells: a preliminary study. Tissue & Cell. 36 (6), 431-438 (2004).
  21. Jones, E. A., et al. Synovial fluid mesenchymal stem cells in health and early osteoarthritis: detection and functional evaluation at the single cell level. Arthritis & Rheumatism. 58 (6), 1731-1740 (2008).
  22. Makker, K., Agarwal, A., Sharma, R. K. Magnetic activated cell sorting (MACS): utility in assisted reproduction. Indian Journal of Experimental Biology. 46 (7), 491-497 (2008).
  23. Schmitz, B., et al. Magnetic activated cell sorting (MACS) — a new immunomagnetic method for megakaryocytic cell isolation: comparison of different separation techniques. European Journal of Haematology. 52 (5), 267-275 (1994).
  24. Reinhardt, M., Bader, A., Giri, S. Devices for stem cell isolation and delivery: current need for drug discovery and cell therapy. Expert Review of Medical Devices. 12 (3), 353-364 (2015).
  25. Gronthos, S., Zannettino, A. C. W., Prockop, D. J., Bunnell, B. A., Phinney, D. G. A method to isolate and purify human bone marrow stromal stem cells. Mesenchymal Stem Cells. , 45-57 (2008).
  26. Krawetz, R. J., et al. Synovial fluid progenitors expressing CD90+ from normal but not osteoarthritic joints undergo chondrogenic differentiation without micro-mass culture. PLOS One. 7 (8), e43616 (2012).
  27. Ogata, Y., et al. Purified human synovium mesenchymal stem cells as a good resource for cartilage regeneration. PLOS One. 10 (6), e0129096 (2015).
  28. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells: the International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  29. Gauci, S. J., et al. Modulating chondrocyte hypertrophy in growth plate and osteoarthritic cartilage. Journal of Musculoskeletal & Neuronal Interact. 8 (4), 308 (2008).
  30. Cooke, M. E., et al. Structured three-dimensional co-culture of mesenchymal stem cells with chondrocytes promotes chondrogenic differentiation without hypertrophy. Osteoarthritis and Cartilage. 19 (10), 1210-1218 (2011).
  31. Fischer, J., Dickhut, A., Rickert, M., Richter, W. Human articular chondrocytes secrete parathyroid hormone-related protein and inhibit hypertrophy of mesenchymal stem cells in coculture during chondrogenesis. Arthritis and Rheumatism. 62 (9), 2696-2706 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

138 uid CD90

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved